专利名称：包含脱水素功能域的基因及其抗旱抗碱基因工程应用的制作方法
技术领域：
本发明属植物基因工程技术领域，具体涉及运用酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae INVScl菌株表达一种与植物抗逆相关的蛋白AcDHN。
背景技术：
自然界中存在多种如盐、碱、高温、低温、干旱、病虫害等多种生物和非生物胁迫， 限制了作物的生长发育，从而影响作物产量直接威胁到粮食安全，因此，将抗逆境胁迫的基因转入作物中进行分子育种改良作物性状引起了科研工作者的兴趣。而克隆逆境相关基因及其功能的研究能够为通过基因工程进行植物抗逆育种提供有价值的信息和材料。但是， 当前很多研究主要集中在草本植物，很少对木本植物特别是盐生木本植物进行分子遗传学的研究。木本植物和草本植物在应对生物和非生物胁迫时在结构、生长、发育以及生理等方面存在差异性，因此克隆和研究木本植物中与抗逆相关的基因能够为通过基因工程提高作物对生物和非生物胁迫的耐受力提供更多的候选基因。四翅滨藜(Atriplex canescens[Pursh]Nute)是藜科，滨藜属木本植物，是干旱、 半干旱地区的典型植物，在年降雨量180mm以上，年均气温5°C左右，极端最低温度_40°C的干旱、半干旱荒漠、盐碱地生长良好，种源产地海拔2377m，人工栽植区已达3150m。据报道四翅滨藜被有些国家称为“生物脱盐器”，种6. 07亩四翅滨藜，一年能从土壤中吸收It以上的盐分，是荒漠、半荒漠山旱地极有价值的优良饲料灌木，高产优质、富含营养，枝叶含12% 以上的粗蛋白，生物量达15t/hm2，同时有积累硒的能力，在美国广泛用于路坡固定和水土保持，但主要还是用于牧场改良。在印度，从美国等国引进了 12种滨藜品种改良了 700万 hm2的盐碱地，突尼斯和北非一些国家为开发盐碱地资源已有2万hm2荒漠地种植了滨藜，在澳大利亚、南非、北非、以色列和北美地区滨藜是干旱半干旱地区最主要的饲料灌木之一， 也是绿化和水土保持的优良树种。近几年先后在我国甘肃、青海、新疆、宁夏等地进行了区域性引种栽培试验，显示了极强的耐干旱、低温、贫瘠、抗盐碱等优良特性。酿酒酵母菌&iccharomyces cerevisiae不仅具有生长快、容易培养和易于遗传操作等优点，而且具有典型真核系统的特性，具有糖基化、二硫键形成以及蛋白质折叠等翻译后加工等过程，其表达模式与植物表达模式更为接近，所以用酵母筛选植物抗逆基因具有原核表达系统不可替代的优越性。采用酵母突变体筛选植物的不同cDNA文库来鉴定和挖掘新基因的方法已经广泛应用于植物功能基因的研究。用酵母的2种不同氨基酸转运缺陷突变体筛选拟南芥cDNA文库，Frommer等和Hsu等(1993年)成功地克隆到相应的编码相同氨基酸透过酶的NAT2/AAP1。酵母表达系统还被广泛地应用到植物耐盐基因功能研究中，Yamada等(2002年)利用酵母表达体系验证了丙二烯环化氧化酶(AOC)基因大大增强转化子的耐盐性，从而表明AOC基因在真核表达系统中增强抗盐胁迫的功能。唐玉林等 (2007年)利用酵母表达系统研究大豆SAL 13-2蛋白功能，将大豆SAL 13-2蛋白cDNA及其缺失片段构建到酵母表达载体PYES2上，并转化酵母菌INV&1，检测酵母重组子在胁迫条件下的生长状况，结果表明，SALI3-2基因可明显提高酵母转化子的耐盐能力。酿酒酵母菌株INVkl (基因型为MATa his3Dlleu2 trp 1-289 ura3_52)是一种二倍体，并且生长迅速的理想酵母表达菌株，该菌株是人工改造的尿嘧啶营养缺陷型菌株，运用SC-U培养基筛选转化子，假阳性率低，能够保证转化效率。脱水素(Dehydrin)属于LEA家族，分子质量为9_200KDa，是一种广泛存在于高等植物中的干旱诱导蛋白，在植物胚胎发生晚期产生。植株处于低温、外源ABA、干旱、盐碱以及胞外结晶等脱水胁迫的影响，会大量表达和积累这类蛋白。脱水素分子具有很高的亲水性和热稳定性，能将水分捕获到细胞内，以保护细胞免受干旱和盐碱的损伤。能在植物胚胎发育后期以及脱水素的重要结构特征是它具有三类非常保守的区域K、S和Y片段，其中K 片段是所有脱水素都具有的。K片段富含赖氨酸，通常位于C端，可具有1到12个重复，一般由15个氨基酸残基组成(EKKGIMDKIKEKLPG)。许多脱水素还含有由丝氨酸残基组成的S 片段，有证据表明S片段的磷酸化可以使脱水素在信号肽的引导下进入细胞核。很多脱水素的N端还具有另一类保守区域Υ片段，它的序列为(V/T)DEYGNP，与植物和细菌分子伴侣的核酸结合位点有同源性。其中，转化pYES-AcDHN重组载体的酵母INVkl菌株在抗干旱和盐碱胁迫中表现出较强抗性，在众多研究中，还无有关含Dehydrin功能域的四翅滨藜基因在酵母抗逆和植物的抗逆生理功能方面的相关报道。
发明内容
本发明采用盐生灌木植物四翅滨藜(Atriplex canescens)作为研究材料，通过构建低温(-10°C )和盐GOOmM NaCl)胁迫下四翅滨藜的全长运用hvitrogen公司 SuperScript Full-Length cDNA Library Construction Kit 构建全长 cDNA 文库，并通过 Gateway技术LR重组到酵母表达载体pYES_DEST52中，混合质粒转化酵母菌株INVkl，通过多种模拟逆境胁迫(盐碱、冻害、高温、SOS胁迫、干旱胁迫)筛选出与逆境胁迫相关的基因，为今后利用耐盐碱、干旱、冻害、SOS胁迫基因获得抗相应逆境胁迫的转基因农作物和林木奠定基础，同时也为四翅滨藜耐盐碱和耐低温分子机制研究提供依据。本发明使用酵母表达载体pYES_DEST52(购自^witrogen公司)，插入本发明 AcDHN蛋白核苷酸编码序列以及得到重组表达载体pYES-AcDHN，它除了携带有AcDHN蛋白核苷酸编码序列外，还有T7启动子、GALl启动子、CYCl终止转录信号、URA3基因、fl复制基因、PUC复制基因、酵母2 μ复制序列、氨苄青霉素抗性基因、attRl和attR2用于LR重组的重组位点、致死基因ccdB用于逆向筛选转化子、氯霉素抗性基因用于对阳性转化子的双重筛选、Vkpitope便于重组后蛋白表达检测、6xHis Tag用于重组基因纯化，以及为外源蛋白高效表达所需的各种调控元件。AcDHN基因由1408个碱基组成，含有一个完整的开放阅读框架(Open Reading Frame) 1017bp,同时还提供5，-UTR和3，-UTR序列，AcDHN为序列表中的SEQ ID NO :1序列。开放读码框的起始密码子为ATG，终止密码子为TGA。本发明的一个目的是提供含脱水素功能域的四翅滨藜中与植物抗逆相关的蛋白及其编码基因，并进行应用。本发明所提供一种植物抗逆相关蛋白耐Na2C03、NaHCO3和干旱等胁迫，名称为 AcDHN(Atriplexcanescens Dehydrin)，^ξ ΙΙ 0@ ^·。
一种植物抗逆相关蛋白AcDHN，其中包含如下两类蛋白质(a)由序列表中SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中SEQ ID NO 2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代或缺失或添加且与植物抗逆相关的由序列表中SEQ ID NO :2衍生的蛋白质。序列表中SEQ ID NO 2由338个氨基酸残基组成，其中91个疏水氨基酸，208个亲水氨基酸，亲水性极强，94个碱性氨基酸，79个酸性氨基酸，蛋白质分子量为38. 3kD，等电点为6. 47，其中富含赖氨酸(Lys)占总蛋白量的18. 33%，这也是Dehydrin家族蛋白的主要特征。四翅滨藜AcDHN蛋白未见报道。编码基因AcDHN的编码序列为序列表中SEQ ID NO 1的5，端第99-1113位脱氧
核苷酸。编码基因AcDHN的编码序列为下列之一1)编码序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 1所示；2)编码序列表中SEQ ID NO 2蛋白序列的核苷酸分子；3)与1)所述的核苷酸序列具有90%以上的同源性且编码植物抗逆相关蛋白 AcDHN的核苷酸分子；4)在高严谨条件下与1)所述的核苷酸序列杂交且编码蛋白AcDHN的核苷酸分子。以上4)中所述高严谨条件是指可为在0. 1XSSC，0. 1% SDS的溶液中，在65°C下杂交并洗膜的条件。一种重组表达载体含有植物抗逆相关蛋白AcDHN的编码基因AcDHN。一种重组菌含有植物抗逆相关蛋白AcDHN的编码基因AcDHN(以下简称编码基因 AcDHN)。为了使(a)中的AcDHN便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或梭基末端连接上如表1所示的标签。表1.标签的序列
权利要求
1.一种植物抗逆相关蛋白AcDHN，其特征在于其中包含如下两类蛋白质(a)由序列表中SEQID NO :2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中SEQID NO 2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代或缺失或添加且与植物抗逆相关的由序列表中SEQ ID NO :2衍生的蛋白质。
2.按权利要求1所述植物抗逆相关蛋白AcDHN的编码基因AcDHN，其特征在于所述的编码基因AcDHN的编码序列为序列表中SEQ ID NO=I的5，端第99-1113位脱氧核苷酸。
3.按权利要求2所述植物抗逆相关蛋白AcDHN的编码基因AcDHN，其特征在于所述编码基因AcDHN的编码序列为下列之一1)编码序列的核苷酸序列如序列表中SEQID NO 1所示；2)编码序列表中SEQID NO 2蛋白序列的核苷酸分子；3)与1)所述的核苷酸序列具有90%以上的同源性且编码权利要求1所述植物抗逆相关蛋白AcDHN的核苷酸分子；4)在高严谨条件下与1)所述的核苷酸序列杂交且编码权利要求1所述植物抗逆相关蛋白AcDHN的核苷酸分子。
4.一种重组表达载体，其特征在于含有权利要求2或3所述植物抗逆相关蛋白AcDHN 的编码基因AcDHN。
5.一种重组菌，其特征在于含有权利要求2或3所述植物抗逆相关蛋白AcDHN的编码基因AcDHN。
全文摘要
包含脱水素功能域的基因及其抗旱抗碱基因工程应用属植物基因工程技术领域，本发明提供一种植物抗逆相关蛋白AcDHN，包含由SEQ ID NO2氨基酸序列组成和将SEQ ID NO2的氨基酸序列经一个或几个氨基酸残基的取代或缺失或添加且由SEQ ID NO2衍生的蛋白质；编码基因AcDHN的编码序列如下列之一a.编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示；b.编码SEQ ID NO2蛋白序列的核苷酸分子；c.与a核苷酸序列具有90％以上同源性且编码蛋白的核苷酸分子；d.与a的核苷酸序列杂交且编码蛋白的核苷酸分子；将AcDHN导入酿酒酵母得到的转基因酿酒酵母，可提升酵母耐干旱耐盐碱能力。
文档编号C12N1/15GK102492030SQ20111040113
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月6日 优先权日2011年12月6日
发明者余刚, 刘金亮, 张世宏, 李桂华, 潘洪玉, 王雪亮, 贾承国, 陈宣明 申请人:吉林大学