专利名称：一种耐盐木聚糖酶及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种耐盐木聚糖酶及其编码基因与应用。
背景技术：
木聚糖是一种多聚五碳糖，主要成分是D-木糖，是植物半纤维素的重要组成部分，它占植物碳水化合物总量的1/3，在自然界中是继纤维素之后含量第二丰富的再生生物资源。木聚糖的结构复杂，主链由P-D-吡喃木糖残基经￠-1,4-糖苷键连接成，不同来源的木聚糖有不同的侧链取代基团。内切-P-1，4_D-木聚糖酶(endo-0-1,4-D-xylanase)[EC 3.2.1. 8]，简称木聚糖酶，负责木聚糖主链骨架的降解，是木聚糖降解酶系中最关键的酶。根据糖苷水解酶催化区域的氨基酸序列组成和疏水性分析，可将糖苷水解酶类分成不同的家族，目前发现的木聚糖酶主要属于F/10和G/11家族。木聚糖酶具有重要的潜在应用价值，广泛应用在食品、饲料、制浆造纸、生物脱胶等行业。木聚糖酶有巨大的应用潜力，但应用在不同的领域对木聚糖酶的性质有不同的要求。一般来说，最适作用温度决定了酶的应用领域，热稳定性则与酶能否工业化生产有很大关系。如造纸需高温和碱性的条件，纸浆底物需要嗜热碱酶才能有效地进行生物漂白。耐盐木聚糖酶也被应用生物脱胶和洗涤剂生产中。饲料粒化前加入木聚糖酶主要在70 95°C下进行，因此热稳定性好的木聚糖酶可应用到动物饲料的生产。另外，饲用酶必须在温度约为40°C，pH约为4. 8的条件下具有高度的活性，以适应动物消化道的环境。面浆团通常在低于35°C的条件下调制，因此，在低温或中温的条件下酶活很高的嗜冷木聚糖酶目前被用于低温或中温加工过程中特别是食品业。由于不同工业生产中需要不同性质的酶，因此，研究新的具有优良性质的木聚糖酶具有重大意义
发明内容
本发明的一个目的是提供一种蛋白。本发明提供的蛋白，可人工合成，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列2所不的氣基酸残基序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有木聚糖酶功能的由(a)衍生的蛋白质。其中序列表中序列2由348个氨基酸组成，分子量约40kDa木聚糖酶的编码基因具体可为如下I)-3)中任一所述的DNA分子I)序列表中的序列I所示的DNA分子；2)在严格条件下可与I)限定的DNA序列杂交且编码具有木聚糖酶功能所述蛋白的DNA分子；3)与I)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且编码具有木聚糖酶功能所述蛋白的DNA分子。
序列表中的序列I由1047个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5'末端第1-1047位碱基，编码氨基酸序列是序列表中序列2的木聚糖酶。上述严格条件可为在0.1 X SSPE (或0.1 X SSC), 0. 1% SDS的溶液中，在65°C条件下杂交并洗膜。含有上述蛋白编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系和重组菌也属于本发明的保护范围。所述重组载体具体为在pET28a的BamH I和Xho I位点间插入所述蛋白的编码基因得到的重组载体pET28a-BcxyllOA。所述重组菌具体可为在大肠杆菌BL21(DE3)、BL21_Gold (DE3)、BL21_Gold (DE3)pLysS或BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL中导入含有上述木聚糖酶编码基因的重组载体得到的重组菌。扩增上述内切木聚糖酶编码基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围，所述引物对的一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列3，所述引物对中的另一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列4。本发明的第二个目的是提供一种制备木聚糖酶的方法。本发明所提供的制备木聚糖酶的方法，是发酵培养所述的重组菌，即得到木聚糖酶。所述培养温度为25°C，所述培养的时间为10h。本发明的实验证明，本发明从锡盟碱湖中分离到嗜碱菌Bacilluscellulosilyticus SN5， 通过构建菌基因组文库，获得内切木聚糖酶编码基因，并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)中，实验结果表明，本发明的内切木聚糖酶具有较低的最适反应温度，在高盐中稳定性和抗逆性较高，具有较高的比活力，因此在海产品或腌制产品加工中具有较好的应用前景。
图1为重组木聚糖酶BcxyllOA的SDS-PAGE电泳2为重组木聚糖酶BcxyllOA的最适反应温度图3为重组木聚糖酶BcxyllOA的最适反应pH图4为重组木聚糖酶BcxyllOA的热稳定性图5为重组木聚糖酶BcxyllOA的pH稳定性图6为NaCl对重组木聚糖酶BcxyllOA的酶活性影响图7为重组木聚糖酶BcxyllOA对NaCl的耐受性
具体实施例方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、木聚糖酶及其编码基因的获得1、木聚糖酶及其编码基因的发现锡盟碱湖嗜碱菌SN5是中科院微生物所2010年从我国内蒙锡盟碱湖内分离得到，其16s rRNA基因序列比对结果表明与Bacillus cellulosilyticus DSM2522的相似性为99%,初步鉴定为 Bacillus cellulosilyticus。提取碱湖嗜碱菌Bacillus cellulosilyticus SN5的基因组DNA，用限制性内切酶Sau3A I部分酶切后，切胶回收3-9kb的片段，与经BamH I酶切去磷酸化的pUC118载体连接，转化感受态细胞E. coli DH5a，涂布在LB平板[含100Amp、0. 5M IPTG和0.2%RBB-xylan (Remazol Brilliant Blue R-D-Xylan, sigma公司产品，目录号M5019)，pH8. 0]上，37°C培养过夜，获得约6000个克隆子，其中2个克隆子周围出现透明圈，为阳性克隆子。对阳性克隆子所含质粒的插入片段进行测序，获得一个具有1047个核苷酸的0RF，编码348个氨基酸。序列同源性比对发现该ORF的氨基酸序列与来自Paenibacillussp. E18的endoxylanase的氨基酸序列有71 %的相似性,属于糖基水解酶10家族成员，将其命名为Bcxyl 10A。2、木聚糖酶及其编码基因的获得以Bacillus cellulosilyticus SN5的基因组DNA为模板,所用引物如下正向引物 5' GCATGGATCCATGTTAATGAGTGATTATGGGAGGA 3'(包含BamH I 酶切识别位点，序列 3)；反向引物 5' GCTACTCGAGTGAATTTGCAACTTTGATTAATTCA 3'(包含 Xho I 酶切识别位点，序列4)进行PCR扩增，PCR扩增条件如下先95°C预变性5min，然后95°C 30s, 55°C 30s，72°C 90s，共35个循环；最后72°C延伸7min，得到1067bp的PCR产物。将上述PCR反应产物切胶回收纯化，取产物I ill作为再次PCR的模板，所用引物及扩增条件均同前。将再次PCR反应产物用cycle-pure kit纯化，用BamH I和Xho I双酶切，酶切产物与经相同酶切的pET28a载体(购自Promega公司)用T4连接酶4°C连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞，获得重组菌。提取重组菌的质粒测序验证，结果表明，该质粒中的PCR广物具有序 列表中序列I所不的核昔酸，将其PCR广物的基因命名为BcxyllOA,该基因编码的蛋白命名为BcxyllOA,该蛋白的氣基酸序列为序列表中的序列2,将序列表中的序列I插入pET28a的BamH I和Xho I位点间，命名为pET28a_BcxyllOA。也可人工合成序列1，采用上述的方法同样得到pET28a_BcxyllOA。实施例2、利用重组菌发酵生产木聚糖酶1、含有木聚糖酶编码基因的重组菌的获得将重组质粒pET28a_BcxyllOA转化表达感受态宿主BL21(DE3)中，得到重组菌BL21 (DE3) /pET28a-BcxyllOA,提取质粒进行测序，质粒为pET28a_BcxyllOA，说明构建得到含有该质粒的重组菌BL21 (DE3)/pET28a-BcxyllOA。采用同样的方法将空载体pET28a转入BL21 (DE3)中，得到重组菌BL21 (DE3) /pET28a，提取质粒进行PCR鉴定，引物为 forward 5' GCATGGATCCATGTTAATGAGTGATTATGGGAGGA 3'(序列 3) !reverse5' GCTACTCGAGTGAATTTGCAACTTTGATTAATTCA 3'(序列 4)，结果未得到目的片段，说明构建得到转空载体重组菌BL21 (DE3) /pET28a。2、木聚糖酶的获得及活性测定I)木聚糖酶的提取及纯化A、培养将上述步骤I获得的重组菌BL21 (DE3) /pET28a-BcxyllOA的单菌落接种至卡那霉素终浓度为50 u g/ml的5ml LB液体培养基中，37°C培养12h。将培养液按照I %的接种量转接至2L新鲜的LB液体培养基中，37°C培养至0D600达到0. 6，再在培养基中加入终浓度为ImM的IPTG，25°C继续诱导培养10h。将培养液6000g离心IOmin收集菌体。B、提取将菌体重悬于40ml 结合缓冲液(20mM Tris-HCl, 500mM NaCl，IOmM 咪唑，pH7. 9)中，超声破碎菌体(16v,20min),4°C,15, OOOg离心lOmin，收集上清液，即为BcxyllOA粗提液。C、纯化将粗提液过His Bind Column (Novagen公司生产)纯化上样前用5ml结合缓冲液洗柱子；待binding buffer下降至层析介质表面,小心加入制备好的粗酶液；用10倍床体积的IXbinding buffer洗,除去未结合的杂蛋白；5倍床体积的I X wash buffer洗,除去结合较弱的杂蛋白；5倍床体积的IXelute buffer洗。约5ml,弃去最初的0. 2ml和最后的1. 8ml，收集中间的3ml (蛋白主要集中在此区域)。将收集液在AKTA FPLC系统上进行脱盐，脱盐条件为缓冲液20mM Tris-HCl,pH8. 0 ;流速3ml/min,收集蛋白峰。采用离心浓缩管(Milipore公司生产)浓缩脱盐后的样品溶液至1ml，上样到Superdex 75 10/300GL柱(GE公司产品)进行分子筛层析，平衡缓冲液为20mMTris-HCl (含 0. 15M NaCl，pH8. 0)，流速 0. 3ml/min，收集各个蛋白峰的样品，SDS-PAGE鉴定各个洗脱峰的样品，保留含有BcxyllOA的样品(洗脱柱体积为9. 78ml时开始出现该产品)。以重组菌BL21 (DE3) /pET28a和BL21 (DE3)为对照。将纯化产物进行SDS-PAGE电泳分析，结果见图1，1:分子量Marker ；2 BL21(DE3)/pET28a裂解物上清；3 :粗酶液；4 :过镍柱纯化结果；5 :分子筛纯化结果；泳道3-5有大小约为45kD (请提供)的蛋白，比理论值偏大(因重组蛋白的N端和C端含有载体上的一段His标签)，纯化产物为Bcxyl 10A。重组菌BL21 (DE3) /pET28a和BL21 (DE3)为对照，未得到大小为45kD的目标蛋白，其洗脱产物分别为对照纯化产物I和对照纯化产物2。2)木聚糖酶的活性测定对上述步骤I)获得的纯化产物、对照纯化产物I和对照纯化产物2分别进行酶活检测。将I个酶活单位(U)定义为一定条件下，每分钟产生Iumol木糖所需要的酶量为
一个单位。酶活测定的反应体系如下将0. 5g山毛榉木聚糖(Xylan from beechwood,sigma, X4252)溶于100ml浓度为50mM，pH7. 0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，得到xylan底物溶液；取480 u I上述xylan底物溶液，分别与20 U I浓度为0. 05mg/ml的上述步骤I)获得的纯化产物BcxyllOA、对照纯化产物I和对照纯化产物2混合均匀，40°C反应IOmin后，加入等体积DNS试剂，然后再煮沸5min显色。即时冷却后，取200 yl，测试540nm处的吸光值。实验设三次重复，结果取平均值，结果表明，上述步骤I)获得的纯化产物BcxyllOA的酶平均比活力为84. 5u/mg (mg为酶的干重)。而对照纯化产物I和对照纯化产物2酶的平均比活力均为0，进一步证明步骤I)获得的纯化产物Bcxyll OA为木聚糖酶。
3、酶学性质表征下述实验均为重复三次，结果取平均值。A、最适酶促反应温度的测定取480 ill上述步骤2的2)的xylan底物溶液，加入20 U I浓度为0. 05mg/ml的上述步骤2的I)获得的木聚糖酶BcxylllA，混合均匀后分别在20°C、25°C、30°C、35°C、40 V、45°C、50 V、55°C、60 V和65°C下，按照上述步骤2的2)的酶活测定方法测定木聚糖酶BcxyllOA在不同温度下的酶活，以确定最适酶促反应温度。结果如图2所示，可以看出最适温度为40°C，将酶在40°C时的活性设定为100%，则在20-50 V之间，相对活性达50 %以上。在25 °C时具有80 %的酶活，属于低温酶。B、最适酶促反应pH值的测定将山毛榉木聚糖分别溶于50mM下述缓冲液中Na2HP04/citricacid(pH4. 6-7. 6)，，Tris/HCl(pH 7.6-8.8)和 glycine/NaOH(pH 8. 8-10. 4)中，配制不同pH值的0.5%的xylan底物溶液。取480 上述不同pH值的xylan底物溶液，加入20浓度为0. 05mg/ml的上述步骤2 的I)获得的木聚糖酶Bcxyl 10A，混合均匀后在40°C下，按照上述步骤2的2)的酶活测定方法测定木聚糖酶BcxyllOA在不同pH条件下的酶活，以确定最适酶促反应的pH值。结果如图3所示，可以看出酶的最适pH值为7.0，将酶在pH7.0时的活性设定为100%，则在pH6-8. 4之间，相对活性达50%以上。C、热稳定性的测定将上述步骤2的I)获得的木聚糖酶BcxyllOA用50mM pH6的Na2HP04/citric acid缓冲液稀释至终浓度为0. 05mg/ml，将上述酶液分别在40°C保温10min、20min和30min，然后按照上述步骤2的2)的酶活力测定方法测定木聚糖酶BcxyllOA的残余酶活力，以测定上述木聚糖酶BcxyllOA的热稳定性。结果如图4所示，可以看出，BcxyllOA热稳定性较差，在pH 6. 0的条件下，40°C保温10min、20min和30min，残余酶活分别达起始酶活的62. 2%,32. 5%和22. 8%0D、pH 稳定性将上述步骤2的I)获得的木聚糖酶BcxyllOA用50mM的不同缓冲液[Na2HPO4/citric acid (pH 4. 0-7. 6), Tris/HCl (pH 7.6-8.8)和 glycine/NaOH(pH 8.8-10.4)]稀释至终浓度为0. 05mg/ml，置于4°C存放24h，然后按照上述步骤2的2)的酶活力测定方法测定木聚糖酶BcxyllOA的残余酶活力，以测定木聚糖酶BcxyllOA的pH稳定性。结果如图5所示,可以看出，BcxyllOA具有广泛的pH稳定性,在pH6时最稳定,在pH5. 6-9. 6温浴24h后，残余酶活达80%以上，但是高于9. 6或低于5. 6时酶活损失严重。E、对盐离子抗性测试将上述步骤2的I)获得的木聚糖酶BcxyllOA分别在含有不同浓度的NaCl (0-4M)的0. 5%山毛榉木聚糖底物的Na2HP04/citric acid缓冲液(50mM, pH7. 0)溶液中，按照上述步骤2的2)的酶活力测定方法测定木聚糖酶BcxyllOA的残余酶活力，以测定上述木聚糖酶BcxyllOA对高盐的抗性。结果如图6所示，可以看出，在含0.5M NaCl的底物中，活性最高，达134. 5%。F、对盐离子的耐受性测试
将上述步骤2的I)获得的木聚糖酶BcxyllOA置于不同浓度的NaCl (0-4M)的Na2HP04/citric acid缓冲液(50mM, pH6. 0)中，4°C放置24h后取样，按照上述步骤2的2)的酶活力测定方法测定木聚糖酶BcxyllOA的残余酶活力，以考察上述木聚糖酶BcxyllOA在高盐条件下的耐受性。结果如图7所示，可以看出，此酶在高达4M NaCl的高盐条件下，仍具有47. 4%的残余酶活，24h温育后仍具有87. 4%和50. 3%的残余酶活。三次重复实验，结果表明，上述步骤2的I)获得的木聚糖酶BcxyllOA的最适反应温度为40°C，在25°C时具有80%的酶活，属于低温酶；最适反应pH值为7.0 ;BcXyllOA热稳定性较差，在pH 6. 0的条件下，40°C保温10min、20min和30min，残余酶活分别达62. 2%、32. 5%和22. 8%咖1711(^具有广泛的？11稳定性，在？册时最稳定，在pH5. 6-9. 6温浴24h后，残余酶活达80%以上，但是高于9. 6或低于5. 6时酶活损失严重。此木聚糖酶在含0. 5MNaCl的底物中，活性最高，达134. 5%，而0. 5M NaCl正是海水的盐度。此酶在高达4M NaCl的高盐条件下，仍具有47. 4%的残余酶活。同时，此内切木聚糖酶在2M NaCl和4M NaCl中，24h温育后仍具有87. 4 %和50. 3 %的残余酶活。实验数据表明，木聚糖酶Bcxyl IOA属于低温酶，具有良好的盐耐 受性，在海产品或腌制食品加工生产中具有应用前景。
权利要求
1.一种蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质 (a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有木聚糖酶功能的由(a)衍生的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述编码基因为如下1)-3)中任一所述的DNA分子 1)序列表中的序列I所示的DNA分子； 2)在严格条件下可与I)限定的DNA序列杂交且编码具有木聚糖酶功能所述蛋白的DNA分子； 3)与I)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且编码具有木聚糖酶功能所述蛋白的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于所述重组载体为在pET载体的多克隆位点间插入权利要求1所述蛋白的编码基因得到的重组载体；所述PET载体优选为载体pET28a0
6.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于所述重组菌是将权利要求5所述的重组载体导入到大肠杆菌BL21 (DE3)中得到的重组菌。
7.扩增权利要求2或3所述基因的全长或其任一片段的引物对，所述引物对的一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列3，所述引物对中的另一条弓I物的核苷酸序列为序列表中的序列4。
8.权利要求1所述的蛋白作为木聚糖酶的应用； 或权利要求1所述的蛋白在海产品或腌制食品加工中的应用。
9.一种制备木聚糖酶的方法，包括如下步骤发酵培养权利要求4或6所述的重组菌，即得到木聚糖酶。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述培养温度为25°C，所述培养的时间为 IOh0
全文摘要
本发明公开了一种耐盐木聚糖酶及其编码基因与应用。该蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有内切葡聚糖酶功能的由(a)衍生的蛋白质。本发明的实验证明，本发明的内切木聚糖酶具有较低的最适反应温度，在高盐中稳定性和抗逆性较高，具有较高的比活力，因此在海产品或腌制产品加工中具有较好的应用前景。
文档编号C12N15/56GK103060289SQ201110317110
公开日2013年4月24日 申请日期2011年10月18日 优先权日2011年10月18日
发明者马延和, 柏文琴, 薛燕芬 申请人:中国科学院微生物研究所