专利名称：一种复合微生态制剂及其在饲料添加剂中的应用和预混料的制作方法
技术领域：
本发明属于饲用微生态技术领域，涉及一种复合微生态制剂及其在饲料添加剂中的应用和预混料。
背景技术：
目前，对动物疾病的预防和治疗药物基本仍采用抗生素，但由于长期、大量使用抗生素，致病菌耐药性增强、菌群失调、免疫力下降、疾病复发率高、药物残留等种种弊端日益严重，同时也严重危害动物机体及人类健康。在此形势下，改变养殖观念、预防重于治疗，并开发应用无毒、无药残的新型绿色饲料添加剂是必然趋势。微生态制剂室目前常用和研究较多的一种绿色、安全的饲料添加剂，此类制剂是用动物有益菌经工业化高密度发酵生产得到的，包含有很多的有益微生物及其代谢产物构成的活菌制剂，可以直接饲喂动物。微生态制剂通过维持肠道内微生态平衡而发挥作用，具有防病、增强机体免疫力、促进生长、增加体重等多种功能，且无污染，无残留，不产生抗药性，是一种绿色、安全的饲料添加剂。市场上的微生态产品种类繁多，质量参差不齐，主要存在以下几个问题(1)活菌含量低，而研究表明，如果一种菌在盲肠内容物中的浓度少于107cfu/g，则该菌产生的酶及其代谢产物不足以影响宿主，难以满足治疗需要；(2)水分含量偏高，这样使得微生态制剂的保质期大大缩短，也是影响微生态制剂质量不好的重要原因之一；(3)不耐抗生素；(4) 对胃酸和胆盐不稳定，致使只有少数菌株进入肠道后仍具有活性，达不到发挥作用所需的活菌数量。由于微生态制剂存在的这些质量问题，从而影响了其在动物饲喂中的应用效果， 限制了微生态制剂的广泛应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种包含多种全新益生菌的复合微生态制剂，此制剂包含具有耐胃酸、耐胆盐、耐高温及耐受常用抗生素等抗逆性能和产酸、产酶及抑制病原菌等益生功能的多种益生菌，制剂中各益生菌活菌含量高、水分含量低。本发明的另一目的在于提供该复合微生态制剂在制备禽畜饲料添加剂中的应用。本发明还提供了包含该复合微生态制剂的预混料。本发明的目的是通过以下技术方案实现的本发明提供一种复合微生态制剂，该制剂含有嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)CGMCC No. 5093 菌粉及地衣芽孢杆菌(Bacillus 1 icheniformis)CGMCC No. 5094、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus) CGMCC No. 4756、粪肠球菌(Enterococcus faecal is) CGMCC No. 5092、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtil is) CGMCC No. 4628 四种菌中的任二种、三种或四种的菌粉。其中，本发明的复合微生态制剂中含有嗜酸乳杆菌CGMCC No. 5093菌粉、地衣芽孢杆菌CGMCC No. 5094菌粉、短小芽孢杆菌CGMCC No. 4756菌粉和粪肠球菌CGMCC No. 5092菌粉，上述四种菌粉的重量配比为0.8-2. 5 1 0.8-1.2 1. 5-2. 5，即可制成仔猪专用型复合微生态制剂，总有益菌含量为6-10X109cfu/g。其中，本发明的复合微生态制剂中含有嗜酸乳杆菌CGMCC No. 5093菌粉、地衣芽孢杆菌CGMCC No. 5094菌粉和枯草芽孢杆菌CGMCC No. 4628菌粉，上述三种菌粉的重量配比为0.8-3. 5 1-3.5 0.8-2. 5，即可制成饲料厂母猪产品专用复合型微生态制剂，益生菌数量在 3-6X101QCfu/g。其中，本发明的复合微生态制剂中含有嗜酸乳杆菌CGMCC No. 5093菌粉、地衣芽孢杆菌CGMCC No. 5094菌粉和粪肠球菌CGMCC No. 5092菌粉，上述三种菌粉的重量配比为1.5-2.5 0.8-1.2 1，即可制成蛋鸡专用复合型微生态制剂，益生菌数量在 2-5X109cfu/g。其中，本发明的复合微生态制剂中含有嗜酸乳杆菌CGMCC No. 5093菌粉、短小芽孢杆菌CGMCC No. 4756菌粉和粪肠球菌CGMCC No. 5092菌粉，上述三种菌粉的重量配比为 2 2· 5 · 2 2· 5 · 1 1· 5。为更好的达到本发明的发明效果，本发明复合微生态制剂中所述的嗜酸乳杆菌 CGMCC No. 5093菌粉的制备方法如下按的接种量向发酵培养基中接入8h_12h菌龄的嗜酸乳杆菌种子液，发酵条件为30-40°C，转速为60-100rpm，培养12_16h，得发酵液，发酵液离心，得到菌泥，加入与菌泥的重量体积百分比为15-20%的冻干保护剂，混勻， 于-25°C -45°C冷冻干燥，即得，所述的发酵培养基的成分及其质量体积比如下葡萄糖 1-2 %，大豆蛋白胨1-2 %，酵母膏1-2 %，硫酸铵0.5-1.0%，磷酸氢二钾0. 2-0. 5 %、氯化钠 0. 2-0. 8%，硫酸镁0. 01-0. 05% ；所述的地衣芽孢杆菌CGMCC No. 5094菌粉的制备方法如下按质量体积比0. 5-2%的接种量向发酵培养基中接入10-14h菌龄的地衣芽孢杆菌种子液，发酵条件为30-40°C，转速为200-300rpm，培养15_22h，得发酵液，发酵液中加入质量体积比为20% -25%的填充物麦芽糊精，混勻，进行喷雾干燥，进风温度140-160°C，排风温度40-50°C，雾化器转速15000-18000rpm，即得，所述发酵培养基的成分及其质量体积比如下麸皮1-2 %，玉米粉0.5-1.5%，豆粕1-2 %，硫酸铵0. 5-2 %，硫酸镁0. 01-0. 05 %，柠檬酸铵0. 3-1. 2%、消泡剂0. 05-0. 1%，pH为6. 2-7. 4 ；所述的短小芽孢杆菌CGMCC No. 4756 菌粉的制备方法如下按质量体积比1-2%的接种量向发酵培养基中接入12h-16h菌龄的短小芽孢杆菌种子液，发酵条件为30-40°C，转速为100-300rpm，培养16_24h，得发酵液， 发酵液中加入质量体积比为20-25 %的填充物玉米淀粉，混勻，进行喷雾干燥，进风温度 150-170°C，排风温度40-70°C，雾化器转速15000-20000rpm，即得，所述发酵培养基的成分及其质量体积比如下葡萄糖1-2 %，大豆蛋白胨1-2 %，豆粕1-2 %，硫酸铵0. 5-1. 0 %，氯化钠 0. 2-0. 8%，硫酸镁 0. 01-0. 05%。进一步，本发明的微生态制剂还包含载体，载体为麦芽糊精、硫酸钾铝、玉米芯粉、 葡萄糖、油糠粉中的任一种或者两种。本发明的复合微生态制剂可用于制备禽畜饲料添加剂。本发明还提供了包含该复合微生态制剂的预混料，其中，预混料中复合微生态制剂添加的质量体积比为0. 5-10%0。本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)为申请人从牛肠道中分离、经定向初筛和复筛得到。其营养细胞杆状，其芽孢为椭圆或长筒形，为中生或次端生，孢囊稍膨大。孤立或呈短链，杆端半圆形。在12 16h内能形成菌落，菌落为圆形，或不规则，边缘毛发状，菌落白色，不透明，无褶皱。革兰氏阳性。申请人对此株地衣芽孢杆菌进行了耐酸性、耐胆盐、耐高温性、发酵特性和抑菌活性等实验，此株地衣芽孢杆菌具有对逆环境耐受性强、粘附性强、生长快、生物量大、抑菌活性好等特点。本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)申请人已于2011年7月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCCJia 北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 5094。本发明的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)为申请人从猪大肠中分离得到，其生物学特征如下菌落圆整，表面光滑，不透明，乳白色，边缘光滑，革兰氏阳性菌；单个菌体为球状或椭圆状。本发明的粪肠球菌经过人工胃液、胆汁液及耐热性的筛选；又经过产酶能力筛选和抑菌能力筛选，可以耐受PH2. 0，胃蛋白酶的人工胃液，可以耐受0.3%的人工胆汁液，可以耐受85°C的制粒温度，也可以抑制致病性大肠杆菌K88，K99和金黄色葡萄球菌，具有较强的产酸和抑制豆粕、棉粕、玉米秸秆中霉菌的能力。本发明的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)申请人已于2011年7月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址同上，保藏编号为CGMCC No. 5092。本发明的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)为申请人从猪粪便中分离得到，其生物学特征如下菌落圆整，表面光滑，不透明，乳白色，边缘光滑，革兰氏阳性菌； 单个菌体为杆状。本发明的嗜酸乳杆菌经过人工胃液、胆汁液及抗逆性的筛选；可以耐受 pH2.0，l%胃蛋白酶的人工胃液，可以耐受0.3%的人工胆汁液，也可以抑制致病性大肠杆菌K88，痢疾杆菌和金黄色葡萄球菌，具有较强的产酸和抑菌能力。本发明的嗜酸乳杆菌 (Lactobacillus acidophilus)申请人已于2011年7月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址同上，保藏编号为CGMCC No. 5093。本发明的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)为申请人首次在国内分离到的一株来源于动物消化道的新的短小芽孢杆菌，为申请人从牛的瘤胃中分离得到的一株芽孢杆菌优势菌株，经过生理生化及16s RNA分析鉴定，表明该菌属于短小芽孢杆菌，其分类命名为短小芽孢杆菌 (Bacillus pumilus)，已于2011年4月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址同上，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No. 4756。本发明所用的枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)为申请人从传统发酵豆豉中分离得到，其生物学特征如下菌落表面粗糙，不透明，污白色，菌落圆形，边缘呈锯齿状，革兰氏阳性菌；芽孢形态为椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。本发明的枯草芽孢杆菌显著区别于现有的枯草芽孢杆菌，可以耐受pH2.0，l%胃蛋白酶的人工胃液，可以耐受0.3%的人工胆盐，可以耐受80°C的制粒温度，可以抑制致病性大肠杆菌K88，K99和金黄色葡萄球菌，具有较强的产纤维素酶的能力，可以降解纤维素。本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)已于 2011年3月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCCJia 同上，保藏编号为CGMCC No. 4628。 本发明中所选育的地衣芽孢杆菌、粪肠球菌、枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌和短小芽孢杆菌在制备中采用液体深层高密度发酵技术和喷干或冷冻干燥等一系列的后处理加工工艺技术制成菌粉，制剂中的活菌含量高、水分含量低，具有耐胃酸、耐胆盐、耐高温及耐受常用抗生素等抗逆性能和产酸、产酶及抑制病原菌等益生功能。本发明的复合微生态制剂能够提高饲料利用率，增加肉蛋奶等产量，促进动物生长，提高动物机体免疫力和抗病能力，部分替代抗生素，从而改变动物产品的品质。通过下列实施例将更具体的说明本发明，但是应理解所述实施例仅是为了说明本发明，而不是以任何形式限制本发明的范围。
具体实施例方式实施例1、优良菌种的分离、筛选、选育及鉴定1)增菌培养将健康动物(猪或家禽)的新鲜粪便、肠道内容物样品接种于BPY液体培养集中，在37°C恒温培养增殖48h ；2)地衣芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的分离纯化对步骤1)增菌培养物100°C水浴 5min,然后在BPY培养基平板上进行划线培养，从中挑取各个具有特征形态的菌落再划线培养和分离，直至为纯菌落为止，革兰氏染色镜检，将分离的疑似纯菌落接种试管斜面中增殖，然后保存于4°C冰箱中，待用；菌落形态菌落表面粗糙，无光泽，乳白色不透明，边缘不整齐，直径2_3mm，随着培养时间的延长，变为红褐色；镜检细胞为杆菌1.6-3.8μπιΧ0. 6-1.2μπι，革兰氏阳性， 芽孢中生，椭圆形，不膨大，初步确定为芽孢杆菌；通过对这几株疑似芽孢杆菌的菌进行16SrRNA鉴定，确定地衣芽孢杆菌和短小芽孢杆菌两种。3)嗜酸乳杆菌的分离纯化对步骤1)增菌培养基在MRS培养基平板上进行划线培养，将分离的疑似纯菌落接种斜面中增殖，然后保存于4°C冰箱中，待用；菌落形态菌落圆整，表面光滑，有光泽，乳白色不透明，直径0. 5-1. 2mm,随着时间延长，颜色变暗发黄，细菌革兰氏阳性，单个菌体细长杆状。经鉴定，为嗜酸乳杆菌。4)粪肠球菌CGMCC No. 5092的筛选A、初筛取样品猪粪、牛粪和鸡粪等样品各5g，浸泡于20ml无菌0. 85%生理盐水中，震荡打散样品，使样品充分与生理盐水接触，70°C恒温水浴锅静置3分钟，取上清，5000rpm离心 10分钟，弃去上清。将离心后的菌体沉淀加入IOml人工胃液中，37°C静置2h，然后离心，收集菌体后，将菌体沉淀加入IOml人工胆盐中，37°C静置4h，收集菌体，稀释涂布于LB培养基。37°C培养箱培养12-24h后，对菌落进行纯化分离。对得到的菌进行保存，并进一步复筛。生理盐水的配制方法是0. 85%氯化钠溶液，高压灭菌后备用。人工胃液的配制方法是1 %胃蛋白酶，0. 85 %氯化钠，用浓盐酸调pH值到2. 0，经细菌过滤器过滤除菌后备用。人工胆盐的配制方法是在液体肉汤中添加0. 3%的猪胆盐(分析纯)，高压灭菌后备用。LB固体培养基的制作方法是蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠10g，琼脂1. 5%， PH7.0，高压灭菌后备用。B、复筛(1)将配置好、灭完菌的LB培养基温度冷却至45°C，加入过夜培养的大肠杆菌 K88、K99和金黄色葡萄球菌(每毫升培养基加入1微升菌液)，震荡混勻，倒入无菌平板，水平凝固后，每个平板利用四个牛津杯进行打孔，每只牛津杯中加入200 μ 1待测菌液，盖好皿盖，小心移至37°C培养箱，平皿正放静置培养。培养20h后，打开皿盖，移去牛津杯，用卡尺测量抑菌圈直径。5)枯草芽孢杆菌CGMCC No. 4628的筛选A、初筛纳豆、豆豉、腐乳、猪粪、鸡粪、牛粪等样品各5克，浸泡于20ml灭菌0.85%生理盐水，震荡打散样品，使样品充分和生理盐水接触，90°C恒温水浴锅静置10分钟，取上清5ml， 5000rpm离心10分钟，弃去上清。菌体沉淀加入IOml人工胃液中，37°C静置2小时。5000rpm 离心10分钟，弃去上清，将菌体沉淀加入IOml人工胆盐中，37°C静置4小时。震荡混勻后， 梯度稀释涂LB培养基。30°C培养箱培养12-M个小时后，纯化菌落。得到纳豆样品中分离出的Ν-1、Ν-2菌，豆豉样品中分离出的C-I (CGMCC No. 4628), C-2菌，腐乳样品中没有分离到菌落，猪粪中分离出Z-l、Z-2菌，鸡粪中分离出J-l、J-2菌，牛粪中分离出F-l、F-2菌。 初筛得到的菌株再进行进一步复筛。生理盐水的配置方法是0. 85%的氯化钠，高压灭菌后备用。人工胃液的配制方法是胃蛋白酶，0.85%的氯化钠，用浓盐酸调pH值到2.0， 细菌过滤器过滤备用。人工胆盐的配置方法是在液体肉汤中添加0. 3%的猪胆盐(分析纯)，高压灭菌后备用。LB固体培养基的制作方法是蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠10g，琼脂1. 5%， PH7.0，高压灭菌后备用。B、复筛(1)产纤维素酶能力的筛选用无菌牙签将分离纯化出的菌株在0. 5%羧甲基纤维素的LB-CMC培养基上进行点菌，30°C培养Mh，用0. 刚果红染色1小时，弃去染料，再用IM NaCl溶液洗涤1小时， 根据菌落周围有无出现水解透明圈，测定透明圈与菌落直径，计算透明圈直径与菌落直径比值(H/C)，发现N-I、C-I (CGMCC No. 4628)、C-2的水解透明圈较大，其中C-I的水解透明圈最大(表1)。LB-CMC培养基的配置方法是羧甲基纤维素0. 5%，胰化蛋白胨10g，酵母提取物 5g,氯化钠10g，高压灭菌20min。表1水解透明圈与菌落直径比值(M/C)
权利要求
1.一种复合微生态制剂，其特征在于该制剂含有嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus) CGMCC No. 5093 菌粉及地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) CGMCC No. 5094、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)CGMCC No. 4756、粪肠球菌(Enterococcus faecal is) CGMCC No. 5092、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtil is) CGMCC No. 4628 四种菌中的任二种、三种或四种的菌粉。
2.如权1所述的复合微生态制剂，其特征在于制剂中含有嗜酸乳杆菌CGMCCNo. 5093 菌粉、地衣芽孢杆菌CGMCC No. 5094菌粉、短小芽孢杆菌CGMCC No. 4756菌粉和粪肠球菌 CGMCC No. 5092菌粉，上述四种菌粉的重量配比为0. 8-2. 5 1 0.8-1.2 1.5-2.5。
3.如权1所述的复合微生态制剂，其特征在于制剂中含有嗜酸乳杆菌CGMCCNo. 5093 菌粉、地衣芽孢杆菌CGMCC No. 5094菌粉和枯草芽孢杆菌CGMCC No. 4628菌粉，上述三种菌粉的重量配比为 0. 8-3. 5 1-3.5 0.8-2.5。
4.如权1所述的复合微生态制剂，其特征在于制剂中含有嗜酸乳杆菌CGMCCNo. 5093 菌粉、地衣芽孢杆菌CGMCC No. 5094菌粉和粪肠球菌CGMCC No. 5092菌粉，上述三种菌粉的重量配比为 1.5-2. 5 0.8-1.2 1。
5.如权1所述的复合微生态制剂，其特征在于制剂中含有嗜酸乳杆菌CGMCCNo. 5093 菌粉、短小芽孢杆菌CGMCC No. 4756菌粉和粪肠球菌CGMCC No. 5092菌粉，上述三种菌粉的重量配比为 2-2. 5 2-2.5 1-1.5。
6.如权1所述的复合微生态制剂，其特征在于所述的嗜酸乳杆菌CGMCCNo. 5093菌粉的制备方法如下按1-2%的接种量向发酵培养基中接入8h-12h菌龄的嗜酸乳杆菌种子液，发酵条件为30-40°C，转速为60-100rpm，培养12_16h，得发酵液，发酵液离心，得到菌泥，加入与菌泥的重量体积百分比为15-20%的冻干保护剂，混勻，于-25°C -45 °C 冷冻干燥，即得，所述的发酵培养基的成分及其质量体积比如下葡萄糖1_2%，大豆蛋白胨1-2 %，酵母膏1-2 %，硫酸铵0. 5-1. 0 %，磷酸氢二钾0. 2-0. 5 %、氯化钠0. 2-0. 8 %， 硫酸镁0.01-0. 05% ；所述的地衣芽孢杆菌CGMCC No. 5094菌粉的制备方法如下按质量体积比0. 5-2%的接种量向发酵培养基中接入10-14h菌龄的地衣芽孢杆菌种子液，发酵条件为30-40°C，转速为200-300rpm，培养15_22h，得发酵液，发酵液中加入质量体积比为20% -25%的填充物麦芽糊精，混勻，进行喷雾干燥，进风温度140-160°C，排风温度 40-50°C，雾化器转速15000-18000rpm，即得，所述发酵培养基的成分及其质量体积比如下 麸皮1-2 %，玉米粉0. 5-1. 5 %，豆粕1-2 %，硫酸铵0. 5-2 %，硫酸镁0. 01-0. 05 %，柠檬酸铵0. 3-1. 2 %、消泡剂0. 05-0. 1%，pH为6. 2-7. 4 ；所述的短小芽孢杆菌CGMCC No. 4756 菌粉的制备方法如下按质量体积比1-2%的接种量向发酵培养基中接入12h-16h菌龄的短小芽孢杆菌种子液，发酵条件为30-40°C，转速为100-300rpm，培养16_24h，得发酵液， 发酵液中加入质量体积比为20-25 %的填充物玉米淀粉，混勻，进行喷雾干燥，进风温度 150-170°C，排风温度40-70°C，雾化器转速15000-20000rpm，即得，所述发酵培养基的成分及其质量体积比如下葡萄糖1_2%，大豆蛋白胨1-2%，豆粕1-2%，硫酸铵0. 5-1.0%，氯化钠 0. 2-0. 8%，硫酸镁 0. 01-0. 05%。
7.如权1-6任一项所述的复合微生态制剂，其特征在于进一步包含载体，载体为麦芽糊精、硫酸钾铝、玉米芯粉、葡萄糖、油糠粉中的任一种或者两种。
8.权1-7任一项所述的复合微生态制剂在制备禽畜饲料添加剂中的应用。
9. 一种包含权1-7任一项所述的复合微生态制剂的预混料，其特征在于预混料中复合微生态制剂添加的质量体积比为0. 5-10%。。
全文摘要
本发明属于饲用微生态技术领域，涉及一种复合微生态制剂及其在饲料添加剂中的应用和预混料。该制剂含有嗜酸乳杆菌菌粉及地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、粪肠球菌、枯草芽孢杆菌四种菌中的任二种、三种或四种的菌粉，制剂中的活菌含量高、水分含量低，具有耐胃酸、耐胆盐、耐高温及耐受常用抗生素等抗逆性能和产酸、产酶及抑制病原菌等益生功能。本发明的复合微生态制剂能够提高饲料利用率，增加肉蛋奶等产量，促进动物生长，提高动物机体免疫力和抗病能力，部分替代抗生素，从而改变动物产品的品质。
文档编号C12N1/04GK102409015SQ20111040053
公开日2012年4月11日 申请日期2011年12月6日 优先权日2011年12月6日
发明者付维来, 刘鹏, 彭子欣, 杜建涛, 王安如 申请人:北京大北农科技集团股份有限公司, 北京科高大北农饲料有限责任公司, 湖南大北农农业科技有限公司