专利名称：一种通过诱变提高红霉素生产菌对正丙醇的耐受性的方法
技术领域：
本发明涉及一种生物工程领域、特别涉及一种通过微生物诱变手段提高红霉素产量的方法。
背景技术：
红霉素属大环内酯类抗生素，具有广谱抗菌作用。对G+菌有强大抗菌作用，尤其对耐青霉素的金葡菌有效。对立克次体、支原体、螺旋体有较强的抑制作用。对阿米巴原虫、滴虫也有抑制作用。红霉素是从红霉素链霉菌的培养液中分尚出来的一种碱性抗生素，后来从发酵液中分离出来红霉素A、B、C、D、E等组分，其中以红霉素A为主要组分，抗菌活性强、且毒副作用较小；其它组分抗菌活性弱，而毒副作用又较A大。通常所称的红霉素即指红霉素A及其盐类。红霉素是白色或类白色的结晶性粉末，微有吸湿性，味苦，易溶于醇类、丙酮、氯仿、酯类(如乙酯、丁酯、戊酯等)，微溶于乙醚。红霉素在水中极微溶解，其溶解度随温度的升高而减小，以55°C时为最小。红霉素属大环内酯类抗生素，大环内酯抗生素生物合成途径由三个基本步骤组成:糖苷配基的形成；糖部分的生物合成和终端反应。该终端反应包括糖的连接和大环内酯中间体的一些细微变化。前体是指加入到发酵培养基中的某些化合物，能被微生物直接结合到产物分子中去，而自身的结构无多大变化，且具有促进产物合成的作用。在大环内酯抗生素生物合成中，内酯环的形成往往是限制性因素。已知内酯环是以一些低级脂肪酸为前提单位所构成的，这些脂肪酸前体物，有的不易被菌体合成，因而就成为抗生素形成的限制性因素。正丙醇在发酵过程中的作 用，一部分是用作合成红霉内酯，因而对红霉素的合成显刺激作用，还有一部分是消耗于其他代谢途径和损失。在红霉素发酵过程中，加正丙醇作为生物合成的前体物质，可增加红霉素产量。但是，在发酵前期加入正丙醇会干扰菌丝生长，从而降低抗生素的合成，外源前提在发酵液中的残留浓度过高，会使生产菌中毒，不利于抗生素的合成。但前体不足也不行。因此，解决这两者之间的矛盾，一个比较好的办法就是提高红霉素生产菌对正丙醇的耐受性，从而提高菌体产素能力。
发明内容
目前，提高红霉素生产菌产红霉素的能力，仍以诱变育种为主要手段。针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种通过诱变提高红霉素生产菌对正丙醇的耐受性，从而提
高红霉素产量的方法。本发明的一种通过诱变提高红霉素生产菌对正丙醇的耐受性的方法，其包括以下步骤:
(1)将红霉素生产菌在斜面培养基上培养，培养7天后获得新鲜成熟孢子；
(2)将红霉素生产菌新鲜成熟斜面制成孢子悬液，孢子量在IX IO6个/mL，取5mL孢子悬液移至培养皿中，于15W紫外线灯管和固定距离20cm照射3分钟，诱变后进行梯度稀释立即涂培养基平板；
(3)挑取步骤(2)诱变后活菌落进行离子束辐照诱变:诱变温度为25°C，诱变剂量为55Gy，诱变后进行梯度稀释涂培养基平板初筛。挑单菌落至斜面培养基，34°C，培养7天，再经摇瓶发酵方法进行复筛，所得突变菌即为对正丙醇具耐受性的高产红霉素生产菌；
(4)步骤(I)或步骤(3)斜面养基的配方为:可溶性淀粉6g，玉米浆7g，硫酸铵3g，氯化钠3g，琼脂粉20g，加水定容至1000ml，调pH值至7.2，分析纯碳酸钙2.5g。步骤(2)的平板培养基的配方为:可溶性淀粉6g，玉米浆7g，硫酸铵3g，氯化钠3g，琼脂粉20g，100%正丙醇15ml，加水定容至1000ml，调pH值至7.2，分析纯碳酸钙2.5g ；
(5)步骤(3)平板培养基配方为:可溶性淀粉6g，玉米浆7g，硫酸铵3g，氯化钠3g，琼脂粉20g, 100%正丙醇20m l，加水定容至1000ml，调pH值至7.2，分析纯碳酸钙2.5g ；
(6)步骤(3)的摇瓶发酵是将红霉素生产菌在种子培养基中培养成熟的种子液接入发酵摇瓶培养基；
(7)步骤(3)种子培养基配方为:玉米淀粉28g，糊精7g，中温黄豆饼粉12.6g，硫酸铵1.2g,硝酸铵1.2g,氯化钠3g,玉米楽；7.1g,分析纯碳酸韩6g,豆油2ml,加水定容至1000ml，调pH值至7.0。种子液培养条件为:34°C, 220转/分，振荡培养42_46h ；
(8)摇瓶发酵培养基配方为:玉米淀粉18g，糊精24g，中温黄豆饼粉18g，硫酸铵2g，轻质碳酸1丐6g,豆油4ml, 100%正丙醇20ml,加水定容至1000ml,调pH值至7.0 ；
(9)按照摇瓶发酵培养基配方配制摇瓶发酵液50mL,放入500mL带挡板的三角瓶中；
(10)将培养成熟的红霉素生产菌种子液5mL接入发酵摇瓶中，340C，260转/分，振荡培养7天左右，得红霉素，利用HPLC测定效价；
(11)发酵罐培养基配方为:玉米淀粉1.5kg，糊精0.25kg，中温黄豆饼粉1.29kg，硫酸铵0.1kg,氯化钠0.15kg,玉米衆0.75kg,轻质碳酸I丐0.3kg,豆油350ml, 100%正丙醇1320ml，加水定容至60L，调pH值至7.0 ；
(12)将培养成熟的红霉素生产菌种子液按照10%(V/V)的接种量接入100L发酵罐中，340C，培养7天左右，得红霉素，利用HPLC测定效价。本发明的优点:
本发明通过两种诱变、两次筛选，得到对较高浓度正丙醇充分耐受的突变红霉素生产菌，其对正丙醇的耐受浓度达到2%以上。提高了红霉素生产菌对正丙醇的耐受性，使在培养基中可显著增加正丙醇浓度，在生产菌种转化率不变的情况下，正丙醇浓度提高使红霉素的产量得到提高，100L发酵罐放罐效价可达到13000u/ml。
具体实施例方式普通红霉素生产菌难以耐受高浓度正丙醇。将红霉素生产菌诱变后会形成表型各异的红霉素生产菌突变库，其中很可能含有少量对正丙醇耐受者，关键是将这部分在突变库中占极少比例的正丙醇耐受型突变红霉素生产菌从大量无义突变中筛选出来，如果正丙醇耐受型突变红霉素生产菌确实在突变库中存在，将突变库接入高浓度正丙醇培养基后，正丙醇耐受型突变红霉素生产菌就会生长，而大量无义突变红霉素生产菌则死亡，从而通过诱变及筛选得到正丙醇耐受型突变红霉素生产菌。
以下通过实施例进一步对本发明进行描述:
实施例1:
第一次诱变与筛选:将红霉素生产菌在斜面培养基上培养，培养7天后获得新鲜成熟孢子；利用红霉素生产菌新鲜成熟斜面制IOml孢子悬液，孢子量在I X IO6个/mL，分成两份。取一份(作为对照)涂平板培养基，平板培养基的配方为:可溶性淀粉6g，玉米浆7g,硫酸铵3g，氯化钠3g，琼脂粉20g，100%正丙醇15ml，加水定容至IOOOml，调pH值至7.2，分析纯碳酸钙2.5g。培养7天，显示红霉素生产菌未生长。另取一份(作为诱变份)孢子悬液移至培养皿中，于15W紫外线灯管和固定距离20cm照射3分钟，诱变后进行梯度稀释立即涂培养基平板，平板培养基的配方为:可溶性淀粉6g，玉米浆7g，硫酸铵3g，氯化钠3g，琼脂粉20g，100%正丙醇15ml，加水定容至1000ml，调PH值至7.2，分析纯碳酸钙2.5g。在平板上生长的菌落即为初次诱变成功的能耐受1.5%正丙醇的突变红霉素生产菌。第二次诱变与筛选:对第一次诱变成功的能耐受1.5%正丙醇的初次突变红霉素生产菌进行离子束辐照诱变。将初次突变红霉素生产菌在斜面培养基上培养，培养7天后获得新鲜成熟孢子；利用初次突变红霉素生产菌新鲜成熟斜面制IOml孢子悬液，孢子量在I X IO6个/mL，分成两份。取一份(作为对照)涂平板培养基，平板培养基的配方为:可溶性淀粉6g，玉米浆7g，硫酸铵3g，氯化钠3g，琼脂粉20g，100%正丙醇20ml，加水定容至1000ml，调PH值至7.2，分析纯碳酸钙2.5g。培养7天，显示红霉素生产菌未生长。一份(作为诱变份)进行离子束辐照诱变，诱变温度为25°C，诱变剂量为55Gy。诱变后进行梯度稀释立即涂培养基平板，平板培养基的配方为 :可溶性淀粉6g，玉米浆7g，硫酸铵3g，氯化钠3g，琼脂粉20g，100%正丙醇20ml，加水定容至1000ml，调pH值至7.2，分析纯碳酸钙2.5g。在平板上生长的菌落即为再次诱变成功的能耐受2%正丙醇的突变红霉素生产菌。将第二次筛选出的耐正丙醇红霉素生产菌进行遗传稳定性试验，共转接10代，证明其是否是遗传稳定的耐正丙醇突变红霉素生产菌。将第二次筛选出的耐正丙醇红霉素生产菌和初次突变红霉素生产菌分别接入种子瓶培养基，种子培养基配方为:玉米淀粉28g，糊精7g，中温黄豆饼粉12.6g,硫酸铵1.2g,硝酸铵1.2g,氯化钠3g,玉米楽；7.1g,分析纯碳酸韩6g,豆油2ml,加水定容至1000ml，调pH值至7.0。34°C，220转/分，振荡培养42_46h。按照摇瓶发酵培养基配方配制摇瓶发酵液50mL，放入500mL带挡板的三角瓶中。将第二次筛选出的耐正丙醇红霉素生产菌和初次突变红霉素生产菌在种子培养基中培养成熟的种子液接入发酵摇瓶培养基，摇瓶发酵培养基配方为:玉米淀粉18g，糊精24g，中温黄豆饼粉18g，硫酸铵2g，轻质碳酸钙6g，豆油4ml，100%正丙醇20ml，加水定容至1000ml，调pH值至1.0。34°C, 260转/分，振荡培养5天左右，显示初次突变红霉素生产菌未能生长，菌丝断裂严重，第二次筛选出的耐正丙醇红霉素生产菌生长。实施例2:
将第二次筛选出的耐正丙醇红霉素生产菌的种子液，接入含100%正丙醇2.2%的发酵摇瓶培养基中，34°C，260转/分，振荡培养7天左右，红霉素含量达到7500u/ml。普通的红霉素生产菌用此方法，红霉素含量只达到5500u/ml。实施例3:将第二次筛选出的耐正丙醇红霉素生产菌的种子液，接入含100%正丙醇2.2%的100L发酵罐中培养，34°C，7天左右，放罐效价可达到13000u/ml。普通的红霉素生产菌用此方法，红霉素含量只达到8000u/ml。最后，还需注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均 应认为是本发明的保护范围。
权利要求
1.一种通过诱变提高红霉素生产菌对正丙醇的耐受性的方法，其特征依次包括以下步骤: (1)将红霉素生产菌在斜面培养基上培养，34°c，培养7天后获得新鲜成熟孢子； (2)将红霉素生产菌新鲜成熟斜面制成孢子悬液，孢子量在IX IO6个/mL，取5mL孢子悬液移至培养皿中，于15W紫外线灯管和固定距离20cm照射3分钟，诱变后进行梯度稀释立即涂培养基平板； (3)挑取步骤(2)诱变后活菌落进行离子束辐照诱变:诱变温度为25°C，诱变剂量为55Gy，诱变后进行梯度稀释涂培养基平板初筛；挑单菌落至斜面培养基，34°C，培养7天，再经摇瓶发酵方法进行复筛，所得突变菌即为对正丙醇具耐受性的高产红霉素生产菌。
2.根据权利要求1所述的通过诱变提高红霉素生产菌对正丙醇的耐受性的方法，其特征在于:步骤(I)或步骤(3)斜面养基的配方为:可溶性淀粉6g，玉米浆7g，硫酸铵3g，氯化钠3g，琼脂粉20g，加水定容至1000ml，调pH值至7.2，分析纯碳酸钙2.5g ;步骤(2)的平板培养基的配方为:可溶性淀粉6g，玉米浆7g，硫酸铵3g，氯化钠3g，琼脂粉20g，100%正丙醇15ml，加水定容至1000ml，调pH值至7.2，分析纯碳酸钙2.5g。
3.根据权利要求1所述的通过诱变提高红霉素生产菌对正丙醇的耐受性的方法，其特征在于:步骤(3)是将步骤(2)诱变后的活菌落在斜面培养基上培养7天后制成孢子悬液，进行离子束辐照诱变。
4.根据权利要求1所述的通过诱变提高红霉素生产菌对正丙醇的耐受性的方法，其特征在于:步骤(3)平板培养基配方为:可溶性淀粉6g，玉米浆7g，硫酸铵3g，氯化钠3g，琼脂粉20g，100%正丙醇20ml，加水定容至1000ml，调pH值至7.2，分析纯碳酸钙2.5g ;摇瓶发酵培养基配方为:玉米淀粉18g，糊精24g，中温黄豆饼粉18g，硫酸铵2g，轻质碳酸钙6g，豆油4ml, 100%正丙醇 20ml，加水定容至1000ml，调pH值至7.0。
5.根据权利要求3所述的通过诱变提高红霉素生产菌对正丙醇的耐受性的方法，其特征在于:其所用培养基配方为:可溶性淀粉6g，玉米浆7g，硫酸铵3g，氯化钠3g，琼脂粉20g，加水定容至1000ml，调pH值至7.2，分析纯碳酸钙2.5g。
6.根据权利要求1所述的通过诱变提高红霉素生产菌对正丙醇的耐受性的方法，其特征在于:步骤(3)的摇瓶发酵是将红霉素生产菌在种子培养基中培养成熟的种子液接入发酵摇瓶培养基。
7.根据权利要求6所述的通过诱变提高红霉素生产菌对正丙醇的耐受性的方法，其特征在于:种子培养基配方为:玉米淀粉28g，糊精7g，中温黄豆饼粉12.6g，硫酸铵1.2g，硝酸铵1.2g,氯化钠3g,玉米衆7.1g,分析纯碳酸|丐6g,豆油2ml，加水定容至1000ml,调pH值至7.0 ;种子液培养条件为:34°C，220转/分，振荡培养42-46h。
8.根据权利要求6所述的通过诱变提高红霉素生产菌对正丙醇的耐受性的方法，其特征在于:按照摇瓶发酵培养基配方配制摇瓶发酵液50mL，放入500mL带挡板的三角瓶中。
9.根据权利要求6所述的通过诱变提高红霉素生产菌对正丙醇的耐受性的方法，其特征在于:将培养成熟的红霉素生产菌种子液5mL接入发酵摇瓶中，340C，260转/分，振荡培养7天左右，得红霉素，测定效价。
全文摘要
本发明公开了一种通过诱变提高红霉素生产菌对正丙醇的耐受性的方法，包括以下步骤(1)以红霉素生产菌为出发菌株，将红霉素生产菌在斜面培养基上预培养7天。(2)预培养后的红霉素生产菌进行紫外线诱变用15W功率的紫外灯管和固定距离为20cm的条件下照射3分钟进行诱变，诱变后立即涂培养基平板。(3)诱变后活菌落进行离子束辐照诱变诱变温度为25℃，诱变剂量为55Gy，诱变后再经培养基平板初筛和摇瓶发酵方法复筛，所得活菌落即为对正丙醇具耐受性的突变红霉素生产菌。通过本方法，得到对高浓度正丙醇具耐受性的突变红霉素生产菌，其对正丙醇的耐受浓度达到2%以上。提高了红霉素生产菌对正丙醇的耐受性，使在培养基中可显著增加正丙醇浓度，在生产菌种转化率不变的情况下，正丙醇浓度提高使红霉素的产量得到提高，100L发酵罐放罐效价可达到13000u/ml以上。
文档编号C12R1/465GK103160446SQ20111041102
公开日2013年6月19日 申请日期2011年12月12日 优先权日2011年12月12日
发明者张丽丽, 于新令, 程传东, 李瑾, 何海燕, 王凤滩 申请人:山东方明药业集团股份有限公司