专利名称：一种通过还原途径积累延胡索酸的酿酒酵母基因工程菌的构建及柠檬酸对其发酵特性的影响的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种通过还原途径积累延胡索酸的酿酒酵母工程菌的构建方法及柠檬酸的添加对其发酵特性的影响，属于遗传工程领域和发酵工程领域。
背景技术：
作为一类重要的有机酸和最简单的不饱和二羧酸，延胡索酸广泛应用于食品、医药、化工以及畜牧等行业中，特别是作为聚合反应和酯化反应的良好材料，延胡索酸被称为最引人瞩目的十二大化工结构元件之一，因此，具有十分广阔的市场和应用前景。石油化工路线(petrochemical routes)是当前延胡索酸的主要生产方法，该工艺因原料有限、环境污染严重、生产成本高昂等问题，其产能的进一步扩大受到了限制。利用微生物发酵法生产延胡索酸引起了广泛的兴趣，目前研究得最多的微生物是米根霉(Miizopus oryzae)和少根根霉(Rhizopus arrhizus) 但是，R. oryzae和R. arrhizus表现出复杂的生长形态，发酵工艺难以控制，且其遗传信息和生化机制研究较少，代谢工程改造十分困难。酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)作为一种真核模式微生物，因具有遗传信息丰富，代谢改造操作方便；营养需求简单，生化分离工艺成本低廉；在低PH条件(甚至pH < 3. 0)下生长良好；能耐受高浓度的底物；被FDA认证为GRAS(Generally Regarded As Safe)微生物，发酵产品具有安全性等优点而成为发酵生产延胡索酸的潜在最适微生物。酿酒酵母本身不具备积累延胡索酸的代谢途径，但研究发现R. oryzae是通过胞质还原途径积累大量延胡索酸的，并且，通过该途径积累延胡索酸具有最大的理论得率 (2mol/mol glucose)，还可以通过丙酮酸羧化反应固定二氧化碳。那么，酿酒酵母是否也可以通过胞质还原途径大量积累延胡索酸并固定二氧化碳，是一个十分令人感兴趣的问题。 此外，当胞质还原途径引入酿酒酵母细胞后，是否导致氧化还原的不平衡及能量的供应不足，也是一个需要考虑的问题，有报道认为，添加促进NADH合成的底物，如柠檬酸，可以提高胞内ATP的水平，同时还可以诱导与能量代谢相关的关键酶和酶系的表达，促进胞内ATP 的合成。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是通过在酿酒酵母里构建一条胞质还原TCA途径，使得延胡索酸得以积累，并通过添加柠檬酸来解决能量不足和氧化还原的问题。为解决上述技术问题，本发明的技术方案为通过在酿酒酵母中过量表达源于lihizopus oryzae NRRL15^的苹果酸脱氢酶基因RoMDH和源于自身的丙酮酸羧化酶基因PYC2。并通过添加柠檬酸来解决能量不足和氧化还原不平衡的问题。本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种利用所述工程菌FMME-001-5发酵生产延胡索酸的方法。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案为1)提取米根霉(Rhizopus oryzae NRRL1526)的总RNA，经反转录后获得其cDNA， 然后以cDNA为模板，PCR扩增获得RoMDH。2)提取酿酒酵母(S. cerevisiae BMA64)的基因组，以其为模板，PCR扩增获得 PYC2。；3)重组质粒的构建将基因RoMDH连接到质粒pY^TEF/GPD，获得重组质粒pY^TEF/GPD-RoMDH ；将基因PYC2连接到质粒raS305TEFl，获得重组质粒 PRS305TEF1-PYC2。4)重组质粒的转化将上述重组质粒先后转化到处于感受态的酿酒酵母 (S. cerevisiae BMA64)细胞，通过筛选平板获得阳性转化子。本发明要解决的另一个技术问题是提供一种利用所述工程菌发酵生产延胡索酸的方法。将30°C、200rpm下培养12h的基因工程菌种子以5%的接种量转入发酵培养基于 30°C、200rpm条件下培养78h，因FMME-OOl丨PYC2+丨RoMDH为缺陷型菌株，培养基需添加不同浓度的^^AdeAHis。延胡索酸的测定方法高效液相(HPLC)检测法，色谱柱为ZORBAX SB-Aq柱，流动相为磷酸缓冲盐磷酸二氢钾8. 34g，磷酸氢二钾0. 87g，乙腈5ml，加水定容到lOOOmL，用磷酸调节pH至2. 5。流速为Iml mirT1，温度为35°C，检测器选用Agilent 1200DAD检测器，检测波长为210nm。所用培养基:Difco Yeast Nitrogen Base w/o amino acids 1. 7g/L, (NH4)2SO4 5g/ L, Glucose20g/L。按要求分别添加 Leu 100mg/L、Trp 20mg/L、Ade 20mg/L、His 20mg/L、 Ura 20mg/Lo种子培养基SC培养基，装液量为20ml/250ml，115°C灭菌20min。发酵培养基SC培养基，葡萄糖浓度改为60g/L，柠檬酸添加量为5g/L，装液量为 50ml/250ml, 115°C灭菌 20min。本发明提供的基因工程菌可积累延胡索酸，其浓度可达到11. 75士0. 35mg/L，在添加柠檬酸的条件下可积累延胡索酸为55. 05士2. 33mg/L，为代谢工程进一步改造酿酒酵母生产C4 二羧酸的研究奠定了基础。本基因工程菌的构建方法简单，便于使用，具有很好的应用前景。
图1 酿酒酵母积累延胡索酸的胞质还原途径图 2A :pY26TEF/GPD-RoMDH 重组质粒图谱B :pRS305TEFl-PYC2 重组质粒图谱图3 柠檬酸的添加对FMME-001-5延胡索酸的积累的影响
具体实施例方式以下通过实施例来进一步阐明本发明，下列实施例用于说明目的而非用于限制本发明范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，基本上都按照常见的分子克隆手册所述的条件进行操作。实施例1产延胡索酸的酿酒酵母基因工程菌一种通过还原途径积累延胡索酸的酿酒酵母基因工程菌，是通过在酿酒酵母中过量表达来源于米根霉(Miizopus oryzae NRRL1526)的RoMDH和整合表达源于自身的PYC2 基因获得的。实施例2产延胡索酸的酿酒酵母工程菌的构建方法1、菌株和质粒酿酒酵母(S.cerevisiae BMA64)购自欧洲 EUR0SCARF，其基因型为 MATa/ ΜΑΤ αura3-52/ura3-52 ； trpl Δ2/trplΔ 2 ； leu2_3，112/leu2_3，112 ；his3_ll/ his3-ll ；ade2-l/ade2-l ；canl-lOO/canl-lOO ；质粒 pY^TEF/GPD 由本研究室保藏；质粒 PRS305TEF1购自德而宝生物技术有限公司。2、重组质粒的构建用带有BamHI和HindIII的引物扩增RoMDH，所用引物为F CGGGATCCATGTTTGCCGCCTCTCGTG ；R :CCCAAGCTTTTATTGAACAAAGCTGTTACCCTTG. PCR 产物连接到pMDTM19-T Simple Vector，然后将其进行双酶切，和经同样酶切的质粒pY^TEF/GPD 进行连接，获得重组质粒pY^TEF/GPD-RoMDH ；用带有酶切位点I3StI和Mil的引物扩增 PYC2，所用引物为F :AACTGCAGATGAGCAGTAGCAAGAAATTGGC ；R :ACGCGTCGACTTACTTTTTTTGGG ATGGGGGT. PCR产物连接到pMD 19_T Simple Vector，用PstI和Mil对其进行双酶切，连接到经同样双酶切的质粒raS305TEFl，获得重组质粒pRS305TEFl-PYC2。3、转化及验证用转化试剂盒 Frozen-EZ Yeast Transformation II kit (Zymo Research, Orange, CA, USA)制作酿酒酵母感受态细胞，将上述重组质粒转化感受态细胞，用相应的筛选平板获得转化子。后经提取质粒，酶切验证确认为阳性转化子。实施例3发酵生产延胡索酸将30°C、200rpm下培养12h的基因工程菌种子以5%的接种量转入发酵培养基于 30°C、200rpm条件下培养78h，培养基中按实验要求添加不同浓度的Trp、Ade、His。种子培养基SC培养基，装液量为20ml/250ml，115°C灭菌20min。发酵培养基SC培养基，葡萄糖浓度改为60g/L，柠檬酸添加量为5g/L，装液量为 50ml/250ml, 115°C灭菌 20min。延胡索酸的测定方法高效液相(HPLC)检测法，色谱柱为ZORBAX SB-Aq柱，流动相为磷酸缓冲盐磷酸二氢钾8. 34g，磷酸氢二钾0. 87g，乙腈5ml，加水定容到lOOOmL，用磷酸调节pH至2. 5。流速为Iml mirT1，温度为35°C，检测器选用Agilent 1200DAD检测器，检测波长为210nm。通过代谢工程改造不积累延胡索酸的酵母菌得到本发明提供的可积累延胡索酸酵母基因工程菌FMME-001-5，通过添加5g/L的柠檬酸，延胡索酸含量可达55. 05mg/L，为代谢工程进一步改造酿酒酵母生产C4 二羧酸的研究奠定了基础。虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
权利要求
1.一种通过还原途径积累延胡索酸的酿酒酵母工程菌，其特征在于该基因工程菌可以通过胞质还原途径积累延胡索酸。并且，柠檬酸的添加可以极大地促进延胡索酸的积累。
2.权利1所述的基因工程菌，其特征在于通过在酿酒酵母中表达源于米根霉 (Rhizopus oryzae NRRL1526)的苹果酸脱氢酶RoMDH和自身的PYC2，导致延胡索酸的积累。
3.权利要求1所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤 第一步基因的获得提取米根霉(Miizopus oryzae NRRL1526)的总RNA，经反转录后获得其cDNA，然后以 cDNA为模板，PCR扩增获得RoMDH;提取酿酒酵母(S. cerevisiae BMA64)的基因组，以其为模板，PCR扩增获得PYC2;第二步基因的转化及转化子的验证将上述重组质粒转化酿酒酵母感受态细胞，用相应的筛选平板获得转化子。后经提取重组质粒，酶切验证确认为阳性转化子。
4.根据权利要求1所述的发酵特性研究，其特性是将30°C、200rpm下培养1 的基因工程菌种子以5%的接种量转入发酵培养基于30°C、200rpm条件下培养78h，基因工程菌可积累延胡索酸，其浓度可达到11. 75士0. 35mg/L，在添加柠檬酸的条件下可积累延胡索酸为 55. 05 士 2. 33mg/L。
全文摘要
本发明公开了一种通过还原途径积累延胡索酸的酿酒酵母基因工程菌的构建及柠檬酸对其发酵特性的影响。本发明通过在酿酒酵母S.cerevisiae BMA64中过量表达源于米根霉Rhizopus oryzae NRRL1526的RoMDH基因及源于自身的PYC2基因，从而使得酿酒酵母通过还原TCA途径积累延胡索酸。本发明公开的酿酒酵母基因工程菌FMME-001-5在添加柠檬酸的条件下，延胡索酸的积累量明显增加，方法简单，产量可达55.05±2.33mg/L，为研究代谢工程改造酿酒酵母生产延胡索酸奠定了基础。
文档编号C12N1/19GK102363752SQ201110317359
公开日2012年2月29日 申请日期2011年10月19日 优先权日2011年10月19日
发明者刘立明, 徐国强, 林新跑 申请人:江南大学