专利名称：具有增强美白作用的人参发酵提取物的制备方法
技术领域：
本发明涉及人参发酵提取物的制备方法，以及该提取物用于化妆品的用途。
背景技术：
人参属于五加科人参属的多年生草本植物，全球约有11种，代表性的人参种有高 _ 参(/kaaz ginseng C. A. Meyer ) >(.Panax quinquefolium L.)、三七参(/ : notoginseng F. H.)、珠子参0 ^ japonicas C. A. Meyer)等。从中药炮制学和功效而言，人参可分为生晒参、红参、野山参和西洋参。人参喜阴凉、湿润的气候，多生长于昼夜温差小的海拔500 1100米山地缓坡或斜坡地的针阔混交林或杂木林中。由于根部肥大，形若纺锤，常有分叉，全貌颇似人的头、手、足和四肢，故而称为人参。“神农本草经”中就被分类为高级品，一直作为贵重的滋补品延续到现在。“本草纲目”中提到，人参主治补五脏，安精神，定魂魄，止惊悸，除邪气，明目开心益智，久服轻身延年。现代医学中，很多药理学实验都表明人参加强了人体对压力的非特异性抵抗力， 还有抗酸作用等其他药理功效。在化妆品研究中，人参挥发油可通过皮肤的渗透作用为人体所吸收，从而促进血液循环和新陈代谢，增进肌肤细胞的发育营养和光泽，具有防皱和抗寒冷与紫外线辐射作用。人参皂苷能显著抑制肝组织和血液中过氧化脂质(LPO)的形成， 并提高红细胞中SOD的活性，以延缓细胞衰老，使容颜常驻。人体皮肤衰老的主要原因是血液循环不良，新陈代谢降低，皮肤弹性减弱。由于人参中含有多种人参皂苷、氨基酸、维生素及矿物质，具有促进皮下组织血管的血液循环，增加皮肤的营养供应，调节皮肤水分平衡等作用。所以它能延缓皮肤衰老，防止皮肤干燥脱水，增加皮肤塔宁，从而起到保护皮肤光泽柔嫩，防止和减少皮肤皱纹的作用。人参成分还具有抑制黑色素还原性能，使皮肤洁白光滑。色素沉着性皮肤病如雀斑(遗传性)、黄褐斑(内分泌性)、晒斑(炎症性)、瑞尔黑变病(代谢性)等因影响美观，越来越多的患者迫切要求治疗，因而产生大量的美白祛斑产品， 其中中药美白产品以其独特的优势(安全，刺激性小，副作用小)倍受欢迎。一直以来，美白祛斑都是人们所热切关注的话题。东方人希望通过美白护理品的使用而得到白皙、光洁的皮肤，而欧美消费者主要利用功能型美白化妆品来减轻老年斑、黄褐斑等色素沉积。美白祛斑化妆品的诞生不但解决了东西方人对美的追求，而且给美容业带来了巨大的经济效益，使得美白祛斑剂作为功能性原料普遍使用。近年来，皮肤美白类化妆品市场日趋活跃，产品销售与日俱增，已成为护肤类化妆品的主流品种之一。然而，汞、 砷、铅等重金属在化妆品中的长期滥用也给化妆品行业乃至人类带来了诸多负面效应，如神经衰弱、乏力、失眠、烦躁(汞)，或者色素沉着、疼痛(砷)和便秘、贫血(铅)等症状，均极大地危害着人类健康。随着人们生活水平和审美标准的提高，化妆品安全问题已经在全球范围得到广泛关注，禁止在化妆品生产中使用重金属的呼声越来越高。美白祛斑剂的开发和应用研究不断深入，市场上新的功效高、易于配伍的原料不断推出。古代人民在长期的生活实践中总结出大量利用植物进行美容的知识[1]。利用植物的根、茎、皮、叶、花、果等物质作用于皮肤组织后，通过新陈代谢，产生维生素等物质参与色素代谢，达到美白目的。各国对皮肤美白剂作用、新的美白剂的开发和美白剂的应用投入了大量的人力、物力，并取得了明显的进展。 目前已有许多皮肤美白剂问世，如早期的纯化学物氯化氨基汞、过氧化氢及氢醌，中期的果酸和近期的天然植物提取物，如熊果苷、VitC衍生物、甘草提取物、曲酸及其衍生物以及内皮素拮抗剂等。美容业发达的美、法两国都不敢放松对化妆品的监管，我国同样不能掉以轻心，对化妆品的监管措施也逐步严格起来。因此，寻求开发天然、绿色和环保的美白祛斑剂， 成为美容业关注的重点。黑素由黑素细胞产生，是决定人体肤色的主要色素。研究表明，不同种族的人群皮肤组织中黑素细胞的数目大体上相同，但黑素小体的数量、大小、分布及黑素化程度存在明显差异[4]。天然植物美白的机理主要是通过抑制黑素合成、成熟、转运、降解、排出等多个环节，如抑制黑素细胞产生黑素，减少表皮内的黑素颗粒，到达美白祛斑的效果。具体地讲就是抑制黑素生成所需的酶(主要是酪氨酸酶)、破坏黑素细胞、还原多巴醌等方式。如中药乌梅、桂皮、蔓荆子、山茱萸、夏枯草、白头翁、附子、黄连、益母草、皂荚等。桑白皮、地榆、苦参、 金银花、甘草、川芎、车前子、茯苓、芦荟、熟地黄、五倍子、蝉衣、牡丹皮、苦参、珍珠绣线菊、 苍耳子、桑树根皮(鲜)、大黄(生)、六月雪、泥湖菜、地骨皮、炒川断、天麻、连翘、茶条槭、败酱草、黄杨、双花、桑叶、芦荟等对酪氨酸酶活性有抑制作用]。日本学者Akazawa研究发现， 槭树科(Aceraceae)树皮提取物具有潜在的抑制黑素形成和清除自由基功效。壬二酸及其衍生物能选择性对异常活跃的黑素细胞有抗增殖作用，阻滞酪氨酸酶蛋白的合成，但对功能正常的黑素细胞作用较小。郭树忠等[14]观察川芎嗪对体外培养的黑素细胞的抑制作用， 发现川芎嗪对黑素细胞的增殖有抑制作用，能使细胞数明显减少，黑素合成显著下降，酪氨酸酶活性逐渐减弱；黑素小体明显减少，揭示川芎嗪抑制黑素细胞增殖、黑素合成及酪氨酸酶活性。过量紫外线照射是造成皮肤变黑，引发、加重色素沉着的主要原因。因为紫外线引起的应激反应使活性黑素细胞数量增加，并激活酪氨酸酶活性和内皮素，促进黑素的形成， 皮肤由此变黑，局部黑素又经由细胞代谢的层层移动，到了肌肤表皮层会形成雀斑、晒斑、 黑斑等。长期日晒促使皮肤衰老退化和导致产生皮肤癌，故防UVA光段伤害的重要性也越来越受到重视。近年来，已经发现天然植物芦荟具有吸收紫外线作用，它的有效成分芦荟苷可强烈吸收范围(290 320 nm)内紫外光，并有保湿、调理皮肤的功能。研究结果表明，芦荟汁、凝胶和皮，均有一定的防晒作用，它们的防晒效果是凝胶〉汁〉皮，是一种较好的天然防晒剂。黑素细胞分泌的呈现氧化状态的黑素称为氧化型黑素，它具有明显的黑色，如果将黑素加以还原，则变为无色的还原型色素。还原剂主要指草药中含有的维生素C、维生素E及其衍生物等。Jones等]报道芦荟苦素是酪氨酸酶的混合性抑制剂，并可抑制多巴的自身氧化，对细胞形态无影响，防止或减少黑素的生成及沉着，所以具有一定的美白效果。目前，已明确的草药中具有美白效果的活性成分主要有①氢醌具有抑制酪氨酸酶的作用。可以人工合成，也可以从天然植物中提取，据报道，天然萃取的产品更具生物活性，祛斑美白的效果更为明显。但由于氢醌的不稳定性(易氧化)及对皮肤较大的毒性(如形成永久性白斑等)，这种皮肤刺激作用与氢醌浓度相关，目前国内外均倾向于用低浓度氢醌或复方制剂治疗黄褐斑；②熊果苷可从厚叶岩白菜、人参、乌饭树、越橘、熊果和梨树的叶中萃取。熊果苷是酪氨酸酶抑制剂，低浓度即可抑制酪氨酸酶的活性，阻断多巴及多巴醌的合成，从而抑制黑素的生成。其具体机理是与L-酪氨酸在酪氨酸酶活性部位的竞争， 从而抑制酪氨酸酶的活性；③甘草提取物人们从甘草中不断提取出有效的美白成分，主要是甘草酸、甘草亭酸、甘草黄酮等。具有抑制黑素细胞生长、抑制酪氨酸酶、还原多巴醌多个环节的美白作用；④根皮素根皮素及其苷是国外新近研究开发得较多的一种新型皮肤美白剂，根皮素存在于苹果、梨等水果和多种蔬菜汁液中，在植物的根茎或根皮中含量较为集中。能抑制黑素细胞活性，对各种皮肤色斑有淡化作用；⑤原花青素可从葡萄籽、松树皮、大黄、山楂等植物中提取，可抑制酪氨酸酶的活性，将黑素的邻苯二醌结构还原成酚型结构，使色素褪色，还可抑制蛋白质氨基与核酸氨基间的美拉德反应，从而抑制脂褐素、老年斑的形成，与维生素C、维生素E间有协同作用；⑥内皮素拮抗剂内皮素拮抗剂可从德甘菊等天然植物中提取，可与表皮黑素细胞上的受体结合，阻断内皮素的促增殖分化作用，使黑素的合成速度降低，与其他活性成分相比，内皮素拮抗剂用量少，见效快，且可使色素分布均勻一致；⑦绿茶提取物含有多酚，是一类有效的抗氧化生物类黄酮，多含有活性五倍子酸基团的儿茶酚，可作用酪氨酸酶的竞争性抑制剂，还可有效抑制成熟的黑素颗粒从黑素细胞至角质形成细胞的传递；⑧果酸天然果酸中有乳酸、苹果酸、水杨酶及其衍生物，可软化角质层，脱去死皮，促进含有黑素的角质形成细胞脱落；⑨鞣花酸是从石榴果皮和树皮中提取的针状结晶物，在整个紫外线区域均有较强的吸收作用，通过吸收紫外线起防晒或清除自由基的作用。 酪氨酸酶是黑素形成过程中的一个主要的限速酶，该酶的活性大小决定着黑素形成的数量。黑素细胞以酪氨酸为原料，主要在限速酶酪氨酸酶的氧化作用下生成黑素。首先，酪氨酸在酪氨酸酶作用下被氧化成多巴，多巴又在酪氨酸酶作用下被氧化成多巴醌，多巴醌经过多巴色素-二羟基吲哚-酮式吲哚等一系列反应，最终形成黑素(优黑素或真黑素)。黑色素形成是决定哺乳动物皮肤颜色的最重要因素，抑制黑色素的形成可减少皮肤黑暗。因此，酪氨酸酶抑制剂具有潜在的治疗异常色素紊乱作用，广泛用于皮肤美白剂，其中包括熊果苷和曲酸。 红参中的酪氨酸酶抑制活性较弱。为了提高其活性，通过发酵方法制得发酵红参， 使发酵红参提取物具有较强的酪氨酸酶抑制活性。
发明内容
1.人参的发酵
申请人试图利用微生物转化方法，把不容易吸收的人参皂苷转化成容易吸收的人参皂苷，并且提高有效成分compoimd-κ、RhU Rh2, Rg5等。结果发现利用保加利亚乳酸菌进行中高温发酵后，有效成分含量提高几倍甚至几十倍。因此，本发明的目的是以人参，尤其是红参为原料，利用环保方式大量工业化生产发酵红参用于人参化妆品中。1)选取人参材料
本发明对原料无特殊限制，可以使用天然形成或人工种植人参，诸如花旗参、三七参、 高丽参、珠子参等。更进一步、可以使用人参叶、人参茎等目前无法利用的人参其他部分。再则，本发明还可以把现有红参、白参、参片、参粉等各种人参一次加工物发酵成发酵红参来提高其中有效成分，以下以红参为例进行说明。
2)制备人参发酵酶液
在配置培养液时，可利用各种蔬果当作碳源，高温杀毒后配水制成菌液培养基(一般情况下，2体积蔬果浆液加8体积蒸馏水)。利用专属发酵菌株——保加利亚乳酸菌培养增殖接种菌液培养基(利用梯度培养方法进行乳酸菌培养增殖，每个梯度培养环境为A. 1 100接种；B. 360C ；C. 6小时摇床培养；D. 4个梯度；E.最后取IL菌液接种于9L果蔬培养液中接种)、发酵广2周后，过滤留清液并封口，保存于4°C冷藏库备用即可。本发明利用保加利亚乳酸菌，乳酸菌属在进行增殖时会产生和分泌具有抑制细菌和微生物生长的光谱细菌素和乳酸，导致其生长环境为酸性，所以无需任何化学防腐剂。3)人参发酵酶液的接种
将洗净的原料(红参或其他人参加工产品)打成粉，接种于步骤2)的人参发酵酶液稀释液(Ikg粉料接种400 - 600ml人参发酵酶稀释液，人参发酵酶稀释液以1体积人参发酵酶液加200体积甘草大枣液配制，甘草大枣液的配制方法是在50L蒸馏水中加入4颗大枣和 50g甘草片)，得到接种的人参发酵酶混合物。本发明发酵人参用于化妆品原料，所以不需要保留完整的红参根，打成粉使用即可。如果要保留根的完整性，需要加倍接种量。4)发酵
a.前处理(升温阶段)
将发酵室温度调整为30°C，把接种的人参发酵酶混合物盛在容器内放入发酵室，8小时后，将发酵室温度调整为45°C，继续放置8小时。最后将发酵室温度调整为65°C，继续放置8小时。b.蒸参(恒温蒸参)
将步骤a的容器置于摇床上，把发酵室温度调整为75 85°C，持续旋转震荡发酵72 120小时，使人参粉与人参发酵酶稀释液充分发酵。5)浓缩上清液(人参发酵提取物)
把所有混合液收集，并进行过滤，获得上清液，浓缩至1/10-1/100。此浓缩液为人参发酵提取物，冷藏并在需要时取出使用即可。 整个过程无特殊要求，所使用的原料是纯天然物质，无化学合成物质，所排放物质也是无污染排放物，并且可用于饲料配料使用，是一种纯天然，无公害，安全可靠的技术。2.比较皂苷含量
以红参为实验对照，发酵红参为试验样品，利用高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)分析比较发酵前后5种红参和得到的人参发酵提取物中特有的几种代表——人参皂苷Rg3、RhU Rg5, C-K、Rh2的含量。其结果如表1所示。1)实验仪器
液相色谱仪(LC-6A日本岛津)
2)实验方法
HPLC法测定发酵人参成分
3)实验条件
色谱柱Hypersil BDS C18 4. 6 X 250mm 5ym 流动相=CH3CN - 0. 1%HC00H 溶液流速0. 8mL/min5/6页
柱温室温(25°C) 检测波长203nm 进样量:5μ L
4)实验样品
红参提取液样品、发酵红参提取液样品
5)实验结果
如表1中表示，通过微生物发酵，原料(红参)中Rg3、I hl、Rg5、C-K、I h2均有不同程度的提高(2倍 20多倍)。所以从此可推测发酵红参的美白效果会有所提高。为了更进一步确定发酵红参的美白效果，我们进行了下一个实验——酪氨酸酶的抑制活性实验。
表1发酵前后人参皂苷成分的变化
权利要求
1.人参发酵提取物的制备方法，包括人参发酵步骤和提取物的制备，其中人参发酵步骤包括选取人参材料，制备人参发酵酶液，制备人参发酵酶液稀释液，接种和发酵，所说的人参发酵酶液是利用各种蔬果高温杀毒后配水制成菌液培养基，使用保加利亚乳酸菌进行乳酸菌培养增殖接种至该菌液培养基，发酵广2周后过滤留清液并封口，冷藏备用；接种是将选取的人参材料制成粉料，每Ikg粉料接种400 - 600ml人参发酵酶液稀释液；发酵包括升温，蒸参和浓缩上清液，获得人参发酵提取物。
2.如权利要求1所述方法，其中所说的人参包括花旗参、三七参、高丽参、珠子参以及它们的叶和茎。
3.如权利要求1所述方法，其中所说的人参是红参。
4.如权利要求1所述方法，其中所说的菌液培养基是由2体积蔬果浆液加8体积蒸馏水配制而成。
5.如权利要求1所述方法，其中所说的人参发酵酶液的制备是采用梯度培养法进行乳酸菌培养增殖，每个梯度培养环境为A.1 100 接种；B.36 0C ；C.6小时摇床培养；D.4个梯度；E.最后取IL菌液接种于9L果蔬培养液中。
6.如权利要求1所述方法，其中人参发酵酶液的冷藏温度是4°C，人参发酵酶液稀释液是以1体积人参发酵酶液加200体积甘草大枣液配制而成，所说的甘草大枣液是在50L蒸馏水中加入4颗大枣和50g甘草片配制而成。
7.如权利要求1所述方法，其中人参粉和人参发酵酶液稀释液的发酵在发酵室进行， 温度30°C，发酵8小时后，升温至45°C，继续发酵8小时，再升温至65°C，发酵8小时。
8.如权利要求1所述方法，其中所说的蒸参在发酵室进行，温度为75 85°C，时间是 72 120小时。
9.如权利要求1所述方法，其中所说的浓缩上清液是将蒸参后所得到的上清液浓缩至 1/10-1/100。
10.权利要求1一 9任一项方法制备的人参发酵提取物，其用于化妆品中。
全文摘要
一种发酵人参提取物的制备方法，包括人参发酵和提取物的制备，其中人参发酵步骤包括选取人参材料、制备人参发酵酶液，制备人参发酵酶液稀释液接种和发酵，所说的人参发酵酶液是利用各种蔬果高温杀毒后配水制成菌液培养基，使用保加利亚乳酸菌进行乳酸菌培养增殖接种至该菌液培养基，发酵1~2周后过滤留清液并封口，冷藏备用；接种是将选取的人参材料制成粉料，每1kg粉料接种400－600ml人参发酵酶液稀释液；发酵包括升温，蒸参和浓缩上清液，获得人参发酵提取物。
文档编号C12N1/20GK102366373SQ20111034449
公开日2012年3月7日 申请日期2011年11月4日 优先权日2011年11月4日
发明者不公告发明人 申请人:抚松参美化妆品有限公司