专利名称：刺五加苷分化间充质干细胞成少突胶质前体细胞及试剂盒的研制、用于神经系统疾病的药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种刺五加苷处理人间充质干细胞得到少突胶质前体细胞 (Oligodendrocyte Progenitor cells,0PC)及其增殖的分化培养基，及其试剂盒研制的方法，以及包括前述方法获得的前体细胞的用于治疗创伤性脊髓损伤与多发性硬化症等疾病的药物组合物。更具体地，本发明涉及一种刺五加苷处理人间充质干细胞得到少突胶质前体细胞及其增殖的分化培养基，使用该培养基选择性的获得少突胶质前体细胞的方法，以及包括前述方法获得的少突胶质前体细胞的用于治疗创伤性脊髓损伤与多发性硬化症等疾病的药物组合物。
背景技术：
少突胶质细胞是中枢神经系统内的一种大胶质细胞。少突胶质细胞是中枢神经系统内唯一的髓鞘生成细胞，同时还分泌多种神经营养因子维持少突胶质细胞与其他神经细胞之间相互的正常生理作用。主要功能是产生髓鞘包绕神经轴突，维持神经冲动沿轴突跳跃性传导。髓鞘(myelin)由成熟少突胶质细胞延伸的胞质膜构成。脊髓损伤造成少突胶质细胞死亡，是轴突脱髓鞘改变的直接原因。多发性硬化症是中枢神经系统慢性炎症性脱髓鞘病，脱髓鞘过程中少突胶质细胞的广泛丢失，原发性少突胶质细胞损伤并导致继发性脱髓鞘。目前用于神经系统疾病治疗的干细胞包括人间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC)，它们体外向神经细胞分化，国外研究较多使用2-硫基乙醇、二甲亚砜、硫代甘油等作为诱导剂，但这些化学制剂均有一定毒性。其不能应用于人体内，使得到的细胞在制备成药物组合物时安全性差。例如，CN200480019375. 7公开的由包括人在内的哺乳动物的海马、小脑、脊髓等组织中分离培养获得少突胶质祖细胞，通过睫状神经细胞营养因子和3，3’，5’ -三碘甲腺原氨酸可获得分化的少突胶质细胞，其伦理学问题可能限制了其的应用。CN200710195844. 6公开了人骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞分化的方法，采用黏附分子F3/Contactin诱导分化，其诱导分化成本可能昂贵，得到少突胶质细胞已终端分化，不具有干细胞潜能性。综上，亟需一种操作简单、成本低、分化纯度高、增殖性质稳定的安全的获得少突胶质前体细胞的方法。
发明内容
本发明的目的是克服现有的诱导分化人间充质干细胞成少突胶质细胞的方法操作繁复、成本高，分化得到的少突胶质细胞纯度低，并且在分离和扩增过程使用的诱导剂中含有对人体有害的药物，使诱导分化得到的少突胶质细胞在制备成药物组合物时安全性差的缺点，提供一种诱导分化人间充质干细胞成少突胶质细胞的分化培养基，使用该培养基的分离和扩增少突胶质细胞的方法操作简单、成本低、分化纯度高、性质稳定。利用经临床验证的传统中药作为诱导分化剂具有价廉、安全的优点，可望成为今后临床神经细胞移植安全有效的诱导分化剂。已经证实一些中药如丹参注射液、天麻、黄芩苷等，具有在体外诱导MSC向神经样细胞分化的作用，主要为神经元样细胞。本发明提供了一种刺五加苷处理人间充质干细胞得到少突胶质前体细胞及其增殖的分化培养基，所述分化培养基包括液体基础培养基，其中，以所述液体基础培养基的体积为基准，所述分化培养基还含有l-500ug/mL的刺五加苷、1-20体积％的胎牛血清、 5-300ng/mL人表皮生长因子(EGF)和5_300ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。本发明还提供了一种刺五加苷处理人间充质干细胞得到少突胶质前体细胞及其增殖的试剂盒研制的方法，其中，所述的试剂盒包括1)间充质干细胞基础培养基；2)刺五加苷；3)细胞因子(人表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子)；4)消化细胞的酶以及；5)使用说明书；本发明还提供了一种用于治疗创伤性脊髓损伤与多发性硬化症等疾病的药物组合物，其中，所述药物组合物包括本发明所述从人间充质干细胞分化方法获得的少突胶质前体细胞，以及和药学上可接受的载体或赋形剂。使用本发明的分化培养基的本发明的从人间充质干细胞分化获得的少突胶质前体细胞及其增殖的方法，能够高效分化和大量获得少突胶质前体细胞。由于本发明的分化培养基选择性强，获得少突胶质前体细胞纯度即可达到70%以上。因此，本发明的方法无需使用营养因子或化学诱导剂等高成本安全性差的药物就能达到更高纯度的分离效果，避免了繁复的操作，因而降低了成本，并且由该方法得到的少突胶质前体细胞的安全性大大提高，可以制备成本发明用于治疗创伤性脊髓损伤与多发性硬化症等疾病的药物组合物。本发明用于治疗创伤性脊髓损伤与多发性硬化症等疾病的药物组合物不仅安全性好，而且能在体内修复创伤性脊髓损伤与多发性硬化症等疾病中广泛丢失或损伤的少突胶质细胞，并有轴突髓鞘质的形成。
图1为实施例1骨髓间充质干细胞分化成少突胶质细胞的生长形态照片(光学显微镜放大倍数40倍)；图2为实施例1和3的少突胶质前体细胞表达蛋白的荧光免疫照片(荧光显微镜放大倍数40倍)，其中，图2A为鼠抗人04 IgM标记后二抗显色荧光免疫照片，图2B为鼠抗人A2B5 IgM标记后二抗显色荧光免疫照片，图2C为图2A和图2B叠加得到的荧光免疫照片；图3为使用实施例2和3少突胶质前体细胞移植治疗创伤性脊髓损伤大鼠模型， 移植后随着时间变化进行脊髓损伤BBB (Basso，Beatlie, Bresnahan)功能评分曲线；图4为使用实施例2和3少突胶质前体细胞药物组合物对创伤性脊髓损伤大鼠模型治疗前后效果对比的显微结构照片(光学显微镜放大倍数400倍)。
具体实施例方式本发明提供了一种刺五加苷处理人间充质干细胞得到少突胶质前体细胞及其增殖的分化培养基，所述分化培养基包括液体基础培养基，其中，以所述液体基础培养基的体积为基准，所述分化培养基还含有l-500ug/mL的刺五加苷、1-20体积％的胎牛血清、 5-300ng/mL人表皮生长因子(EGF)和5_300ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。优选地，以所述液体基础培养基的体积为基准，所述分化培养基还含有5_300ug/ mL的刺五加苷、5-15体积％的胎牛血清、10-200ng/mL人表皮生长因子(EGF)和10-200ng/ mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。进一步优选地，以所述液体基础培养基的体积为基准，所述分化培养基还含有10-200ug/mL的刺五加苷、5_10体积％的胎牛血清、IO-IOOng/ mL人表皮生长因子(EGF)和lO-lOOng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。本发明的人间充质于细胞分化为少突胶质前体细胞及其增殖的分化培养基可以包括本领域常用的各种基本培养基，例如，选自BME细胞培养基、杜尔贝可改良伊格尔 (Dulbecco' s modified Eagle' s medium, DMEM)细胞培养基、DMEM/F12 细胞培养基、 Fischer' s细胞培养基、IMDM细胞培养基、199细胞培养基、MEM细胞培养基、FlO细胞培养基、F12细胞培养基和1640细胞培养基中的一种或几种。优选包括的所述基本培养基为 MEM细胞培养基。所述基本培养基的成分为本领域公知，上述列举的基本培养基名称为它们的商品名，商业上可供。本发明提供的人间充质干细胞可以适用于各种含有间充质干细胞的离体组织，例如骨髓、脐带血、脐带、流产胚胎(例如流产的12-14周的胚胎)和流产胎儿等。但考虑到可能有悖于伦理道德、社会风俗习惯甚至法律规定，因此一般不利用流产胚胎和流产胎儿， 并且胚胎和流产胎儿的来源有限。优选所述离体组织选自骨髓、脐带血和脐带中的一种或几种。其中，骨髓和脐带血可以来自公共脐带血库(例如，北京脐带血库等)和骨髓库(例如，中华骨髓库等)。从来源丰富程度考虑，优选所述离体组织是脐带，其一般作为医疗废弃物被处理掉。此外，创伤性脊髓损伤与多发性硬化症患者的骨髓可以作为自体间充质干细胞的来源，可以避免免疫排斥反应。本发明所述的用于分化为少突胶质前体细胞的人间充质干细胞出于安全的保守考虑，优选使用传代代数为第1代到第10代的间充质干细胞，其中，传代代数第1代到第4 代的间充质干细胞可以作为种子间充质干细胞使用。出于间充质干细胞数量和稳定性的考虑，优选传代代数为第4代的间充质干细胞作为种子间充质干细胞使用。所述种子干细胞可以作为大规模培养的起始细胞，也可以采用本领域常规的冷冻保存细胞的技术将其作为细胞株长期冷冻保存起来，以备复苏使用。传代代数第5代到第10代间充质干细胞可以作为中间品间充质干细胞使用。所述中间品干细胞是指大规模培养后得到的间充质干细胞，可以用作制备本发明分化为少突胶质前体细胞或药物组合物的原料。此外，为了便于运输和保存，所述少突胶质前体细胞也可以进行冷冻保存，在临近使用前复苏即可。本发明还提供了一种用于治疗创伤性脊髓损伤与多发性硬化症等疾病的药物组合物，其中，所述药物组合物包括本发明所述从人间充值干细胞分化方法获得的少突胶质前体细胞，以及和药学上可接受的载体或赋形剂。所述药学上可接受的载体或赋形剂指无毒固态、半固态或液态填充剂、稀释剂、包囊材料或其他制剂辅料，例如，包括但不限于盐水、缓冲盐液、水、甘油、乙醇及其混合物。所述药物组合物适于静脉内、腰穿、椎管、介入、肌内、皮下、皮内注射和输注等给药。适于给药的药物组合物包括无菌水浴液或非水溶液、分散液、悬浮液或乳液，以及用于在临近使用前在无菌可注射溶液或分散液中配制的粉末。适宜的水性或非水性载体、 稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、甘泊、丙二醇、聚乙二醇、竣甲基纤维素、植物油和可注射的有机酶如泊酸乙醋。这些组合物还可以含有防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂等佐剂。加入等渗剂如糖类、氯化钠等可能是有利的。优选所述药物组合物为注射液，所述注射液包括药学上可接受的载体，以及以所述注射液体积为基准，1 X IO5至1 X IO8个/毫升的本发明所述的方法获得的少突胶质前体细胞。优选所述注射液包括以所述注射液体积为基准，5X105至IXlO7个/毫升的本发明所述的方法获得的少突胶质前体细胞。优选所述药学上可接受的载体为生理盐水。这里所述的生理盐水，是指生理学实验或临床上常用的渗透压与动物或人体血浆的渗透压相等的溶液。优选地，用于哺乳类动物和人体时是0.85-0. 9%的氯化钠溶液。更优选0.9%的氯化钠溶液。本发明的发明人意外地发现，少突胶质前体细胞可以对少突胶质细胞丢失或损伤进行修复，并且能够有效作用于轴突髓鞘质的形成(参见实施例5)。因此本发明的药物组合物用于治疗创伤性脊髓损伤与多发性硬化症等疾病。使用由本发明的方法获得的少突胶质前体细胞，处于本发明的分化培养基中，因此在制备用于治疗创伤性脊髓损伤与多发性硬化症等疾病的药物组合物之前，可以通过除去本发明的分化培养基，用生理盐水洗涤并重悬所述少突胶质前体细胞。所述生理盐水的洗涤次数可以通过测定洗出液中残留的培养基组分来决定。将本发明的用于治疗创伤性脊髓损伤与多发性硬化症等疾病的药物组合物在注射给患者时残留的培养基组分不会引起患者不适即可。所述组合物包括1 X IO5到1 X IO8个/mL本发明的新的少突胶质前体细胞； 优选为5X105到IXlO7个/mL。本发明还提供了本发明的方法获得的少突胶质前体细胞， 在制备治疗创伤性脊髓损伤与多发性硬化症等疾病药物中的应用。本发明还提供了一种治疗创伤性脊髓损伤与多发性硬化症等疾病的方法，其包括给患者施用本发明用于治疗创伤性脊髓损伤与多发性硬化症等疾病的药物组合物。施用本发明用于治疗创伤性脊髓损伤与多发性硬化症等疾病的药物组合物的方式可以选自介入注射、静脉注射、腰穿、皮下注射和皮内注射中的一种或几种；更优选所述施用的方式为腰穿。本发明所述用于治疗多发性硬化症与创伤性脊髓损伤等疾病的药物组合物优选含有1 X IO5到1 X IO8细胞/mL的少突胶质前体细胞，其每次注射给药量为 0. lmL-5mL/个体；更优选地，本发明所述用于治疗创伤性脊髓损伤与多发性硬化症等疾病的药物组合物包括IXlO5到5 X107f/mL的少突胶质前体细胞，其每次注射给药量为 0. lmL-2mL/ 个体。以上个给出了本发明所述用于治疗创伤性脊髓损伤与多发性硬化症等疾病的药物组合物每一次注射的剂量，一个疗程三次注射，每两次注射间隔一周。本发明所述用于治疗多发性硬化症与创伤性脊髓损伤等疾病的药物组合物一般在注射完第二次后的第三天到第七天起效。所述有效的标准是脊髓损伤BBB功能评分明显提高，可以促使有髓鞘的轴突生成。一个疗程结束后，可以马上连续进行第二个疗程的治疗，也可以间隔一到三个月后进行第二个疗程的治疗以巩固疗效，一般治疗两个至四个疗程可以消除脊髓损伤病症；间隔时间为六个月或一年，患者如认为有必要，还可进行巩固疗效的治疗。优选使用本发明的方法来分离创伤性脊髓损伤与多发性硬化症等疾病患者的离体组织(例如骨髓)，所得少突胶质前体细胞制备成本发明的药物组合物给药创伤性脊髓损伤与多发性硬化症等疾病患者自体，这样可以最大限度地避免免疫排斥反应造成的副作用。以下，对本发明的具体实施例进行说明，但本发明的技术范围不限于这些示例。实施例1 本实施例用于说明使用本发明的分化培养基从人骨髓间充质干细胞分化为少突胶质前体细胞的方法。人骨髓来自31岁捐献者的，与该捐献者及医院方签署了知情同意书。将人骨髓用IXPBS等体积稀释，得到人骨髓稀释液，以人骨髓稀释液1.077千克/立方米的聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)的体积比为2 1加入到50ml离心管中，在1500rpm、25度下进行密度梯度离心10分钟，离心后收集中间层细胞，并使用IXPBS IOOOrpm离心10分钟，洗涤所得细胞三次，加入完全培养基，含10%胎牛血清(美国Hyclone公司)的α-MEM 培养基(美国Gibco公司)。细胞计数后，按3 X IO5细胞/cm2的密度接种于75cm2的培养瓶中，每瓶再加入上述培养基使终体积为10ml。在37°C、5% CO2的培养箱中培养第三天后，半量换液。换液时将旧培养基缓慢吸出5ml，加入新鲜的间充质干细胞培养基，每瓶加入5ml， 继续在37°C、5% CO2培养。当细胞贴壁生长达到培养瓶底面的85%时，将培养基倾去，并将细胞通过用胰酶消化，SOOrpm离心5分钟收集后在含10%胎牛血清的α -MEM培养基中传代培养。同样当细胞贴壁生长达到培养瓶底面的85%时，进行消化传代培养。1瓶原代培养物可以传代三瓶，每瓶起始培养的细胞密度为2 X IO5细胞/mL。三瓶75cm2培养瓶在37°C、 5% CO2培养箱中培养6天后，得到贴壁并且生长达到培养瓶底面的90%的细胞。获得的间充质干细胞取1瓶进行流式细胞检测，经胰酶消化，离心后细胞沉淀用ImL IXPBS重悬，计数。取3份20 μ L (1 X IO6个)上述的传代得到细胞悬液分别添加到有20 μ L FITC-⑶34 (BD 公司)禾口 20 μ L PE-CD90 (BD 公司)；20 μ L FITC-CD45 (BD 公司)禾口 20 μ L PE-CD44 (BD 公司)；20μ LFITC-HLA-DR(BD公司)禾口 20 μ L PE_CD105(BD公司)的离心管中。置于4°C冰箱染色30分钟，然后用ImL的IX磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤三次，最后用0. 5mL的IXPBS 重悬洗涤后的细胞，所得洗涤后的细胞用FACSCalibur基本型流式细胞仪检测。结果显示，CD44 > 95. 56%,CD90 > 98. 60%, CD105 > 91. 3%,CD34 < 3. 45%, CD45 < 2. 10%, HLA-DR < 1. 33%，符合间充质干细胞表型特征。取上述培养好的间充质干细胞，倾去培养基，每瓶加入50ug/mL刺五加苷、10%胎牛血清、20ng/mL人表皮生长因子(EGF)和20ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(美国 R&D公司)的α -MEM培养基IOml进行分化培养(分化培养基)，48小时后半量换液，换液时将旧培养基缓慢吸出5ml，加入新鲜的分化培养基，每瓶加入5ml，继续在37°C、5 % CO2培养。第五天间充质干细胞形态发生变化，并进行半量换液，继续培养到第7天间充质基本分化为少突胶质前体细胞。取其中一瓶细胞，弃去培养基，按前述条件经胰酶消化，SOOrpm离心5分钟后，收集细胞沉淀用ImL 1XPBS(PH 7. 4的磷酸缓冲液)重悬，计数。取6份50yL(每份含IX IO6个细胞)上述的传代得到细胞悬液分别接种在六孔培养板的六个孔中贴壁生长4小时，吸出培养基后用1 XPBS洗涤一次，加入2 %甲醛固定3分钟，用0. 5 %曲通 100 (Triton-100) IXPBS洗涤三次，再向六孔板的六个孔中分别加入1 XPBS以及用1 XPBS 稀释的鼠抗人04IgM、1 X PBS稀释的鼠抗人A2B5IgM和1 X PBS稀释的鼠抗人髓鞘碱性蛋白 IgG。在4度冰箱过夜进行染色/结合，之后用0.5% Triton-1001 XPBS洗涤3次，向鼠抗人髓鞘碱性蛋白IgG的孔中加入用IXPBS稀释的二抗IgG-FITC，并向鼠抗人04IgM和鼠抗人A2B5IgM的孔中分别加入用IXPBS稀释的二抗IgM-PE和二抗IgM-FITC，在37度下孵育lh，孵育后用IXPBS轻轻洗涤3次，洗涤完之后用90%甘油封闭。荧光显微镜下观测， 结果显示，70%以上的细胞呈现A2B5和04为阳性，髓鞘碱性蛋白为阴性，符合少突胶质前体细胞的特异性特征，因而证明使用本发明的分化培养基从人骨髓间充质干细胞能分化出高纯度的少突胶质前体细胞。实施例2 本实施例用于说明使用本发明的分化培养基从脐带来源间充质干细胞分化为少突胶质前体细胞的方法。脐带来自沈岁健康孕妇分娩后采集的脐带。与该孕妇及医院方签署了知情同意书，在其分娩后收集其脐带。将离体组织脐带用含2%双抗(青霉素和链霉素)的IXPBS洗涤三次，后用眼科剪剪碎成为约Imm3的小块。所得剪碎的组织小块用0. 25%胰酶溶液以1克0. 5mL的重量体积比消化5分钟后，加入是胰酶溶液体积五分之一的胎牛血清终止消化，以IOOOrpm离心5分钟收集消化好的组织小块，倾去胰酶溶液上清，然后所得剪碎的组织小块用含双抗的α -MEM培养基洗涤三次，以IOOOrpm离心5分钟收集洗涤好的组织小块，倾去洗涤溶液上清。收集所述组织小块，向其中加入含有10%胎牛血清的α-MEM培养基，没过组织小块就行，放置培养皿中，在37°C、5% CO2培养。第三天进行换液，缓缓吸取培养基，后加入新鲜培养基，并在371、5%0)2培养箱中培养。每隔三天换一次液，直至爬出间充质干细胞长满培养皿，即可使用胰酶消化进行扩增培养，将培养基倾去，并将细胞通过用胰酶消化， SOOrpm离心5分钟收集后在含10%胎牛血清的α-MEM培养基中传代培养。同样当细胞贴壁生长达到培养瓶底面的85%时，进行消化传代培养。1瓶原代培养物可以传代三瓶，每瓶起始培养的细胞密度为2Χ IO5细胞/mL。三瓶75cm2培养瓶在37°C、5% CO2培养箱中培养 6天后，得到贴壁并且生长达到培养瓶底面的90%的细胞。上述获得的间充质干细胞能继续扩增到第10代，该间充质干细胞仍具有相同的性状，取1瓶培养到第10代间充质干细胞进行流式细胞检测，经胰酶消化，离心后细胞沉淀用ImLlXPBS重悬，计数。取3份20 μ L(1 X IO6个)上述的传代得到细胞悬液分别添加到有 20 μ L FITC-CD34 (BD 公司)禾口 20 μ LPE-CD90 (BD 公司)；20 μ L FITC-CD45 (BD 公司)和 20 μ L PE-CD44 (BD 公司)；20 μ L FITC-HLA-DR (BD 公司)禾口 20 μ L PE-CD105 (BD 公司)的离心管中。置于4°C冰箱染色30分钟，然后用ImL的IX磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤三次，最后用0.5mL的IXPBS重悬洗涤后的细胞，所得洗涤后的细胞用FACSCalibur基本型流式细胞仪检测。结果显示，CD44 > 95. 56%,CD90 > 98. 60%,CD105 > 91. 3%,CD34 < 3. 45%, ⑶45 < 2. 10%, HLA-DR < 1. 33%，符合间充质干细胞表型特征。
取上述培养好的间充质干细胞，倾去培养基，每瓶加入50ug/mL刺五加苷、10%胎牛血清、20ng/mL EGF和20ng/mL bFGF的α -MEM培养基IOml进行分化培养，48小时后半量换液，换液时将旧培养基缓慢吸出5ml，加入新鲜的分化培养基，每瓶加入5ml，继续在 37°C、5%C02培养。第五天间充质干细胞形态发生变化，并进行半量换液，继续培养到第7 天间充质基本分化为少突胶质前体细胞。取其中一瓶细胞，弃去培养基，按前述条件经胰酶消化，SOOrpm离心5分钟后， 收集细胞沉淀用ImL 1XPBS(PH 7. 4的磷酸缓冲液)重悬，计数。取6份50yL(每份含IX IO6个细胞)上述的传代得到细胞悬液分别接种在六孔培养板的六个孔中贴壁生长4小时，吸出培养基后用1 XPBS洗涤一次，加入2 %甲醛固定3分钟，用0. 5 %曲通 100 (Triton-100) IXPBS洗涤三次，再向六孔板的六个孔中分别加入IXPBS以及用IXPBS 稀释的鼠抗人04IgM、1 X PBS稀释的鼠抗人A2B5IgM和1 X PBS稀释的鼠抗人髓鞘碱性蛋白 IgG。在4度冰箱过夜进行染色/结合，之后用0. 5% Triton-IOOlXPBS洗涤3次，向鼠抗人髓鞘碱性蛋白IgG的孔中加入用IXPBS稀释的二抗IgG-FITC，并向鼠抗人04IgM和鼠抗人A2B5IgM的孔中分别加入用IXPBS稀释的二抗IgM-PE和二抗IgM-FITC，在37度下孵育lh，孵育后用IXPBS轻轻洗涤3次，洗涤完之后用90%甘油封闭。荧光显微镜下观测， 结果显示，70%以上的细胞呈现A2B5和04为阳性，髓鞘碱性蛋白为阴性，符合少突胶质前体细胞的特异性特征，因而证明使用本发明的分化培养基从脐带来源的间充质干细胞能分化出高纯度的少突胶质前体细胞。实施例3本实施例用于说明使用本发明的分化培养基对于少突胶质前体细胞体外传代扩增培养的方法，以及所得少突胶质前体细胞冷冻保存的方法。取实施例1和2中得到的少突胶质前体细胞，当其贴壁生长达到培养瓶底面的达到90%时，将细胞通过用胰酶消化，800rpm离心5分钟收集后在含50ug/mL刺五加苷、10% 胎牛血清、20ng/mL EGF和20ng/mL bFGF的α-MEM培养基培养基中传代培养。同样少突胶质前体细胞贴壁生长达到培养瓶底面的达到90%时，重复上述传代培养过程。当少突胶质前体细胞扩增到培养代数第5代时，将1瓶少突胶质前体细胞用胰酶消化，SOOrpm离心 5分钟收集得到少突胶质前体细胞沉淀，用胎牛血清重悬该少突胶质前体细胞沉淀，显微镜下计数使少突胶质前体细胞悬液的浓度达到5X 106/ml。应用二甲基亚砜(DMSO，Sigma) 和胎牛血清先配制成含20% DMSO的胎牛血清，后加入上述重悬液中使得DMSO浓度为10% 并调整少突胶质前体细胞浓度为5X 106/ml。将每Iml所得少突胶质前体细胞悬液分装到 2ml冻存管中，放置程序降温盒(美国Nalgene公司)中按照使用说明书，先在_80度冰箱保存2天后，转至液氮中冻存。取1瓶传代代数为第4代的少突胶质前体细胞，经胰酶消化，SOOrpm离心5分钟后细胞沉淀用ImL IXPBS重悬，计数。取6份50 μ L(每份含1 X IO6个细胞)上述的传代得到细胞悬液分别接种在六孔培养板的六个孔中贴壁生长4小时，吸出培养基后用IXPBS洗涤一次，加入2%甲醛固定3分钟，用0. 5%曲通100 CTriton-100) 1 XPBS洗涤三次，再向六孔板的六个孔中分别加入IXPBS以及用IXPBS稀释的鼠抗人04IgM、lXPBS稀释的鼠抗人A2B5IgM和1 X PBS稀释的鼠抗人髓鞘碱性蛋白IgG。在4度冰箱过夜进行染色/结合，之后用0. 5% Triton-1001 XPBS洗涤3次，向鼠抗人髓鞘碱性蛋白IgG的孔中加入用IXPBS稀释的二抗IgG-FITC，并向鼠抗人04IgM和鼠抗人A2B5IgM的孔中分别加入用1 XPBS稀释的二抗IgM-PE和二抗IgM-FITC，在37度下孵育lh，孵育后用IXPBS轻轻洗涤3次，洗涤完之后用90%甘油封闭。荧光显微镜下观测，结果显示，70%以上的细胞呈现A2B5和04 为阳性，髓鞘碱性蛋白为阴性，符合少突胶质前体细胞的特异性特征，因而证明使用本发明的分化培养基传代培养的少突胶质前体细胞未出现分化变性的现象，保持了少突胶质前体细胞的细胞性状。此外，为了更清楚地显示本发明的效果，申请人还将增殖到第4代的少突胶质前体细胞按照实施例1和3的方法在六孔培养板中培养，图2显示了该少突胶质前体细胞表达蛋白的荧光免疫照片，其中，图2A为鼠抗人04IgM标记后二抗显色荧光免疫照片，图2B 为鼠抗人A2B5IgM标记后二抗显色荧光免疫照片，图2C为图2A和图2B叠加得到的荧光免疫照片。实施例4 本实施例说明本发明方法获得的试剂盒制备。人间充质干细胞诱导分化少突胶质前体细胞及其增殖的分化培养基试剂盒，其组份配制如下1)间充质干细胞基础培养基，为α-MEM、DMEM/F12(1 1)或者DMEM培养基， 500ml，使用500ml无菌试剂瓶包装；2)刺五加苷，25mg,使用2ml无菌密封西林瓶或试剂管包装；3)细胞因子(人表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子)；人表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子都为10ug，使用2ml无菌密封西林瓶或试剂管包装；4)消化细胞的酶以及；胰酶为IOOml，使用IOOml无菌试剂瓶包装；5)使用说明书；详细介绍间充质干细胞分化为少突胶质前体细胞及其增殖的使用步骤和注意事项。实施例5本实施例说明含有本发明方法获得的少突胶质前体细胞的用于治疗创伤性脊髓损伤的药物组合物在创伤性脊髓损伤动物模型中应用。取实施例3所得的脐带来源间充质干细胞分化并传代5代的少突胶质前体细胞培养物含有2X IO6少突胶质前体细胞。SOOrpm下离心5min后收集间充质干细胞的细胞沉淀，用0. 9%的氯化钠溶液洗涤3次，然后用该0. 9%的氯化钠溶液重悬至2X IO6个/mL的浓度，于4°C下保存备用。按照与实施例1和3同样的方法传代扩增制备脐带血来源间充质干细胞分化的2X IO6个/mL浓度的少突胶质前体细胞注射液。将购自北京大学医学部的脊髓损伤大鼠模型，随机分为A、B和C三组组，每组10 只，A组为脐带来源的间充质干细胞分化并传代5代的的少突胶质前体细胞注射液治疗组， B组为脐带血来源的间充质干细胞分化的少突胶质前体细胞注射液，C组为同体积0. 9%的氯化钠溶液空白组。A和B两组在第O天鼠模型脊髓损伤部位注射2X106个/mL，即ImL少突胶质前体细胞注射液，第7天和第14天以相同剂量再次注射；C组于相同时间点在脊髓损伤部位注射0.5mL生理盐水。分别于最后一次注射后的第1、2、4、8、12、16和第M周监测鼠模型髓鞘形成，并进行移植前后BBB功能评分，结果如下表2所示。表 1
脊随损伤大鼠模型OPC移植后BBB评分实验评分结果
权利要求
1.一种人间充质干细胞分化成少突胶质前体细胞及其增殖的分化培养基，所述分化培养基包括液体基础培养基，其特征在于，以所述液体基础培养基的体积为基准，所述分化培养基还含有l-500ug/mL的刺五加苷、1-20体积％的胎牛血清、5-300ng/mL人表皮生长因子 (EGF)和5-300ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。
2.根据权利要求1所述的分化培养基，其中，以所述液体基础培养基的体积为基准，所述分化培养基还含有5-300ug/mL的刺五加苷、5_15体积％的胎牛血清、10-200ng/mL人表皮生长因子(EGF)和10-200ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。
3.根据权利要求2所述的分化培养基，其中，以所述液体基础培养基的体积为基准，所述分化培养基还含有10-200ug/mL的刺五加苷、5_10体积％的胎牛血清、lO-lOOng/mL人表皮生长因子(EGF)和lO-lOOng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。
4.根据权利要求1所述的分化培养基，其中，所述液体基础培养基选自BME细胞培养基、杜尔贝可改良伊格尔细胞培养基、DMEM/F12细胞培养基、Fischer' s细胞培养基、IMDM 细胞培养基、199细胞培养基、MEM细胞培养基、FlO细胞培养基、F12细胞培养基和1640细胞培养基中的一种或几种。
5.一种人间充干细胞分化获得的少突胶质前体细胞及其增殖的方法，其特征在于，所述方法使用权利要求1-5中任意一项所述的分化培养基培养所述人间充质干细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述间充质干细胞来自人骨髓、脐带血和脐带中的一种或几种。
7.由权利要求1-6所述的方法得到的少突胶质前体细胞。
8.一种制备权利要求7所述的刺五加苷处理试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括1)间充质干细胞基础培养基；2)刺五加苷；3)细胞因子(人表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子)；4)消化细胞的酶以及；5)使用说明书。
9.一种用于治疗创伤性脊髓损伤与多发性硬化症等疾病的药物组合物，其特征在于， 所述药物组合物包括权利要求7-8中任意一项所述的方法获得的少突胶质前体细胞，以及和药学上可接受的载体或赋形剂。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其中，所述药物组合物为注射液，所述注射液包括药学上可接受的载体，以及以所述注射液体积为基准，1 X IO5至1 X IO8个/毫升的权利要求7-8中任意一项所述的方法获得的少突胶质前体细胞。
11.根据权利要求10所述的药物组合物，其中，所述注射液包括以所述注射液体积为基准，5X IO5至5X IO7个/毫升的权利要求7-8中任意一项所述的方法获得的少突胶质前体细胞。
12.根据权利要求11所述的药物组合物，其中，所述药学上可接受的载体为生理盐水。
全文摘要
本发明提供了一种刺五加苷处理人间充质干细胞得到少突胶质前体细胞及其增殖的分化培养基，所述分化培养基包括液体基础培养基，其中，以所述液体基础培养基的体积为基准，所述分化培养基还含有1-500ug/mL的刺五加苷、1-20体积％的胎牛血清、5-300ng/mL人表皮生长因子(EGF)和5-300ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)；还提供了使用前述分化培养基的制备该刺五加苷处理试剂盒的方法；还提供了包括前述的方法获得的少突胶质前体细胞的用于治疗神经系统疾病的药物组合物。使用本发明的分化培养基的本发明的方法能够高效分化间充质干细胞，得到少突胶质前体细胞。本发明用于治疗创伤性脊髓损伤与多发性硬化症等疾病的药物组合物能在体内修复损伤的神经细胞，并消除神经系统病变。
文档编号C12N5/0797GK102337246SQ201110307969
公开日2012年2月1日 申请日期2011年10月12日 优先权日2011年10月12日
发明者沈丽, 王振光, 郝丽敏, 黄启明 申请人:北京弘润天源生物技术有限公司