专利名称：快速检测基因组中基因拷贝数的方法
技术领域：
本发明属于生物DNA检测技术，特别是一种快速检测基因组中基因拷贝数的方法。
背景技术：
在现代的科学研究和生产实践中，我们有时需要准确地知道生物体的基因拷贝数。比如，人类脊柱肌肉萎缩症(Spinal muscular atrophy, SMA)的遗传病因是一对SMA 基因中的一个部分缺失。我们需要准确地知道其基因的拷贝数，才能做出正确的诊断。又如，随着转基因技术在农业生产中的应用，各个国家对转基因生物采取了严格的控制，研究者必须准确地知道目标基因在转基因植物中的拷贝数。现行测定基因拷贝数的方法有三种1、生物杂交法。将转基因植物与非转基因植物相互杂交，根据子代中转基因植物的比率和孟德尔定律，推算出目标基因在转基因植物中的拷贝数。2、Southern印迹法。将转基因植物的DNA用限制性内切酶水解，然后用琼脂糖凝胶电泳将DNA按片段大小分开，再将其转移到硝酸纤维或尼龙膜上。将目标基因用放射性同位素或其他方法标记，然后和印到膜上的DNA杂交。根据放射性条带的数值，推断出目标基因的拷贝数。3、实时PCR法。实时PCR又称TaqMan PCR,它用一对基因的PCR引子和探针以及DNA聚合酶，通过反复的热冷循环，将目标基因以指数形式扩增。由于PCR产物可以用荧光来定量，而且荧光阈值循环数(Threshhold Cycle, Ct)与被扩增基因的起始浓度对数是直线负相关的，因此我们可以用目标基因和已知内参照基因的Ct差值来确定目标基因的基因拷贝数。现有技术的最明显的缺陷在于1、用时长，耗资大。上述生物杂交法需要一个整个植物生长季才能产生子一代，并需要检测大量的子一代才可以获得有统计意义的数据。2、 需特殊设备和装置。上述Southern印迹法需要放射性同位素操作许可和暗房等基础设施和条件，还需要大量资金处理放射性废物。非放射性方法很难达到检测单一基因的灵敏度， 且价格昂贵。3、基于不充分的假设。上述实时PCR 2ΔΔα法基于一个不充分的假设，即目标基因和内参照基因具有同样的PCR扩增系数。但这项假设一般难以成立，不同序列和长度的基因，其PCR扩增系数都有差异。由于PCR是以指数方式扩增基因的，微小的PCR扩增系数差异会在多个循环扩增后造成PCR扩增的巨大差异，直接影响基因拷贝数的计算。4、基于不充分的试验条件。现有实时PCR测定基因拷贝数的方法，都需要生物标准品，标准品中含有已知拷贝数的目标基因和内参照基因，然后用实验样品同标准品比较，方可得出其目标基因的拷贝数。但这对于一个新物种或新的目标基因非常难于实现。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术之不足，提供一种快速检测基因组中基因拷贝数的方法。本发明的目的按照下述方案实现快速检测基因组中基因拷贝数的方法，包括以下操作步骤1)选取生物体中一个已知拷贝数的基因为内参照基因，分别设计目标基因和内参照基因的TaqMan PCR引物和探针；2)用PCR反应将目标基因和内参照基因分别扩增和纯化，测试各自的重量浓度，并根据其核酸片段长短，将重量浓度换算为摩尔浓度；3)将目标基因和内参照基因按不同摩尔浓度比混合成系列标准品，用实时PCR仪分别测定目标和内参照基因标准品的阈值荧光循环数，并将系列阈值荧光循环数差值与相应摩尔浓度比的对数做成标准曲线；4)提取并纯化所测生物体DNA，用实时PCR仪分别测定目标和内参照基因的阈值荧光循环数，算出其差值，然后按照标准曲线将其换算为目标基因和内参照基因摩尔浓度比，亦即基因拷贝数比；
所述目标基因和内参照基因的标准摩尔浓度溶液是由PCR扩增并纯化制成的； 所述不同摩尔浓度比的目标基因/内参照基因标准混合液，是由权利要求2的目标基因和内参照基因的标准摩尔浓度溶液按比例相混制成的；
目标基因/内参照基因的标准曲线，是由目标基因和内参照基因阈值荧光循环数的差值与目标基因和内参照基因摩尔浓度比的对数值对应形成的；
提取并纯化生物体的DNA，用实时PCR测定其目标基因和内参照基因的阈值荧光循环数，并根据权利要求4的标准曲线来确定目标基因和内参照基因的基因拷贝数比值。本发明对实时PCR测定基因拷贝数的方法做出了重大改进。它将不再拘于现行的简单假设-所有PCR都具有相同的扩增系数，而是基于实验模拟，这从根本上解决了测定基因拷贝数的理论基础问题。同时它也将不再需要一个已知目标基因和内参照基因拷贝数的标准品，解决了如何获取第一个标准品的难题。本发明的具体步骤如下
1、选取生物体中一个已知拷贝数的基因为内参照基因，分别设计目标基因和内参照基因的TaqMan PCR引物和探针；2、用PCR反应将目标基因和内参照基因分别扩增和纯化，测试各自的重量浓度，并根据其核酸片段长短，将重量浓度换算为摩尔浓度；3、将目标基因和内参照基因按不同摩尔浓度比混合成系列标准品，用实时PCR仪分别测定目标和内参照基因标准品的阈值荧光循环数，并将系列阈值荧光循环数差值与相应摩尔浓度比的对数做成标准曲线；4、提取并纯化所测生物体DNA，用实时PCR仪分别测定目标和内参照基因的阈值荧光循环数，算出其差值，然后按照标准曲线将其换算为目标基因和内参照基因摩尔浓度比，亦即基因拷贝数比。因为内参照基因的拷贝数是已知的，我们可以由此可以得知目标基因在该生物体中的拷贝数。
图1.本发明方法图解
图2. TaqMan PCR的反应机理
图3.不同量DNA的TaqMan PCR反应。DNA经过系列稀释，然后加入iTaqMan PCR 反应试管中，与探针反应。不同量的DNA需要不同的PCR循环方可产生可测荧光(该PCR循环数称为Ct或阈值循环数);起始DNA量越少，Ct越大，亦即需要更多的PCR循环方可产生可测荧光。图4.基因浓度与TaqMan PCR阈值荧光循环数的关系。
图 5. ACt (Ct,HvNHXl - Ct，MsCycl)与摩尔浓度比对数{Log2(HvNHXl/MsCyclX} 相关性的标准曲线。图 6. ACt (Ct，HvNHXl - Ct，MsNHXl)与摩尔浓度比对数{Log2 (HvNHXl/ MsNHXl)}相关性的标准曲线。图 7. ACt (Ct，MsCycl - Ct，MsNHXl)与摩尔浓度比对数{Log2 (MsCycl/ MsNHXl)}相关性的标准曲线。
具体实施例方式参照表1.转基因紫花苜蓿的内参照基因MsCycl和MsNHXl以及转基因HvNHXl 的阈值荧光循环值。表2.确定生物体中的基因拷贝数。本发明的具体步骤如下
以自构建的转基因紫花苜蓿为例。在转基因紫花苜蓿中，目标基因大麦钠氢离子对流泵(HvNHXl)被农杆菌Ti质粒引入紫花苜蓿基因组中，我们需要检测该基因在紫花苜蓿基因组中的拷贝数。在紫花苜蓿中，细胞周期蛋白1 (MsCycl)和紫花苜蓿钠氢离子对流泵1 (MsNHXl)已经被前人用Southern Blot方法证明是单拷贝基因，我们用它们作为内参照基因。我们从商业机构订制了 TaqMan探针和PCR引子，如下
HvNHXl TaciMan 探针5，FAM-TGGAAATTTGCTAGTGACAGCCCTGGC-3，Iowa Black MsCycl TaqMan 探针5' FAM-AAGCTTCAGTTGGTTGGTTTAGTGGCAATG-3' Iowa Black MsNHXl TaqMan 探针
5，FAM/TTCCTGTAGAACCTGGCTCACCAAGTGAA/3，Iowa Black 在上述探针中，FAM是荧光染料，Iowa Black是猝光剂。HvNHXl PCR 弓 | 子5 ‘ -TGGATGCACTGGATATCGAGAA-3 ‘ 禾口 5'-AAAATTGAGCTTATTCCGATGGAT-3’
MsCycl PCR 引子5 ‘ - TGGAAAAGCAGTCTGTGGTAAGAA-3‘ 禾口 5'-TCCTCATACTTGCATGCCAAAA-3’
MsNHXl PCR 引子5，-TGTTTTTGGTGGCAGAGGTTT-3，和 5，-CAACCCCATTGATTACCATTGC-3’
当荧光染料和猝光剂被同时连在iTaqMan探针上时，由于FRET效应(FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)，FAM 的荧光将被猝光剂 IOWA BLACK 吸收而无法发出。但在聚合酶链式反应(PCR)中，探针将被DNA聚合酶水解，使FAM游离出来，发出荧光(见图2)。DNA由两条反向螺旋链组成，且这两条链上的碱基彼此互补，腺嘌呤对胸腺嘧啶 (A对T)，鸟嘌呤对胞嘧啶(G对C)。当DNA双链的碱基不互补时，它们将无法形成稳定的 DNA双螺旋结构。如上所述，我们已测知HvNHXl和MsCycl基因的DNA序列，我们根据这些差别设计出它们各自特异的iTaqMan探针。HvNHXl的I1aqMan探针只能和的HvNHXl基因完全互补，形成稳定的DNA双螺旋结构；反之MsCycl的TaqMan探针只能和MsCycl的基因完全互补，形成稳定的DNA双螺旋结构。因为TaqMan PCR反应产生荧光的先决条件是TaqMan探针与其互补链形成稳定的结构，所以MsCycl探针只有和MsCycl DNA在一起时才能产生荧光，反之HvNHXl探针只有和HvNHXl DNA在一起时才能产生荧光。TaqMan PCR反应不仅有很强的专一性，还有很强的定量性。如图3所示，不同量的基因DNA需要不同的PCR循环方可产生可测荧光(该PCR循环数称为Ct或阈值循环数);起始DNA量越少，Ct越大，亦即需要更多的PCR循环方可产生可测荧光。我们将上面试验中DNA量的对数与其Ct作图，我们可以得到如下对应关系标准曲线，如图4。从图4我们可以看出，一个基因浓度的对数与其Ct是直线负相关的。因此，我们用TaqMan PCR不仅可以区分目标基因和内参照基因，还可以将其分别定量。在本发明中，我们将检测目标基因拷贝数看成一个目标基因与内参照基因摩尔浓度比值的特例。我们用PCR专一地扩增目标基因HvNHXl和内参照基因MsCycl和MsNHXl ； 我们将扩增的HvNHXl、MsCycl和MsNHXl基因纯化；我们用紫外分光光度计测出其重量浓度，然后根据其碱基长度算出其摩尔浓度。我们将HvNHXl、MSCycl以及MsNHXl按不同的摩
尔浓度比相混，然后用TaqMan PCR分别测出Ct
HvNHXl;
Ct
MsCycl
和Ct,MsNHX1，由此我们可以得到
ACt (Ct
-Ct
MsCycl
)与摩尔浓度比对数{Log (HvNHXl/MsCycl)}相关性的标准曲线,
从理论可以推算出ACt (Ct
HvNHXl
-Ct
MsCycl
)与摩尔浓度比对数ILog2 (HvNHXl/MsCycl) }
是线性相关的，如图5。用同样的方法，由此我们可以得到ACt (Ct
-Ct
,MsNHXl
11 ~~ Ct, MsNHXl )与摩尔
)与摩尔浓度比对数ILog
浓度比对数{Log (HvNHXl/MsNHXl)}以及 ACt (Ct,MsCycl (MsCycl/MsNHXl) }相关性的标准曲线，如图6和图7。 对实验转基因紫花苜蓿，我们测得HvNHXl，MsCycl和MsNHXl的阈值荧光循环数如表1
基因 HvNHXl MsCyd MsNHXI 24.87 23.98 23.87 24.3 24.14 24.03 24.41 23.94 24.23
24.0524.51 23.87 24.08 24.41 24,03
24.0624.18 24.23
乎均 24.295 24,19333 24.04333
表1
我们根据图5、6、7的标准曲线将其转化为基因浓度比，亦即基因拷贝数比，如表2。
UBS 尔浓磨 α ι Pl ι uatii
￥=4 J 14x+ 0.0563 MsCfdiMsNHKI .150.941:1表2
因此，对于任何一个实验生物，我们仅需用TaqMan PCR测定其目标基因和内参照基因的Ct值，就可以根据标准曲线来确定其摩尔浓度比，亦即基因拷贝数。上述具体实验设备及条件如下(1) TaqMan PCR反应条件如下
在伯乐公司的96孔板上，加入下述反应试剂1 χ PCR缓冲液II (ABI，无Mg2+)，3mM MgCl2 ,300 mM dNTP，200 nM PCR 正向引物，200 nM 反向引物，300 nM TaqMan IOffA BLACK 探针，1 U GoldTaq DNA聚合酶(ABI)，DNA样品，总反应体积为12.5微升。TaqMan PCR反应温度控制如下95 C 11分钟，40个循环(94 C 30秒，65 C 30秒)。(2) PCR反应条件如下
在200 μ 1的PCR反应管中，加入下述反应试剂1 X PCR缓冲液II (ΑΒΙ，无Mg2+)， 3mM MgCl2 ,300 mM dNTP，200 nM PCR 正向引物，200 nM 反向引物，1 U GoldTaq DNA 聚合酶(ABI)，DNA样品，总反应体积为12. 5微升。TaqMan PCR反应温度控制如下95 C 11分钟，40个循环(94 C 30秒，65 C 30秒)。(3) PCR DNA纯化和定量方法如下
用QIAGEN公司的QiaQuick PCR Purification试剂盒纯化PCR扩增的HvNHXl和 MsCycl基因。用紫外分光光度计0D260测定纯化基因的重量浓度。根据基因的碱基长度， 将基因的重量浓度换算为摩尔浓度。
权利要求
1.快速检测基因组中基因拷贝数的方法，包括以下操作步骤1)选取生物体中一个已知拷贝数的基因为内参照基因，分别设计目标基因和内参照基因的TaqMan PCR引物和探针；2)用PCR反应将目标基因和内参照基因分别扩增和纯化，测试各自的重量浓度，并根据其核酸片段长短，将重量浓度换算为摩尔浓度；3)将目标基因和内参照基因按不同摩尔浓度比混合成系列标准品，用实时PCR仪分别测定目标和内参照基因标准品的阈值荧光循环数，并将系列阈值荧光循环数差值与相应摩尔浓度比的对数做成标准曲线；4)提取并纯化所测生物体DNA，用实时PCR仪分别测定目标和内参照基因的阈值荧光循环数，算出其差值，然后按照标准曲线将其换算为目标基因和内参照基因摩尔浓度比，亦即基因拷贝数比。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于所述目标基因和内参照基因的标准摩尔浓度溶液是由PCR扩增并纯化制成的。
3.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于所述不同摩尔浓度比的目标基因/内参照基因标准混合液，是由权利要求2的目标基因和内参照基因的标准摩尔浓度溶液按比例相混制成的。
4.根据权利要求1-3任一所述方法，其特征在于目标基因/内参照基因的标准曲线， 是由目标基因和内参照基因阈值荧光循环数的差值与目标基因和内参照基因摩尔浓度比的对数值对应形成的。
5.根据权利要求1-4任一所述方法，其特征在于提取并纯化生物体的DNA，用实时 PCR测定其目标基因和内参照基因的阈值荧光循环数，并根据权利要求4的标准曲线来确定目标基因和内参照基因的基因拷贝数比值。
全文摘要
快速检测基因组中基因拷贝数的方法，包括以下操作步骤1)选取生物体中一个已知拷贝数的基因为内参照基因，分别设计目标基因和内参照基因的TaqManPCR引物和探针；2)用PCR反应将目标基因和内参照基因分别扩增和纯化，测试各自的重量浓度，并根据其核酸片段长短，将重量浓度换算为摩尔浓度；3)将目标基因和内参照基因按不同摩尔浓度比混合成系列标准品，用实时PCR仪分别测定目标和内参照基因标准品的阈值荧光循环数，并将系列阈值荧光循环数差值与相应摩尔浓度比的对数做成标准曲线；4)提取并纯化所测生物体DNA，用实时PCR仪分别测定目标和内参照基因的阈值荧光循环数，算出其差值，然后按照标准曲线将其换算为目标基因和内参照基因摩尔浓度比，亦即基因拷贝数比。
文档编号C12Q1/68GK102337340SQ20111031711
公开日2012年2月1日 申请日期2011年10月19日 优先权日2011年10月19日
发明者李健, 柳金凤, 计皖 申请人:宁夏林业研究所股份有限公司