专利名称：高纯度延胡索乙素的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种单体生物碱的制备方法，尤其涉及一种高纯度延胡索乙素的制备方法。
背景技术：
延胡索又称延胡、元胡或玄胡，生于丘陵草地。主产浙江、江苏、山东，河北亦有栽培。延胡索对气血凝滞造成的各种疼痛，如妇女月经不畅、经闭、子宫肌瘤、产后瘀血及跌打损伤等引发的疼痛均可使用，其疗效宽广、作用快捷。在临床中，与小茴香等配伍，适用于疝气痛；与当归、白芍、莪术、木香等配伍可治疗痛经、经闭；与当归、桂枝、赤芍等配伍用于四肢或周身血滞疼痛；配伍川芎、乳香、没药等用于跌打损伤。
延胡索主含多种生物碱，总含量0.4％～0.6％，已知有延胡索甲素(d-紫堇碱，d-corydaline)0.12％、延胡索乙素(四氢巴马亭，dl-tetrahydropalmatine)0.05％、延胡索丙素(原阿片碱，普托品，protopine)、延胡索丁素(l-四氢黄连碱，l-tetrahydrocoptisine)、延胡索戊素(dl-四氢黄连碱)、延胡索己素(l-四氢古伦胺碱，l-tetrahydrocolumbamine)、黄连碱(coptisine)、去氢紫堇碱(dehydrocorydaline)、紫堇单酚碱(corydalmine)等约20种生物碱。
结构式如下
R1 R2 R3 R4 R5延胡索甲素CH3CH3CH3CH3CH3延胡索乙素CH3CH3CH3CH3H延胡索丁素-CH3- -CH3- H延胡索己素H CH3CH3CH3H延胡索庚素CH3H CH3CH3CH3紫堇单酚碱CH3CH3CH3H H R1 R2 R3 R4 R5去氢延胡索甲素CH3CH3CH3CH3CH3黄连碱-CH3- -CH3- H非洲防己碱H CH3CH3CH3H延胡索丙素(普托品)其中延胡索乙素镇痛效果明显，适用于内科疾病引起的钝痛，如头痛、月经痛及分娩痛等。止痛的同时对子宫活动、产程及胎儿呼吸几乎没有影响。另外，它还能镇静催眠，可用于失眠，且服用后无头昏、眩晕等不适。
延胡索块茎中各种生物碱共同存在，由于这些化合物结构相似、极性相近，因而分离工作较为困难。单体生物碱的分离多是采用如下方法先用有机溶剂，如乙醇提取获得粗提物，得到的粗提物中含有大量其他杂质，生物碱含量较低。然后酸水溶解，过滤，碱水碱化后用有机溶剂，如乙醚，氯仿萃取，经过氧化铝柱层析得到单体的生物碱。这种方法操作复杂，步骤冗长，样品吸附损耗大。
高速逆流色谱技术(High-Speed Countercurrent Chromatography，HSCCC)是近30年发展起来的一种连续的无需任何固体支持物的高效、快速的液液分配色谱分离技术，它避免了固态支持体或载体带来的各种问题样品容易被吸附、损耗和变性，HSCCC保证较高峰型分辨率、分离量大、样品无损耗、回收率高、分离环境缓和、节约溶剂。高速逆流色谱仪能直接分离大量粗提物样品或合成混合物，分离结果能够达到相当高的纯度。因此，HSCCC具有操作简便，理论回收率为100％，重现性好和分离效率高、分离量较大的特点，已广泛应用于生物、医药、环保等领域化学物质的制备分离和纯化。
目前，还没有利用HSCCC来制备高纯度的延胡索乙素。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种高纯度延胡索乙素的制备方法，其克服了固态支持物或载体不可逆吸附、损耗和变性，使分离回收率提高，且节约溶剂、操作简便。
为解决上述技术问题，本发明一种高纯度延胡索乙素的制备方法，其采用高速逆流色谱技术，包括以下步骤制备延胡索粗提物作为进样物；配制构成固定相、流动相的溶剂体系；使逆流色谱仪柱子中充满固定相；然后使其主机转动，再将流动相泵入柱内，或是固定相和流动相同时泵入柱内，再转主机；由进样阀进样；根据检测器谱图接收目标成份，经分离后可得到延胡索乙素，所述的溶剂体系是四个组分(A，B，C，D)，A组分为正构烷烃，B组分为脂肪醚或脂肪脂，C组分为脂肪醇或脂肪酮，D组分为水或碱性、酸性溶剂。
所述的正构烷烃可选自石油醚、正庚烷或正己烷；所述的脂肪醚或脂肪脂可选自乙醚、乙酸乙酯、氯仿或二氯甲烷；所述的脂肪醇或脂肪酮可选自甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮或丁酮。
由于生物碱的特殊性，即呈游离状态下的生物碱极性较小，与酸结合成盐的情况下极性较大，加入少量的碱性或酸性试剂以提高分离度，使纯度增加。故根据UV检测器检测的出峰时间(从开始进样到紫外检测到所需物质达到最大值的时间为出峰时间)和分离度，加入0.5％碱性或酸性溶剂，如三乙胺，氨水，稀盐酸，稀醋酸等。
溶剂体系中A，B，C，D四组组分的体积比依次为(0-5)∶(3-15)∶(0-8)∶(1-5)，例如2∶3∶3∶4；1∶5∶3∶2；1∶3∶2∶1等。当其中的A组分和C组分的比例变为0时，溶剂体系可以为乙酸乙酯-水体系。溶剂体系优选石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水体系。上述体系以上相为固定相，下相为流动相，均可用于经过一次分离从延胡索粗提物中分离延胡索乙素组分。
本发明适合温度15-30℃，在上述温度范围内，温度较低时，出峰时间略有提前，分离效率变化不大，对峰形无多大影响。
按体积比将溶剂体系置于分液漏斗中，摇匀静置分层。待平衡一定时间后，将上相(固定相)和下相(流动相)分开，采用TBE-300型高速逆流色谱仪，柱容积119ml，进样圈为10ml，KTA purifier P-900泵，UV检测器，HX-1050恒温循环器。流动相进样前，先用固定相充满整个柱子，调整主机转速为700-999rpm，以1.0-2.5ml/min的流速将流动相泵入柱内；或者固定相和流动同时泵入柱内，待溶剂充满整个柱子后，调整主机转速为700-999rpm。
主机转速越高，固定相保留率越高，但转速越高，越易产生乳化现象。当转速在800-999r/min范围内，分离效果较好，在此范围内改变转速，对结果无太大影响，故优选900r/min。
流动相流速越小，固定相保留值越高，分离效果好，当流速在1-1.5mL/min范围内，分离效果较好，当流速为1.2mL/min，分离度最佳，故优选流速为1.2ml/min。
本发明制备步骤包括有一个体系。经过体系的一次分离后收集到的延胡索乙素的馏分蒸干后，经过有机溶剂和水的混合溶剂结晶，可得到延胡索乙素的白色片状结晶。经过高效液相检测，纯度在95％以上。所述的有机溶剂优选稀甲醇。
本发明具有以下有益效果本发明方法采用了高速逆流色谱分离技术，是一种连续的无需任何固体支持物的高效、快速的液液分配色谱分离技术，它克服了固态支持物或载体不可逆吸附、损耗和变性，使被分离物回收率高。又因为采用优选的溶剂体系，控制温度、调整主机转速和流动相流速等工艺条件，可以高效率地分离、获得高纯度的延胡索乙素(达到95％以上)。并且适合从各种工艺途径制备的延胡索提取物。保证较高峰形分辨度，分离量大、回收率高、分离环境缓和、节约溶剂、操作简便。
图1是本发明实施例1的HSCCC-UV检测图谱；图2是本发明实施例2的HSCCC-UV检测图谱；图3是本发明实施例3的HSCCC-UV检测图谱；图4是本发明实施例4的HSCCC-UV检测图谱；
图5是本发明实施例5的HSCCC-UV检测图谱；图6是本发明实施例6的HSCCC-UV检测图谱；图7是本发明实施例7的HSCCC-UV检测图谱。
具体实施例方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述实施例1将延胡索粉碎为粗粉，取200g粗粉加人600ml 70％乙醇，回流提取3小时后，过滤，旋转蒸干，得棕黑色浸膏备用。
从体系中选取石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水在半制备型高速逆流色谱仪上来分离制备延胡索乙素。按16∶31∶19∶21体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相(固定相)和下相(流动相)分开，实验条件温度25℃。采用TBE-300A型高速逆流色谱仪，配有KTA purifier P-900泵，UV检测器，HX-1050恒温循环器。称取100mg进样物溶于20ml流动相中待用。进样前，用固定相存满整个柱子，调整主机转速为900rpm，以1.2ml/min的流速将流动相泵入柱内直至建立动态平衡，由进样阀进样；然后根据280nm的UV值检测图谱，接收目标成分。HSCCC-UV图谱如图1所示，其中，峰5为延胡索乙素。目标馏分蒸干后用稀甲醇结晶可得到延胡索乙素的白色片状结晶，经过HPLC-UV的检测，纯度在95％以上。
实施例2将延胡索粉碎为粗粉，取200g粗粉加人600ml 70％乙醇，回流提取3小时后，过滤，旋转蒸干，得棕黑色浸膏备用。
从体系中选取正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水在半制备型高速逆流色谱仪上来分离制备延胡索乙素。按2∶4∶3∶2体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相(固定相)和下相(流动相)分开，实验条件温度25℃。采用TBE-300A型高速逆流色谱仪，配有KTA purifier P-900泵，UV检测器，HX-1050恒温循环器。称取100mg进样物溶于20ml流动相中待用。进样前，用固定相存满整个柱子，调整主机转速为700rpm，以1.2ml/min的流速将流动相泵入柱内直至建立动态平衡，由进样阀进样；然后根据280nm的UV值检测图谱，接收目标成分。HSCCC-UV图谱如图2所示，其中，峰3为延胡索乙素。目标馏分蒸干后用稀甲醇结晶可得到延胡索乙素的白色片状结晶，经过HPLC-UV的检测，纯度在95％以上。
实施例3将延胡索粉碎为粗粉，取200g粗粉加人600ml 70％乙醇，回流提取3小时后，过滤，旋转蒸干，得棕黑色浸膏备用。
从体系中选取正庚烷-乙醚-异丙醇-三乙胺在半制备型高速逆流色谱仪上来分离制备延胡索乙素。按5∶15∶8∶5体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相(固定相)和下相(流动相)分开，实验条件温度15℃。采用TBE-300A型高速逆流色谱仪，配有KTA purifier P-900泵，UV检测器，HX-1050恒温循环器。称取100mg进样物溶于20ml流动相中待用。进样前，用固定相存满整个柱子，调整主机转速为850rpm，以1mL/min的流速将流动相泵入柱内直至建立动态平衡，由进样阀进样；然后根据280nm的UV值检测图谱，接收目标成分。HSCCC-UV图谱如图3所示，其中，峰2为延胡索乙素。目标馏分蒸干后用稀甲醇结晶可得到延胡索乙素的白色片状结晶，经过HPLC-UV的检测，纯度在95％以上。
实施例4将延胡索粉碎为粗粉，取200g粗粉加人600ml 70％乙醇，回流提取3小时后，过滤，旋转蒸干，得棕黑色浸膏备用。
从体系中选取石油醚-氯仿-丙酮-0.5％氨水在半制备型高速逆流色谱仪上来分离制备延胡索乙素。按2∶3∶3∶4体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相(固定相)和下相(流动相)分开，实验条件温度30℃。采用TBE-300A型高速逆流色谱仪，配有KTA purifier P-900泵，UV检测器，HX-1050恒温循环器。称取100mg进样物溶于20ml流动相中待用。进样前，用固定相存满整个柱子，调整主机转速为999rpm，以2.5mL/min的流速将流动相泵入柱内直至建立动态平衡，由进样阀进样；然后根据280nm的UV值检测图谱，接收目标成分。HSCCC-UV图谱如图4所示，其中，峰5为延胡索乙素。目标馏分蒸干后用稀甲醇结晶可得到延胡索乙素的白色片状结晶，经过HPLC-UV的检测，纯度在95％以上。
实施例5将延胡索粉碎为粗粉，取200g粗粉加人600ml 70％乙醇，回流提取3小时后，过滤，旋转蒸干，得棕黑色浸膏备用。
从体系中选取石油醚-二氯甲烷-丁酮-稀盐酸在半制备型高速逆流色谱仪上来分离制备延胡索乙素。按1∶5∶3∶2体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相(固定相)和下相(流动相)分开，实验条件温度25℃。采用TBE-300A型高速逆流色谱仪，配有KTA purifier P-900泵，UV检测器，HX-1050恒温循环器。称取100mg进样物溶于20ml流动相中待用。进样前，用固定相存满整个柱子，调整主机转速为800rpm，以1mL/min的流速将流动相泵入柱内直至建立动态平衡，由进样阀进样；然后根据280nm的UV值检测图谱，接收目标成分。HSCCC-UV图谱如图5所示，其中，峰4为延胡索乙素。目标馏分蒸干后用稀甲醇结晶可得到延胡索乙素的白色片状结晶，经过HPLC-UV的检测，纯度在95％以上。
实施例6将延胡索粉碎为粗粉，取200g粗粉加人600ml 70％乙醇，回流提取3小时后，过滤，旋转蒸干，得棕黑色浸膏备用。
从体系中选取石油醚-乙酸乙脂-甲醇-稀醋酸在半制备型高速逆流色谱仪上来分离制备延胡索乙素。按1∶3∶2∶1体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相(固定相)和下相(流动相)分开，实验条件温度25℃。采用TBE-300A型高速逆流色谱仪，配有KTA purifier P-900泵，UV检测器，HX-1050恒温循环器。称取100mg进样物溶于20ml流动相中待用。进样前，用固定相存满整个柱子，调整主机转速为999rpm，以1.5mL/min的流速将流动相泵入柱内直至建立动态平衡，由进样阀进样；然后根据280nm的UV值检测图谱，接收目标成分。HSCCC-UV图谱如图6所示，其中，峰5为延胡索乙素。目标馏分蒸干后用稀甲醇结晶可得到延胡索乙素的白色片状结晶，经过HPLC-UV的检测，纯度在95％以上。
实施例7将延胡索粉碎为粗粉，取200g粗粉加人600ml 70％乙醇，回流提取3小时后，过滤，旋转蒸干，得棕黑色浸膏备用。
从体系中选取乙酸乙脂-水在半制备型高速逆流色谱仪上来分离制备延胡索乙素。按3∶1体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相(固定相)和下相(流动相)分开，实验条件温度25℃。采用TBE-300A型高速逆流色谱仪，配有KTApurifier P-900泵，UV检测器，HX-1050恒温循环器。称取100mg进样物溶于20ml流动相中待用。进样前，用固定相存满整个柱子，调整主机转速为999rpm，以1.5mL/min的流速将流动相泵入柱内直至建立动态平衡，由进样阀进样；然后根据280nm的UV值检测图谱，接收目标成分。HSCCC-UV图谱如图7所示，其中，峰4为延胡索乙素。目标馏分蒸干后用稀甲醇结晶可得到延胡索乙素的白色片状结晶，经过HPLC-UV的检测，纯度在95％以上。
权利要求
1.一种高纯度延胡索乙素的制备方法，其采用高速逆流色谱技术，包括如下步骤制备延胡索粗提物作为进样物；配制构成固定相、流动相的溶剂体系；使逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后使其主机转动，再将流动相泵入柱内，或是固定相和流动相同时泵入柱内，再转主机；由进样阀进样；根据检测器谱图接收目标成份，经分离后可得到延胡索乙素，其特征在于所述的溶剂体系是四个组分(A，B，C，D)，A组分为正构烷烃，B组分为脂肪醚或脂肪脂，C组分为脂肪醇或脂肪酮，D组分为水或碱性、酸性溶剂。
2.根据权利要求1所述的高纯度延胡索乙素的制备方法，其特征在于所述的正构烷烃为石油醚、正庚烷或正己烷；所述的脂肪醚或脂肪脂为乙醚、乙酸乙酯、氯仿或二氯甲烷；所述的脂肪醇或脂肪酮为甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮或丁酮；所述的碱性、酸性溶剂为三乙胺、氨水、稀盐酸或稀醋酸。
3.根据权利要求1所述的高纯度延胡索乙素的制备方法，其特征在于所述的溶剂体系中A，B，C，D四组组分的体积比依次为(0-5)∶(3-15)∶(0-8)∶(1-5)。
4.根据权利要求1至3任一项所述的高纯度延胡索乙素的制备方法，其特征在于所述的A组分为石油醚，所述的B组分为乙酸乙酯，所述的C组分为甲醇，所述的D组分为水。
5.根据权利要求1所述的高纯度延胡索乙素的制备方法，其特征在于所述制备步骤中，温度是15-30℃，主机转速是700-999rpm，流动相泵入柱内的流速为1.0-2.5ml/min，进样量为1-100mg/ml。
6.根据权利要求5所述的高纯度延胡索乙素的制备方法，其特征在于所述的主机转速是800-999rpm，所述的流动相流速为1.0-1.5ml/min。
7.根据权利要求6所述的高纯度延胡索乙素的制备方法，其特征在于所述的主机转速是900rpm，所述的流动相流速为1.2ml/min。
8.根据权利要求1所述的高纯度延胡索乙素的制备方法，其特征在于经过分离后得到的延胡索乙素的馏分蒸干后，经过有机溶剂和水的混合溶剂结晶，可得到延胡索乙素的白色片状结晶。
9.根据权利要求8所述的高纯度延胡索乙素的制备方法，其特征在于所述的有机溶剂为稀甲醇。
全文摘要
本发明公开了一种高纯度延胡索乙素的制备方法，其采用高速逆流色谱技术，包括如下步骤制备延胡索粗提物作为进样物；配制构成固定相、流动相的溶剂体系；使逆流色谱仪柱子中充满固定相；然后使其主机转动，再将流动相泵入柱内，或是固定相和流动相同时泵入柱内，再转主机；由进样阀进样；根据检测器谱图接收目标成份，经分离后可得到延胡索乙素，所述的溶剂体系是四个组分(A，B，C，D)，A组分为正构烷烃，B组分为脂肪醚或脂肪脂，C组分为脂肪醇或脂肪酮，D组分为水或碱性、酸性溶剂。本方法可获得纯度高达95％以上的延胡索乙素。该方法简便易行，回收率高，易于推广使用。
文档编号A61P25/04GK1982310SQ20051011154
公开日2007年6月20日 申请日期2005年12月15日 优先权日2005年12月15日
发明者沈平孃, 张继全, 刘志远, 俞雁 申请人:上海中药制药技术有限公司, 国家中药制药工程技术研究中心