专利名称：用于细胞培养的石墨烯衬底及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种用于细胞培养的石墨烯衬底及其制备方法，尤其涉及该种石墨烯衬底的纯化、修饰工艺，属于生物材料领域。
背景技术：
石墨烯为单层或少层碳原子组成的二维纳米材料，具有优良的物理、化学性质。自 2004年被发现以来，迅速成为材料科学与凝聚态物理等领域的研究热点。同时在生物医学领域，石墨烯近年来也备受关注，已被用于细胞成像、药物输运、生物分析、干细胞工程及肿瘤治疗方面研究。由于石墨烯优良的电学、力学性能，可进一步应用于生物芯片、植入材料等生物医学领域，因此制备具有良好生物相容性的石墨烯衬底材料具有重要应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于细胞培养的石墨烯衬底及其制备方法，可实现石墨烯表面多类细胞培养。本发明的一个目的，一种石墨烯衬底，用于细胞培养设备之中，其特征在于细胞培养的载体表面为石墨烯衬底，所述石墨烯衬底为透明基片表面经清洗、液池固定及亲和工艺处理的单层石墨烯或十层以下的少层石墨烯，所培养的细胞至少为肿瘤细胞、原代神经细胞和神经干细胞中一种或几种。优选的，所述少层石墨烯的层数为三至五层。本发明的另一个目的，用于细胞培养的石墨烯衬底的制备方法，所述石墨烯为化学气相沉积方法合成的单层或少层石墨烯，其特征在于将石墨烯迁移至透明基片表面，经有机溶剂清洗后在石墨烯表面固定液池，再利用去离子水清洗去除残留有害物质，最后采用氧等离子体改性、生物活性分子改性和含血清培养基孵育中的一种或几种亲和工艺处理制得石墨烯衬底，所述石墨烯衬底用于培养的细胞至少为肿瘤细胞、原代神经细胞和神经干细胞中一种或几种。优选的，该透明基片为玻璃，制备方法在有机溶剂清洗和固定液池之间还包括一高温退火处理，所述高温退火处理方法为在氩氢比为0. 9 9wt%的气氛条件下300°C处理 0. 5小时 20小时。优选的，该透明基片为透明聚合物材料，至少包括聚苯乙烯类，聚丙烯类，聚氯乙烯类，聚氨酯类，聚碳酸酯类，聚苯醚类和聚酰胺类的一种或几种。优选的，该有机溶剂清洗的方法为采用20 75°C的热丙酮处理0. 5小时 120小时。优选的，该固定液池的方法为采用道康宁3140硅酮粘合剂在室温条件下固化1小时 120小时，液池固化后用去离子水浸泡1小时 120小时去除残留有害物质。优选的，该氧等离子改性的工艺参数为氧等离子功率IOW 200W，氧气流量10 150sccm,时间30秒 10分钟。优选的，该生物活性分子改性的方法为采用多聚赖氨酸或层粘连蛋白中一种对石墨烯表面进行非共价修饰，其中多聚赖氨酸修饰的工艺参数为多聚赖氨酸浓度0. 05 10mg/mL，反应时间2小时 120小时，修饰温度37°C，pH值7. 4 ；层粘连蛋白修饰的工艺参数为层粘连蛋白浓度0. 1 100μ g/mL，修饰时间为2小时 120小时，修饰温度37°C，pH 值7. 4，两种修饰工艺完毕后采用灭菌PBS缓冲液冲洗。优选的，该含血清培养基孵育方法为根据培养细胞种类在细胞接种前采用血清浓度1% 15%培养基孵育2小时 120小时。与现有细胞培养皿及其制法相比，本发明的优点至少在于(1)采用经过处理的石墨烯能够保持本征石墨烯优良的力学、电学、电化学性能，为生物细胞的研究实验提供支持。(2)本发明制备方法工艺高效、快捷、简单、克服了细胞培养过程中未经处理石墨烯会引起细胞毒性这一不足。特别当与未经处理石墨烯相比，处理后石墨烯表面细胞存活率、凋亡率、增殖速率显著改善，展现了良好的生物相容性。
具体实施例方式针对现有技术中的缺陷与不足，经长期研究和实践，本发明专利申请提出了利用石墨烯衬底作为细胞培养载体的构想及这种石墨烯衬底的制备方法。该石墨烯衬底主要用于细胞培养设备之中。作为细胞培养的载体表面，该石墨烯衬底为透明基片表面经清洗、液池固定及亲和工艺处理的单层石墨烯或十层以下的少层石墨烯，所培养的细胞至少为肿瘤细胞、原代神经细胞和神经干细胞中一种或几种。其中本方案中优选的少层石墨烯的层数为三至五层。从本发明石墨烯衬底的制备方法概括来看，包括下列步骤采用传统CVD的方法， 以铜箔为催化剂，在1000°c条件下，以甲烷为碳源制备单层或少层石墨烯。采用硝酸铁浸泡方法去除铜催化剂后，用玻璃或透明聚合物材料直接将石墨烯捞起。针对耐高温玻璃衬底， 采用保护气氛条件下，高温加热方法去除残余污染物。针对不耐高温多聚物材料则省去该步骤。之后，采用热丙酮、异丙醇清洗方法进一步去除有机物残留。随后，在石墨烯衬底表面固定液池用于细胞培养。之后，用大量去离子水浸泡石墨烯衬底以去除可溶性有毒物质。 酒精浸泡灭菌后采用氧等离子体、生物活性分子修饰及含血清培养基孵育中方法一种或几种对石墨烯表面进行生物亲和处理。所用透明聚合物材料，为聚苯乙烯类、聚丙烯类、聚氯乙烯类、聚氨酯类、聚碳酸酯类、聚苯醚类、聚酰胺类的一种或几种，但不限于此。其中具体方法如下介绍。利用有机溶剂清洗，采用20-75°C热丙酮处理0. 5-120小时，随后异丙醇清洗0. 5 小时。针对耐高温玻璃衬底，采用保护气条件下，高温去除残余污染物。采用氩氢比为 0. 9-9wt%气氛条件下300°C处理0. 5小时-20小时去除部分残余污染物。固定液池的方法，采用道康宁3140硅酮粘合剂，室温条件下固化时间根据用量在 1-120小时之间。酒精灭菌处理，采用75%酒精灭菌12小时。氧等离子体处理，功率10W-200W，氧气流量10_150sccm，时间0. 5分-10分钟，在石墨烯表面引入含氧基团。生物活性分子修饰为多聚赖氨酸或层粘连蛋白修饰。其中多聚赖氨酸浓度为 0. 05-10mg/mL,反应时间为2-120小时，反应温度为37°C，pH=7. 4，反应完毕大量灭菌PBS缓冲液冲洗；其中层粘连蛋白反应浓度0. 1-100μ g/mL，修饰时间为2-120小时，修饰温度为 370C，pH=7. 4，修饰完毕大量灭菌PBS缓冲液冲洗。含血清培养基孵育方法，根据培养细胞种类在细胞接种前采用血清浓度1%_15% 培养基孵育2-120小时。藉由本发明，可同时实现各类细胞在石墨烯表面正常生长，为进一步石墨烯生物医学应用提供技术支持。以下结合若干较佳实施例对本发明的技术方案作进一步说明。实施例1
采用CVD的方法，以25ΜΠ1厚铜箔为催化剂，在1000°C条件下，以甲烷为碳源生长3-4层石墨烯。硝酸铁溶液(IM)浸泡过夜去除铜催化剂后用载玻片玻璃直接将石墨烯捞起。管式炉中，Ar/H2 90/10 wt%气氛，300°C条件下处理石墨烯衬底20小时。75 °C热丙酮浸泡0. 5 小时后异丙醇浸泡3小时以去除剩余有机物残留。在石墨烯衬底表面采用道康宁3140硅酮粘合剂固定液池120小时，18. 2兆欧去离子水浸泡处理过夜。75%酒精处理12小时。最后，采用生物亲和分子多聚赖氨酸0. 05 mg/mL修饰120小时，含15%血清培养基浸泡2小时。肿瘤细胞培养采用PC12细胞(大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞株)，培养基为含 15%胎牛血清的DMEM培养基，石墨烯衬底表面接种密度为IO5细胞/cm2。光学及生化表征发现，上述方法制备石墨烯衬底表面细胞胞体丰满、胞浆透明、细胞边缘折光率高，生长状态良好，细胞存活率与商用组织培养聚苯乙烯衬底无显著差异，显著高于未经处理石墨烯衬底(相对商用组织培养聚苯乙烯衬底，其表面相对细胞存活率为 60%)。实施例2
采用CVD的方法，以25ΜΠ1厚铜箔为催化剂，在1000°C条件下，以甲烷为碳源生长3-4层石墨烯。硝酸铁溶液(IM)浸泡过夜去除铜催化剂后用载玻片玻璃直接将石墨烯捞起。管式炉中，Ar/H2 10/90 wt%气氛，300°C条件下处理石墨烯衬底0. 5小时。20 °C热丙酮浸泡 120小时后异丙醇浸泡3小时以去除剩余有机物残留。在石墨烯衬底表面采用道康宁3140 硅酮粘合剂固定液池1小时，18. 2兆欧去离子水浸泡处理过夜。75%酒精处理12小时。功率10 W，氧气流量10 sccm的氧等离子体处理时间0.5分钟。最后，采用生物亲和分子多聚赖氨酸10 mg/mL修饰2小时，含1%血清培养基浸泡120小时。肿瘤细胞培养采用PC12细胞(大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞株)，培养基为含 15%胎牛血清的DMEM培养基，石墨烯衬底表面接种密度为IO5细胞/cm2。光学及生化表征发现，上述方法制备石墨烯衬底表面细胞胞体丰满、胞浆透明、细胞边缘折光率高，生长状态良好，细胞存活率与商用组织培养聚苯乙烯衬底无显著差异，显著高于未经处理石墨烯衬底(相对商用组织培养聚苯乙烯衬底，其表面相对细胞存活率为 60%)。实施例3
采用CVD的方法，以25ΜΠ1厚铜箔为催化剂，在1000°C条件下，以甲烷为碳源生长3-4层石墨烯。硝酸铁溶液(IM)浸泡过夜去除铜催化剂后用聚苯乙烯直接将石墨烯捞起。75 V热丙酮浸泡50小时后异丙醇浸泡3小时以去除剩余有机物残留。在石墨烯衬底表面采用道康宁3140硅酮粘合剂固定液池48小时，18. 2兆欧去离子水浸泡处理过夜。75%酒精处理12小时。功率150 W，氧气流量150 sccm的氧等离子体处理时间10分钟。最后，采用生物亲和分子多聚赖氨酸0. 5 mg/mL修饰12小时，含15%血清培养基浸泡6小时。本实施例与上一实施例同时采用了氧等离子改性和生物活性分子改性的方法，其中氧等离子改性的工艺参数可选范围为10W 200W，氧气流量10 150sccm，时间30秒 10分钟。本两例仅在该工艺参数可选范围内选取了其中两个值点，实际应用中可在其中任意选取。肿瘤细胞培养采用PC12细胞(大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞株)，培养基为含 15%胎牛血清的DMEM培养基，石墨烯衬底表面接种密度为IO5细胞/cm2。光学及生化表征发现，上述方法制备石墨烯衬底表面细胞胞体丰满、胞浆透明、细胞边缘折光率高，生长状态良好，细胞存活率与商用组织培养聚苯乙烯衬底无显著差异，显著高于未经处理石墨烯衬底(相对商用组织培养聚苯乙烯衬底，其表面相对细胞存活率为 60%)。实施例4
采用CVD的方法，以25ΜΠ1厚铜箔为催化剂，在1000°C条件下，以甲烷为碳源生长3-4层石墨烯。硝酸铁溶液(IM)浸泡过夜去除铜催化剂后用聚丙烯衬底直接将石墨烯捞起。50 °C热丙酮浸泡M小时后异丙醇浸泡3小时以去除剩余有机物残留。在石墨烯衬底表面采用道康宁3140硅酮粘合剂固定液池120小时，18. 2兆欧去离子水浸泡处理过夜。75%酒精处理12小时。含15%血清培养基浸泡6小时。肿瘤细胞培养采用PC12细胞(大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞株)，培养基为含 15%胎牛血清的DMEM培养基，石墨烯衬底表面接种密度为IO5细胞/cm2。光学及生化表征发现，上述方法制备石墨烯衬底表面细胞胞体丰满、胞浆透明、细胞边缘折光率高，生长状态良好，细胞存活率与商用组织培养聚苯乙烯衬底无显著差异，显著高于未经处理石墨烯衬底(相对商用组织培养聚苯乙烯衬底，其表面相对细胞存活率为 60%)。实施例5
采用CVD的方法，以25ΜΠ1厚铜箔为催化剂，在1000°C条件下，以甲烷为碳源生长3-4层石墨烯。硝酸铁溶液(IM)浸泡过夜去除铜催化剂后用聚氯乙烯衬底将石墨烯捞起。50 V 热丙酮浸泡1小时后异丙醇浸泡3小时以去除剩余有机物残留。在石墨烯衬底表面采用道康宁3140硅酮粘合剂固定液池12小时，18. 2兆欧去离子水浸泡处理过夜。75%酒精处理 12小时。最后，采用生物亲和分子多聚赖氨酸0.05 mg/mL修饰120小时，含1%血清培养基浸泡120小时。采用原代细胞分离方法，获得原代海马神经细胞悬液，以IO5细胞/cm2密度接种于上述方法制备石墨烯衬底表面。两天后，M T T及L D H酶活性检测结果显示，对于海马神经细胞而言，上述方法制备的石墨烯衬底具有良好的生物相容性相对商用组织培养聚苯乙烯衬底，两者表面相对细胞存活率、膜完整性无显著差异，而未经上述工艺处理石墨烯衬底表面细胞存活率仅为 20%，LDH酶活性(反比于细胞膜完整性)为 500%。实施例6
采用CVD的方法，以25ΜΠ1厚铜箔为催化剂，在1000°C条件下，以甲烷为碳源生长3-4层石墨烯。硝酸铁溶液(IM)浸泡过夜去除铜催化剂后用聚氨酯衬底直接将石墨烯捞起。50°C热丙酮浸泡1小时后异丙醇浸泡3小时以去除剩余有机物残留。在石墨烯衬底表面采用道康宁3140硅酮粘合剂固定液池12小时，18. 2兆欧去离子水浸泡处理过夜。75%酒精处理12小时。最后，采用生物亲和分子多聚赖氨酸10 mg/mL修饰2小时，含10%血清培养基浸泡18小时。采用原代细胞分离方法，获得原代海马神经细胞悬液，以IO5细胞/cm2密度接种于上述方法制备石墨烯衬底表面。两天后，M T T及L D H酶活性检测结果显示，对于海马神经细胞而言，上述方法制备的石墨烯衬底具有良好的生物相容性相对商用组织培养聚苯乙烯衬底，两者表面相对细胞存活率、膜完整性无显著差异，而未经上述工艺处理石墨烯衬底表面细胞存活率仅为 20%，LDH酶活性(反比于细胞膜完整性)为 500%。实施例7
采用CVD的方法，以25ΜΠ1厚铜箔为催化剂，在1000°C条件下，以甲烷为碳源生长3-4层石墨烯。硝酸铁溶液(IM)浸泡过夜去除铜催化剂后用聚氨酯直接将石墨烯捞起。50 ！热丙酮浸泡0. 5小时后异丙醇浸泡3小时以去除剩余有机物残留。在石墨烯衬底表面采用道康宁3140硅酮粘合剂固定液池12小时，18. 2兆欧去离子水浸泡处理过夜。75%酒精处理 12小时。最后，采用生物亲和分子多聚赖氨酸1 mg/mL修饰12小时，含15%血清培养基浸泡10小时。采用原代细胞分离方法，获得原代海马神经细胞悬液，以IO5细胞/cm2密度接种于上述方法制备石墨烯衬底表面。两天后，M T T及L D H酶活性检测结果显示，对于海马神经细胞而言，上述方法制备的石墨烯衬底具有良好的生物相容性相对商用组织培养聚苯乙烯衬底，两者表面相对细胞存活率、膜完整性无显著差异，而未经上述工艺处理石墨烯衬底表面细胞存活率仅为 20%，LDH酶活性(反比于细胞膜完整性)为 500%。实施例8
采用CVD的方法，以25ΜΠ1厚铜箔为催化剂，在1000°C条件下，以甲烷为碳源生长3-4层石墨烯。硝酸铁溶液(IM)浸泡过夜去除铜催化剂后用聚碳酸酯衬底直接将石墨烯捞起。50 °C热丙酮浸泡0. 5小时后异丙醇浸泡3小时以去除剩余有机物残留。在石墨烯衬底表面采用道康宁3140硅酮粘合剂固定液池12小时，18. 2兆欧去离子水浸泡处理过夜。75%酒精处理12小时。最后，采用生物亲和分子层粘连蛋白0. 1 μ g/mL修饰120小时。采用选择培养基筛选方法，获得神经球样小鼠神经干细胞，采用单细胞分散的方法在上述方法制备石墨烯衬底表面接种，密度为10 4细胞/cm2。两天后M T T及L D H酶活性检测结果显示，对于小鼠神经干细胞而言，上述方法制备的石墨烯衬底具有良好的生物相容性与商用组织培养聚苯乙烯衬底比较，两者表面相对细胞存活率、膜完整性无显著差异，而未经上述工艺制备石墨烯衬底表面细胞存活率仅为 20%，LDH酶活性(反比于细胞膜完整性)为 500%。实施例9
采用CVD的方法，以25ΜΠ1厚铜箔为催化剂，在1000°C条件下，以甲烷为碳源生长3-4层石墨烯。硝酸铁溶液(IM)浸泡过夜去除铜催化剂后用聚苯醚衬底直接将石墨烯捞起。50 °C热丙酮浸泡0. 5小时后异丙醇浸泡3小时以去除剩余有机物残留。在石墨烯衬底表面采用道康宁3140硅酮粘合剂固定液池12小时，18. 2兆欧去离子水浸泡处理过夜。75%酒精处理12小时。最后，采用生物亲和分子层粘连蛋白100 μ g/mL修饰2小时。
采用选择培养基筛选方法，获得神经球样小鼠神经干细胞，采用单细胞分散的方法在上述方法制备石墨烯衬底表面接种，密度为10 4细胞/cm2。两天后M T T及L D H酶活性检测结果显示，对于小鼠神经干细胞而言，上述方法制备的石墨烯衬底具有良好的生物相容性与商用组织培养聚苯乙烯衬底比较，两者表面相对细胞存活率、膜完整性无显著差异，而未经上述工艺制备石墨烯衬底表面细胞存活率仅为 20%，LDH酶活性(反比于细胞膜完整性)为 500%。实施例10
采用CVD的方法，以25ΜΠ1厚铜箔为催化剂，在1000°C条件下，以甲烷为碳源生长3-4层石墨烯。硝酸铁溶液(IM)浸泡过夜去除铜催化剂后用聚酰胺衬底直接将石墨烯捞起。50 °C热丙酮浸泡0. 5小时后异丙醇浸泡3小时以去除剩余有机物残留。在石墨烯衬底表面采用道康宁3140硅酮粘合剂固定液池12小时，18. 2兆欧去离子水浸泡处理过夜。75%酒精处理12小时。最后，采用生物亲和分子层粘连蛋白10 μ g/mL修饰12小时。采用选择培养基筛选方法，获得神经球样小鼠神经干细胞，采用单细胞分散的方法在上述方法制备石墨烯衬底表面接种，密度为10 4细胞/cm2。两天后M T T及L D H酶活性检测结果显示，对于小鼠神经干细胞而言，上述方法制备的石墨烯衬底具有良好的生物相容性与商用组织培养聚苯乙烯衬底比较，两者表面相对细胞存活率、膜完整性无显著差异，而未经上述工艺制备石墨烯衬底表面细胞存活率仅为 20%，LDH酶活性(反比于细胞膜完整性)为 500%。应当理解的是，本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。因此，无论从哪一点来看，本发明的上述实施例只能认为是对本发明的说明而不能限制本发明，权利要求书指出了本发明的范围，而上述的说明并未指出本发明的范围，因此在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。
权利要求
1.一种石墨烯衬底，用于细胞培养设备之中，其特征在于细胞培养的载体表面为石墨烯衬底，所述石墨烯衬底为透明基片表面经清洗、液池固定及亲和工艺处理的单层石墨烯或十层以下的少层石墨烯，所培养的细胞至少为肿瘤细胞、原代神经细胞和神经干细胞中一种或几种。
2.如权利要求1所述的一种石墨烯衬底，其特征在于所述少层石墨烯的层数为三至五层。
3.用于细胞培养的石墨烯衬底制备方法，所述石墨烯为化学气相沉积方法合成的单层或少层石墨烯，其特征在于将石墨烯迁移至透明基片表面，经有机溶剂清洗后在石墨烯表面固定液池，再利用去离子水清洗去除残留有害物质，最后采用氧等离子体改性、生物活性分子改性和含血清培养基孵育中的一种或几种亲和工艺处理制得石墨烯衬底，所述石墨烯衬底用于培养的细胞至少为肿瘤细胞、原代神经细胞和神经干细胞中一种或几种。
4.如权利要求3所述的用于细胞培养的石墨烯衬底制备方法，其特征在于所述透明基片为玻璃，所述制备方法在有机溶剂清洗和固定液池之间还包括一高温退火处理，所述高温退火处理方法为在氩氢比为0. 9 9wt%的气氛条件下300°C处理0. 5小时 20小时。
5.如权利要求3所述的用于细胞培养的石墨烯衬底制备方法，其特征在于所述透明基片为透明聚合物材料，至少包括聚苯乙烯类，聚丙烯类，聚氯乙烯类，聚氨酯类，聚碳酸酯类，聚苯醚类和聚酰胺类的一种或几种。
6.如权利要求3所述的用于细胞培养的石墨烯衬底制备方法，其特征在于所述有机溶剂清洗的方法为采用20 75°C的热丙酮处理0. 5小时 120小时。
7.如权利要求3所述的用于细胞培养的石墨烯衬底制备方法，其特征在于所述固定液池的方法为采用道康宁3140硅酮粘合剂在室温条件下固化1小时 120小时，液池固化后用去离子水浸泡1小时 120小时去除残留有害物质。
8.如权利要求3所述的用于细胞培养的石墨烯衬底制备方法，其特征在于所述氧等离子改性的工艺参数为氧等离子功率IOW 200W，氧气流量10 150sccm，时间30秒 10 分钟。
9.如权利要求3所述的用于细胞培养的石墨烯衬底制备方法，其特征在于所述生物活性分子改性的方法为采用多聚赖氨酸或层粘连蛋白中一种对石墨烯表面进行非共价修饰，其中多聚赖氨酸修饰的工艺参数为多聚赖氨酸浓度0. 05 10mg/mL，反应时间2小时 120小时，修饰温度37°C，pH值7. 4 ；层粘连蛋白修饰的工艺参数为层粘连蛋白浓度0. 1 100μ g/mL，修饰时间为2小时 120小时，修饰温度37°C，pH值7. 4，两种修饰工艺完毕后采用灭菌PBS缓冲液冲洗。
10.如权利要求3所述的用于细胞培养的石墨烯衬底制备方法，其特征在于所述含血清培养基孵育方法为根据培养细胞种类在细胞接种前采用血清浓度1% 15%培养基孵育 2小时 120小时。
全文摘要
本发明公开了一种用于细胞培养的石墨烯衬底及其制备方法。作为细胞培养的载体，该石墨烯衬底为透明基片表面经清洗、液池固定及亲和工艺处理的单层石墨烯或十层以下的少层石墨烯。其制法为取石墨烯迁移至玻璃表面，经有机溶剂清洗、高温退火处理后固定液池；或取石墨烯迁移至透明聚合物材料表面，经有机溶剂清洗后直接固定液池。之后通过去离子水清洗、亲和工艺处理，制呈可用于细胞培养的石墨烯衬底。本发明工艺简单、重复性强，可以制备适于肿瘤细胞、原代神经细胞、神经干细胞生长的石墨烯衬底，可广泛应用于基于石墨烯材料的生物芯片、植入器械制备。
文档编号C12N5/079GK102433304SQ20111040064
公开日2012年5月2日 申请日期2011年12月6日 优先权日2011年12月6日
发明者唐明亮, 宋琴, 张琦, 李宁, 王龙, 程国胜, 苏瑞巩, 齐琳 申请人:中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所