专利名称：一种鸭AvBD2基因真核表达质粒及由该质粒制成的分子佐剂和疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种动物医药生物工程领域，特别是一种鸭β -防御素-2基因真核表达质粒及其使用方法。
背景技术：
防御素是一类古老的内源性抗菌多肽，在动物、植物、昆虫体内广泛存在。除具有广谱抗菌活性外，防御素在机体的先天性免疫及获得性免疫中均具有重要作用。体外许多研究表明防御素具有趋化和活化抗原提呈细胞(APCs)的功能，是天然免疫的重要组成部分，被认为是一种很好的内源性免疫佐剂。如Tettito等(1989)及Murphy等(1993)的研究证明人α -防御素1，2，3对单核细胞具有细胞趋化活性，对上皮细胞及培养的成纤维细胞具有促有丝分裂活性。Yang等(1999与2000)研究表明，人上皮β -防御素_1，2对未成熟树状突细胞和记忆性T-细胞具有趋化性；Biragyn等(2001)研究发现鼠日-防御素_2，3 对骨髓来源的未成熟细胞具有化学趋化活性。体内实验也表明防御素具有免疫佐剂特性， 可以增强抗原特异性的免疫力。如^iang等(2010)发现鸡β -防御素_1以融合形式与 IBDV VP2基因相连后免疫鸡只，能增强VP2特异性抗体水平。Lillard等(1999)研究发现人α -防御素能显著增加血清中抗原特异性IgG与IgM的水平；增强抗原特异性CD4+T细胞的增值与IFN-γ、IL-5、IL-6、IL-10的分泌。Tani等(2000)发现人α -防御素可以刺激鼠脾脏细胞的增值及细胞因子的产生；可以提高小鼠血液IgGl、IgGh、IgG2b抗体水平。对鸭β -防御素-2在不同组织器官中的表达分析发现其在脾脏和肾脏组织中均大量表达，在骨髓中呈中等水平表达，在心脏和肝脏中仅少量表达，在其他组织器官中均未检测到有表达。鸭β -防御素-2在脾脏和骨髓的高表达量，说明鸭β -防御素-2是一种髓源性防御素，在内源免疫防御中起重要作用。对鸭防御素-2的生物学功能研究也表明，体外具有抗菌活性与趋化活性(Soman等，2009)，具备成为一种内源性免疫佐剂基础， 可能在促进机体特异性免疫能力方面具重要作用。
发明内容
本发明目的在于提供一种具有鸭β -防御素-2 (AvBD2)所特有的免疫增强作用的、适合在禽类DNA疫苗中使用的鸭AvBD2基因真核表达质粒及由该质粒制成的分子佐剂和疫苗
本发明的鸭AvBD2基因真核表达质粒是这样实现的，由pcDNA3. 1(+)真核表达载体、连接在pcDNA3. 1 (+)真核表达载体上的鸭AvBD2基因片段构成，该鸭AvBD2基因真核表达质粒的获得方法依次包括1、上游引物、下游引物的设计过程；2、鸭AvBD2基因片段的PCR获取过程；3、鸭AvBD2基因真核表达质粒pcDNA3. 1 (+) -AvBD-2的构建过程；4、鸭AvBD2基因真核表达质粒pcDNA3. 1 (+)-AvBD-2的制备过程；
1、上游引物、下游引物的设计过程引物的设计及合成是根据国内外已在GenBank中登录的鸭AvBD2基因序列经多重比较后设计而成，并在5’端加入ATG启动子，根据真核表达载体pcDNA3. 1 (+)上的酶切位点，上游引物设计去除了前导肽序列处开始，并加上/ ^ III酶切位点及2个保护性碱基CG ；下游引物设计在基因末端，并加上ife // I酶切位点及 2个保护性碱基CC，所设计的引物序列为
上游引物5’ -cgAAGCTTA^^TATGCGGGACATGTTTCTCTGT-3’ (.Hind III)
下游引物5，-CCGGATCCTACATCCCATGGCGATTTG-3’ (BamHl 酶切位点)
2、鸭AvBD2基因的PCR扩增过程以重组质粒pMD-18T_AvBD2为模板，加入ExTaqDNA 聚合酶、上游引物、下游引物、dNIPs进行扩增反应，PCR的反应体系为5yL的10XPCR buffer(10XPCR buffer 包含有 0. 5mmol/L MgC12、50mmol/L KClUOmmol/L Tris(三羟甲基氨基甲烷)*HC1、0. 001wt%明胶)，2μ L的4XdNTPs(4XdNTPs包含有浓度均为2. 5mmol/ L的dATP (三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸)、dTTP (三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸)、dCTP (三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸)和dGTP (三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸))，浓度为20ymol/L的0. 5 μ L的上游引物，浓度为20 μ mol/L的0. 5 μ L的下游引物，1 μ L的pMD-18T_AvBD2质粒，40. 5 μ L 的ddH20 (双蒸水)，浓度为5umol/L的0. 5 μ L的Exhq DNA聚合酶，反应过程是a、混合物先在95°C处理:3min ；b、然后在94°C处理30s，再在56°C处理30s，再在72°C处理30s ；反应过程b循环30次；然后在72°C处理lOmin，重组质粒pMD-18T_AvBD2由佛山科学技术学院生命科学学院动物科学系张辉华克隆并保存并保证自申请日起20年内向公众提供；所获得的鸭AvBD2基因片段核苷酸序列为
atgCGGGACATGTTTCTCTGTAGGAAAGGCTCCTGCCACTTCGGAAGATGTCCCATCCACCTGATCAGAGTTG GAAGCTGCTTTGGGTTCCGCTCCTGCTGCAAATCGCCATGGGATGTATAA ；
PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳观察，见到约120bp的扩增条带，表明已扩增到目标产物；
3、鸭AvBD2基因真核表达质粒pcDNA3.1 (+) _AvBD2的构建过程将过程2的鸭AvBD2基因片段的PCR产物用氛氯仿抽提纯化，加入乙醇获得沉淀物，将沉淀物干燥后用TE溶解，TE 包含有 10mmol/L Tris · HCl 禾Π lmmol/L EDTA (乙二胺四乙酸)，TE 溶解物用 ^aaY !,HincI III进行双酶切处理，胶回收约120bp左右的条带；以同样的方法对pcDNA3. 1(+)质粒进行双酶切处理，胶回收5. 4kb左右的DNA片断，分别取5 μ L双酶切后胶回收的鸭AvBD2基因片段和3 μ L双酶切后胶回收的pcDNA3. 1 (+)质粒，加入IyL的IOX1M DNA连接Buffer (10XT4 DNA 连接 Buffer 包含有 0. 5mol/L Tris ‘ HCl, 0. lmol/L MgCl2, 50mmol/L DTT (二硫苏糖醇)，5mmol/L DATP(三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸)，0. 25mg/mL BSA(牛血清白蛋白))， IuL T4 DNA连接酶，在16°C下连接处理18小时，将连接产物转化DH5 α感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB平板上37°C培养18小时；pcDNA3. 1 (+)质粒为hvitrogen公司的产
P
PR，
a、鸭AvBD2基因真核表达质粒pcDNA3. l(+)-AvBD2的双酶切鉴定在含有氨苄青霉素的LB平板上挑取单个的白色菌落，接种于3ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中， 37°C振摇培养18小时，抽提质粒DNA进行双酶切鉴定；将鸭AvBD2基因真核表达质粒 pcDNA3. 1⑴-AvBD2分别用及 /7 l.Hind III进行双酶切，酶切产物在1. 5%琼脂糖凝胶电泳观察，pcDNA3. 1 (+)-AvBD2双酶切后产生约5. 4kb和120bp左右的两条带，证明已经成功构建了鸭AvBD2基因真核表达质粒pcDNA3. 1 (+) -AvBD2 ；b、鸭AvBD2基因真核表达质粒pcDNA3. 1 (+)-AvBD2的PCR鉴定在含有氨苄青霉素的 LB平板上挑取单个白色菌落，接种于3ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C振摇培养18小时，抽提质粒DNA进行PCR鉴定；以质粒pcDNA3. 1 (+) -AvBD2为模板，加入ExTaq DNA聚合酶、上下游引物、dNTPs进行扩增反应，PCR的反应体系为10XPCR Buffer 5 μ L， 4XdNTPs (2. 5mmol/L) 2μ L，上、下游引物(20ymol/L)各 0· 5 μ L，pcDNA3. 1 (+) -AvBD2 质 1 μ L, ddH20 40. 5 μ L, ExTaq DNA 聚合酶(5umol/L) 0· 5 μ L ；反应过程为a、95°C 处理 !3min ;b、然后 94°C 30s,56°C 30s,72°C 30s ；反应过程 b 循环 30 次，然后 72°C延伸 lOmin， PCR产物在1. 5%琼脂糖凝胶电泳观察，可见约120bp的扩增条带，证明已经成功构建了鸭 AvBD2基因真核表达质粒pcDNA3. 1 (+) -AvBD2 ；
4、鸭AvBD2基因真核表达质粒pcDNA3. 1 (+) -AvBD2的制备过程从过程3的LB固体培养平板中挑取单个白色菌落，接种于盛有IOml液体培养基的三角瓶中，37°C震荡过夜培养以获得菌种，然后在500ml的三角瓶中加入IOOml的发酵培养基，接入2ml的菌种，在37°C， 以200rpm/min速度摇晃，培养18h，然后用常规提取质粒的碱裂解方法对500ml三角瓶中的培养物进行质粒的大量抽提，用硅藻土吸附法进行纯化即可获得鸭AvBD2基因真核表达质粒 pcDNA3. l(+)-AvBD2。本发明的由鸭AvBD2基因真核表达质粒pcDNA3. 1⑴_AvBD2制成的分子佐剂是这样实现的，将鸭AvBD2基因真核表达质粒pcDNA3. 1 (+)-AvBD2用PBS缓冲液稀释成lmg/ml 即可。由鸭AvBD2基因真核表达质粒pcDNA3. 1 (+) -AvBD2制成的疫苗是这样实现的，将鸭AvBD2基因真核表达质粒pcDNA3. 1 (+) -AvBD2用PBS缓冲液稀释成lmg/ml，然后与禽DNA 疫苗混合即可。本发明与已有技术相比，由于是选用了鸭AvBD2基因片段与真核表达载体连接来作为免疫增强剂，因此，具有鸭AvBD2所特有的免疫增强效果的、适合与禽DNA疫苗一起使用的优点。
具体实施例方式
现结合实施例对本发明作进一步详细描述
本发明的鸭AvBD2基因真核表达质粒是这样实现的，由pcDNA3. 1(+)真核表达载体、连接在pcDNA3. 1 (+)真核表达载体上的鸭AvBD2基因片段，该鸭AvBD2基因真核表达质粒的获得方法依次包括1、上游引物、下游引物的设计过程；2、鸭AvBD2基因片段的PCR获取过程；3、鸭AvBD2基因真核表达质粒pcDNA3. l(+)-AvBD2的构建过程；4、鸭AvBD2基因真核表达质粒pcDNA3. 1 (+) -AvBD2的制备过程；
1、上游引物、下游引物的设计过程引物的设计及合成是根据国内外已在GenBank中登录的鸭AvBD2基因序列经多重比较后设计而成，并在5’端加入ATG启动子，根据真核表达载体pcDNA3. 1 (+)上的酶切位点，上游引物设计在去除了前导肽序列处开始，并加上/ ^ III酶切位点及2个保护性碱基CG ；下游引物设计在基因末端，并加上ife // I酶切位点及 2个保护性碱基CC，所设计的引物序列为
上游引物5’ -cgMGCTT^CTATGCGGGACATGTTTCTCTGT-3' (Hind III) 下游引物5，-CCGGATCCTACATCCCATGGCGATTTG-3’ (BamH I 酶切位点)
2、鸭AvBD2基因的PCR扩增过程以重组质粒pMD-18T_AvBD2为模板，加入ExTaqDNA聚合酶、上游引物、下游引物、dNTPs进行扩增反应，PCR的反应体系为5μ L的10XPCR buffer (10 XPCR buffer 包含有 0. 5mmol/L MgC12, 50mmol/L KCl, lOmmol/L Tris · HC1， 0. 001% 明胶)，2 μ L 的 4X dNTPs (4X dNTPs 包含有浓度均为 2. 5mmol/L 的 dATP, dTTP, dCTP, dGTP)，0. 5μ L 的上游引物(20 μ mol/L)，0. 5 μ L 的下游引物(20 μ mol/L)，1 μ L 的 pMD-18T-AvBD2质粒，40. 5μ L 的 ddH20(双蒸水)，0. 5 μ L 的 ExTaq DNA 聚合酶(5umol/L)， 反应过程是a、混合物先在95°C处理:3min ；b、然后在94°C处理30s，再在56°C处理30s，再在72°C处理30s ；反应过程b循环30次；然后在72°C处理lOmin，重组质粒pMD-18T_AvBD2 由佛山科学技术学院生命科学学院动物科学系张辉华克隆并保存；所获得的鸭AvBD2基因片段核苷酸序列为
atgCGGGACATGTTTCTCTGTAGGAAAGGCTCCTGCCACTTCGGAAGATGTCCCATCCACCTGATCAGAGTTG GAAGCTGCTTTGGGTTCCGCTCCTGCTGCAAATCGCCATGGGATGTATAA ；
PCR产物在1. 5%琼脂糖凝胶电泳观察，见到约120bp的扩增条带，表明已扩增到目标产物；
3、鸭AvBD2基因真核表达质粒pcDNA3.1 (+) -AvBD2的构建过程将过程2的鸭AvBD2 基因片段的PCR产物用氛氯仿抽提纯化，加入乙醇获得沉淀物，将沉淀物干燥后用TE (TE 包含有 10mmol/L Tris · HCl, lmmol/L EDTA)溶解，TE 溶解物用 BatnH l.Hind III 进行双酶切处理，胶回收约120bp左右的条带；以同样的方法对pcDNA3. 1(+)质粒进行双酶切处理，胶回收5. 4kb左右的DNA片断，分别取5 μ L双酶切后胶回收的鸭AvBD2基因片段和 3yL双酶切后胶回收的pcDNA3. 1(+)质粒，加入IyL的10XT4 DNA连接BuffeK 10X T4 DNA 连接 Buffer 包含有 0. 5mol/L Tris · HCl，0. lmol/L MgC12, 50mmol/L DTT,5mmol/L DATP,0. 25mg/mL BSA)，1 μ L T4 DNA连接酶，在16°C下连接处理18小时，将连接产物转化 DH5 α感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB平板上37°C培养18小时；pcDNA3. 1 (+)质粒为 Invitrogen公司的产品
a、鸭AvBD2基因真核表达质粒pcDNA3.l(+)-AvBD2的双酶切鉴定在含有氨苄青霉素的LB平板上挑取单个的白色菌落，接种于3ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中， 37°C振摇培养18小时，抽提质粒DNA进行双酶切鉴定；将鸭AvBD2基因真核表达质粒 pcDNA3. 1⑴-AvBD2分别用及 /7 l.Hind III进行双酶切，酶切产物在1. 5%琼脂糖凝胶电泳观察，pcDNA3. 1 (+)-AvBD2双酶切后产生约5. 4kb和120bp左右的两条带，证明已经成功构建了鸭AvBD2基因真核表达质粒pcDNA3. 1 (+) -AvBD2 ；
b、鸭AvBD2基因真核表达质粒pcDNA3.1 (+)-AvBD2的PCR鉴定在含有氨苄青霉素的 LB平板上挑取单个白色菌落，接种于3ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C振摇培养18小时，抽提质粒DNA进行PCR鉴定；以质粒pcDNA3. 1 (+) -AvBD2为模板，加入ExTaq DNA聚合酶、上下游引物、dNTPs进行扩增反应，PCR的反应体系为10XPCR Buffer 5 μ L， 4X dNTPs (2. 5mmol/L) 2 μ L,上、下游引物(20 μ mol/L)各 0· 5 μ L，pcDNA3. 1 (+) -AvBD2 质
1 μ L, ddH20 40. 5 μ L, ExTaq DNA 聚合酶(5umol/L) 0· 5 μ L ；反应过程为a、95°C处理 !3min ;b、然后 94°C 30s,56°C 30s,72°C 30s ；反应过程 b 循环 30 次，然后 72°C延伸 lOmin， PCR产物在1. 5%琼脂糖凝胶电泳观察，可见约120bp的扩增条带，证明已经成功构建了鸭 AvBD2基因真核表达质粒pcDNA3. 1 (+) -AvBD2 ；
4、鸭AvBD2基因真核表达质粒pcDNA3.1 (+) -AvBD2的制备过程从过程3的LB固体培养平板中挑取单个白色菌落，接种于盛有IOml液体培养基的三角瓶中，37°C震荡过夜培养以获得菌种，然后在500ml的三角瓶中加入IOOml的发酵培养基，接入2ml的菌种，在37°C， 以200rpm/min速度摇晃，培养18h，然后用常规提取质粒的碱裂解方法对500ml三角瓶中的培养物进行质粒的大量抽提，用硅藻土吸附法进行纯化即可获得鸭AvBD2基因真核表达质粒 pcDNA3. l(+)-AvBD2。本发明过程中使用的限制性内切酶及 /7 !,Hind III、T4DNA连接酶、ExTaq DNA 聚合酶等均购自广州宝泰克生物科技有限公司。本发明的由鸭AvBD2基因真核表达质粒PCDNA3. l(+)-AvBD2制成的分子佐剂是这样实现的，将鸭AvBD2基因真核表达质粒pcDNA3. 1 (+)-AvBD2用PBS缓冲液稀释成lmg/ml 即可。本发明由鸭AvBD2基因真核表达质粒PCDNA3. l(+)-AvBD2制成的疫苗是这样实现的，将鸭AvBD2基因真核表达质粒pcDNA3. 1 (+) _AvBD2用PBS缓冲液稀释成lmg/ml，然后与禽DNA疫苗混合即可。用该分子佐剂pcDNA3. l(+)-AvBD2与禽流感病毒DNA疫苗(AIV HA DNA疫苗)联合应用，免疫AIV HA血清抗体阴性鸡只，通过检测血清AIV HA特异性抗体值、血液IL_4、IL_6 和INF-Y变化水平；同时分离淋巴细胞，用MTT法检测淋巴细胞增值反应；并于免疫后17d 和31d测免疫器官指数(包括法氏囊、胸腺和脾脏指数)，以评价其对禽流感病毒DNA疫苗 (AIV HA DNA疫苗)的免疫增强作用。60只14日龄健康鸡，随机分成3组，每组20只，饲养在华南农业大学动物科学院家禽研究室。免疫两次，第一次免疫后10天进行二免。第一组为PBS组(免疫剂量为0. 15ml)，第二组为AIV HA DNA疫苗组(免疫剂量为150 μ g)，第三组为AIV HA DNA疫苗组(免疫剂量为150 μ g) + pcDNA3. 1 (+) _AvBD2 (免疫剂量为150 μ g)。 结果发现第二组与第三组鸡只血清HA特异性抗体水平及IL-4、IL-6及INF- Y细胞因子水平随免疫时间的延长而增加，在Md时达到最高水平，31d时开始下降；并且自从一免后的17d开始，第三组血清HA特异性抗体水平及IL-4、IL-6及INF-Y细胞因子水平显著高于第二组。第一组血清撤特异性抗体水平及11^-4、11^-6及1顺-^细胞因子水平一直变化不大，显著低于第二与第三组。免疫后第17 d、31 d，法氏囊、胸腺和脾脏指数，第三组均显著高于第二组与第一组，第二组显著高于第一组。外周血T淋巴细胞的转化率，随着时间增加，三个组均呈下降趋势，但在各个日龄第三组显著高于第二组与第一组，第二组显著高于第一组。上述实验结果表明分子佐剂pcDNA3. l(+)-AvBD2对AIV HA DNA疫苗具有很好的免疫增强作用。
权利要求
1. 一种鸭AvBD2基因真核表达质粒，其特征在于由pcDNA3. 1(+)真核表达载体、连接在pcDNA3. 1 (+)真核表达载体上的鸭AvBD2基因片段构成，该鸭AvBD2基因真核表达质粒的获得方法依次包括1、上游引物、下游引物的设计过程；2、鸭AvBD2基因片段的PCR获取过程；3、鸭AvBD2基因真核表达质粒pcDNA3. 1 (+) -AvBD-2的构建过程；4、鸭AvBD2基因真核表达质粒pcDNA3. 1 (+) -AvBD-2的制备过程；(1)上游引物、下游引物的设计过程引物的设计及合成是根据国内外已在GenBank中登录的鸭AvBD2基因序列经多重比较后设计而成，并在5’端加入ATG启动子，根据真核表达载体pcDNA3. 1 (+)上的酶切位点，上游引物设计去除了前导肽序列处开始，并加上/ ^ III酶切位点及2个保护性碱基CG ；下游引物设计在基因末端，并加上ife // I酶切位点及 2个保护性碱基CC，所设计的引物序列为上游引物5，-cgAAGCTTA^^TATGCGGGACATGTTTCTCTGT-3’ Hind III，下游引物5，-CCGGATCCTACATCCCATGGCGATTTG-3’ BamHl 酶切位点，(2)鸭AvBD2基因的PCR扩增过程以重组质粒pMD-18T_AvBD2为模板，加入ExTaq DNA聚合酶、上游引物、下游引物、dNIPs进行扩增反应，PCR的反应体系为5 μ L的10 X PCR buffer, 2 μ L的4Χ dNTPs，浓度为20 μ mol/L的0. 5 μ L的上游引物，浓度为20 μ mol/L的 0. 5 μ L 的下游引物，1 μ L 的 pMD-18T-AvBD2 质粒，40. 5 μ L 的 ddH20,浓度为 5umol/L 的 0. 5μ L 的 ExTaq DNA 聚合酶，10XPCR buffer 包含有 0. 5mmol/L MgC12、50mmol/L KCl, 10mmol/L Tris ·Ηα、0. 001wt% 明胶，4X dNIPs 包含有浓度均为 2. 5mmol/L 的 dATP、dTTP、 dCTP和dGTP，反应过程是a、混合物先在95°C处理^iin ；b、然后在94°C处理30s，再在 56°C处理30s，再在72°C处理30s ；反应过程b循环30次；然后在72°C处理lOmin，所获得的鸭AvBD2基因片段核苷酸序列为atgCGGGACATGTTTCTCTGTAGGAAAGGCTCCTGCCACTTCGGAAGATGTCCCATCCACCTGATCAGAGTTG GAAGCTGCTTTGGGTTCCGCTCCTGCTGCAAATCGCCATGGGATGTATAA ；PCR产物在1. 5%琼脂糖凝胶电泳观察，见到约120bp的扩增条带，表明已扩增到目标产物；(3)鸭AvBD2基因真核表达质粒pcDNA3.1 (+) -AvBD2的构建过程将过程2的鸭AvBD2 基因片段的PCR产物用氛氯仿抽提纯化，加入乙醇获得沉淀物，将沉淀物干燥后用TE溶解， TE 包含有 10mmol/L Tris 'HCl 禾Π lmmol/L EDTA, TE 溶解物用 ^aaY l.Hind III 进行双酶切处理，胶回收约120bp左右的条带；以同样的方法对pcDNA3. 1(+)质粒进行双酶切处理， 胶回收5. 4kb左右的DNA片断，分别取5 μ L双酶切后胶回收的鸭AvBD2基因片段和3 μ L 双酶切后胶回收的pcDNA3. 1 (+)质粒，加入IyL的10ΧΤ4 DNA连接Buffer，1 μ L T4 DNA 连接酶，在16°C下连接处理18小时，将连接产物转化DH5ci感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB平板上37°C培养18小时，10XT4 DNA连接Buffer包含有0. 5mol/L Tris · HCl、 0. lmol/L MgCl2, 50mmol/L DTT、5mmol/L DATP、0. 25mg/mL BSA ；a、鸭AvBD2基因真核表达质粒pcDNA3. l(+)-AvBD2的双酶切鉴定在含有氨苄青霉素的LB平板上挑取单个的白色菌落，接种于3ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中， 3 7 °C振摇培养18小时，抽提质粒DNA进行双酶切鉴定；将鸭AvBD2基因真核表达质粒 pcDNA3. 1 (+) -AvBD2分别用及 /7 l.Hind III进行双酶切，酶切产物在1. 5%琼脂糖凝胶电泳观察，pcDNA3. 1 (+)-AvBD2双酶切后产生约5. 4kb和120bp左右的两条带，证明已经成功构建了鸭AvBD2基因真核表达质粒pcDNA3. 1 (+) -AvBD2 ；b、鸭AvBD2基因真核表达质粒pcDNA3. 1 (+)-AvBD2的PCR鉴定在含有氨苄青霉素的 LB平板上挑取单个白色菌落，接种于3ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C振摇培养18小时，抽提质粒DNA进行PCR鉴定；以质粒pcDNA3. 1 (+) -AvBD2为模板，加入ExTaq DNA聚合酶、上下游引物、dNTPs进行扩增反应，PCR的反应体系为10XPCR Buffer 5 μ L， 4XdNTPs (2. 5mmol/L) 2μ L，上、下游引物(20ymol/L)各 0· 5 μ L，pcDNA3. 1 (+) -AvBD2 质 1 μ L, ddH20 40. 5 μ L, ExTaq DNA 聚合酶(5umol/L) 0· 5 μ L ；反应过程为a、95°C 处理 !3min ;b、然后 94°C 30s,56°C 30s,72°C 30s ；反应过程 b 循环 30 次，然后 72°C延伸 lOmin， PCR产物在1. 5%琼脂糖凝胶电泳观察，可见约120bp的扩增条带，证明已经成功构建了鸭 AvBD2基因真核表达质粒pcDNA3. 1 (+) -AvBD2 ；(4)鸭AvBD2基因真核表达质粒pcDNA3. 1 (+)-AvBD2的制备过程从过程3的LB固体培养平板中挑取单个白色菌落，接种于盛有IOml液体培养基的三角瓶中，37°C震荡过夜培养以获得菌种，然后在500ml的三角瓶中加入IOOml的发酵培养基，接入2ml的菌种，在 37°C，以200rpm/min速度摇晃，培养18h，然后用常规提取质粒的碱裂解方法对500ml三角瓶中的培养物进行质粒的大量抽提，用硅藻土吸附法进行纯化即可获得鸭AvBD2基因真核表达质粒 pcDNA3. 1 (+) -AvBD2。
2.由鸭AvBD2基因真核表达质粒pcDNA3.1 (+) -AvBD2制成的分子佐剂，其特征在于将权利要求1所述的鸭AvBD2基因真核表达质粒pcDNA3. 1 (+)-AvBD2用PBS缓冲液稀释成 lmg/ml 艮阿。
3.由鸭AvBD2基因真核表达质粒pcDNA3.l(+)-AvBD2制成的疫苗，其特征在于将权利要求1所述的鸭AvBD2基因真核表达质粒pcDNA3. 1 (+)-AvBD2用PBS缓冲液稀释成Img/ ml，然后与禽DNA疫苗混合即可。
全文摘要
一种鸭AvBD2基因真核表达质粒及由该质粒制成的分子佐剂和疫苗其特征在于鸭AvBD2基因真核表达质粒由pcDNA3.1(+)真核表达载体、连接在pcDNA3.1(+)真核表达载体上的鸭AvBD2基因片段构成，由该质粒制成的分子佐剂是将鸭AvBD2基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-AvBD2用PBS缓冲液稀释成1mg/ml即可，疫苗是将鸭AvBD2基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-AvBD2用PBS缓冲液稀释成1mg/ml，然后与禽DNA疫苗混合即可。本发明与已有技术相比，具有鸭β-防御素-2(AvBD2)所特有的免疫增强作用的、适合在禽类DNA疫苗中使用的优点。
文档编号C12N15/66GK102433353SQ20111040078
公开日2012年5月2日 申请日期2011年12月6日 优先权日2011年12月6日
发明者张辉华, 李辰, 毕英佐, 谢青梅, 韩小凤, 马保华, 马静云 申请人:佛山科学技术学院