专利名称：一种双孢蘑菇原生质体及其制备方法
一种双孢蘑菇原生质体及其制备方法技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及双孢蘑菇原生质体的制备方法，具体的说，涉及一种廉价的双孢蘑菇原生质体及其制备方法。
背景技术：
双孢蘑菇(Agaricuz bisporus)又称白蘑菇，为担子菌纲伞菌目伞菌科蘑菇属食用真菌，是目前世界上栽培面积和食用量最大的蘑菇，也是一个世界性分布的蘑菇品种，含有丰富的蛋白质和人体必需的氨基酸，以及多种维生素，是一种药食同源的真菌。因为食用菌的原生质体全能性较易体现，所以原生质体诱变、融合育种技术是目前食用菌高产菌株及新菌株选育手段中最为高效经济的方法之一。而原生质体的成功制备是原生质体诱变、 融合育种技术的必要条件。
目前国内制备双孢蘑菇原生质体的酶大多使用溶壁酶，但单一的使用溶壁酶不仅价格昂贵而且效果不理想，其原生质体的释放量只能达到105，而再生率也只能达到10_5，均处于较低的水平。此外，酶种类、浓度及组合方式等也都影响原生质体的产量，混合使用两种酶液制备原生质体效果更理想，而原生质体的制备方法也间接的影响到原生质体的再生率。本研究混合使用较廉价的蜗牛酶和纤维素酶，对双孢蘑菇原生质体的制备工艺进行了优化，提高了原生质体的释放量和再生率。发明内容
为解决以上现有技术中的不足，本发明的首要目的在于提供一种双孢蘑菇原生质体的制备方法。
本发明的另一目的在于提供上述方法制备的双孢蘑菇原生质体。
本发明的目的通过以下技术方案实现
—种双孢蘑菇原生质体的制备方法，该方法采用蜗牛酶与纤维素酶的混合酶液进行酶解；所述混合酶液中纤维素酶和蜗牛酶的质量浓度分别为7. 6 8%和4 4. 5%。
所述混合酶液的配制方法为根据所述浓度，用渗透压稳定剂溶解纤维素酶和蜗牛酶，于7000 10000r/min离心15 20min后，用0. 22 μ m的微孔滤膜过滤上清液，滤液即为混合酶液。
所述制备方法具体包括如下步骤
(1)将0. 3 0. 5g双孢蘑菇菌丝与1 1. 5ml的渗透压稳定剂混合，于7000 10000r/min离心15 20min，去上清液，所得沉淀用渗透压稳定剂洗涤2 3次，制得预处理后的菌丝；
(2)将步骤(1)得到的预处理后的菌丝加入混合酶液中，每300 500mg菌丝加入 ImL酶液，置于28 32°C水浴恒温培养2 3h，隔30 40min摇动一次，得到酶解液；
(3)将酶解液过滤，滤液于3000 4000r/min离心15 20min，弃上清液，收集沉淀，即得到双孢蘑菇原生质体。
为了使双孢蘑菇原生质体的纯度更高，可以将得到的双孢蘑菇原生质体精制，精制的具体操作为将步骤(3)制得的双孢蘑菇原生质体加入1 1. 5ml渗透压稳定剂中，于 3000 4000r/min离心15 20min，去上清液，用渗透压稳定剂洗涤下层悬浮液2 3次， 再用与酶解液等体积的渗透压稳定剂重悬原生质体，得到双孢蘑菇原生质体精制悬液。
以上所述渗透压稳定剂均为将0. 6mol/L KCl与0. 6mol/L的甘露醇按体积比 1 1 1 1.5混合后得到。
所述步骤(1)中的双孢蘑菇菌丝是菌龄为6 9d的双孢蘑菇菌丝，其制备方法为将双孢蘑菇菌丝块接到液体PDA培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基，下同)中，于沈 32°C、160 180r/min的摇床培养7 12d，然后过滤，取0. 4 0. 6g过滤后得到的菌丝转移到160 ISOmL液体PDA培养基中，于沈 32°C静置培养6 9d，过滤去上清液，得到双孢蘑菇菌丝。
所述步骤O)的水浴温度为30 32°C。
所述步骤O)的水浴恒温培养的时间为2. 0 2.池。
所述步骤(3)的过滤是用6层擦镜纸过滤。
一种双孢蘑菇原生质就是根据上述制备方法制备而成。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果
本发明采用纤维素酶和蜗牛酶作为混合酶系，比单一的溶壁酶价格低一半以上， 大大降低了科研中双孢蘑菇原生质体的制备费用，为利用原生质体技术进行双孢蘑菇育种奠定了基础。
同时，本发明的双孢蘑菇原生质体的制备方法成本比传统的制备方法降低一半以上，而且得到的原生质体释放量达到9. 9X IO6个/mL，再生率达到2. 11 %，处于较高的水平。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
双孢蘑菇(双孢蘑菇2796，购于广东微生物研究所)菌丝的制备方法如下
在双孢蘑菇菌丝平板上用打孔器取3片最前端生长旺盛的菌丝块，将其接到液体 PDA培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)中，于^TC、160r/min的摇床培养7d，然后将液体过滤，取0. 4g上述液体过滤后所得的菌丝转移到装有160mL液体PDA培养基的250mL三角瓶中，于^TC，静置培养6d，即菌丝为6日菌龄，过滤去上清液，得到双孢蘑菇菌丝。
混合酶液的配置方法如下
称取纤维素酶和蜗牛酶加入无菌0. 6mol/L KCl与0. 6mol/L的甘露醇按体积比 1 1混合得到的渗透压稳定剂中溶解，使纤维素酶和蜗牛酶的质量浓度分别为7. 6%和 4% (纤维素酶由上海伯奥生物科技有限公司提供；蜗牛酶由北京百泰生物科技有限公司提供)，于8000r/min离心ISmin除杂质后用0. 22 μ m的微孔滤膜过滤上清液，得到滤液，即为混合酶液。
双孢蘑菇原生质体的制备方法如下
(1)菌丝的预处理4
将以上制备的0.4g双孢蘑菇菌丝加入到50mL离心管中，加入0.6mol/L KCl与 0. 6mol/L的甘露醇以体积比1 1混合配制的渗透压稳定剂，于7000r/min离心15min，去上清液，所得沉淀用渗透压稳定剂洗涤2次，得到预处理后的菌丝；
(2)酶解的过程如下
每0. 4g预处理后的菌丝加入ImL混合酶液，置于32°C水浴恒温培养2. 2h，隔 30min适当摇动一次，得到酶解液；
(3)酶解后的处理如下
酶解完毕后，用6层擦镜纸过滤酶解液，除去残留菌丝，滤液于3000r/min离心 20min,弃上清液，收集沉淀，即得到双孢蘑菇原生质体。
将制得的双孢蘑菇原生质体沉淀用0. 6mol/L KCl与0. 6mol/L的甘露醇按体积比 1 1混合的渗透压稳定剂于3000r/min离心15min并洗涤两次，然后用与酶解液等体积的 0. 6mol/L KCl与0. 6mol/L的甘露醇按体积比1 1混合的渗透压稳定剂重悬原生质体，得到精制的双孢蘑菇原生质体，重悬的目的是为了使双孢蘑菇原生质体的纯度更高。
然后用血球计数板测定双孢蘑菇原生质体释放量，整个过程在无菌条件下进行， 血球计数板为25X16型，具体计算公式为
原生质生质体/ImL= 80个小方格原生质小方格x400x IOOOOx稀释倍数，测得80释放量为9. 9 X IO6个/mL。
双孢蘑菇原生质的再生率测试方法如下
将原生质体浓度调整到IO6个/mL，取0. ImL原生质体悬浮液涂布于PDA再生培养基上，计算其再生率，再生培养基为马铃薯(浸汁)200g，葡萄糖20g，KH2PO4 2g，MgSO4 0. 5g，蛋白胨3g，琼脂20g, Vbi IOmg, 0. 6mol/L的甘露醇IOOOmL, PH = 7. O0再生率计算值为 2. 11%。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种双孢蘑菇原生质体的制备方法，其特征在于在制备过程中采用蜗牛酶与纤维素酶的混合酶液进行酶解；所述混合酶液中纤维素酶和蜗牛酶的质量浓度分别为7. 6 8%和 4 4. 5%。
2.根据权利要求1所述的双孢蘑菇原生质体的制备方法，其特征在于所述混合酶液的配制方法为根据所述浓度，用渗透压稳定剂溶解纤维素酶和蜗牛酶，于7000 IOOOOr/ min离心15 20min后，过滤上清液，滤液即为混合酶液。
3.根据权利要求1所述的双孢蘑菇原生质体的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)将0.3 0. 5g双孢蘑菇菌丝与1 1. 5ml的渗透压稳定剂混合，于7000 IOOOOr/ min离心15 20min，去上清液，所得沉淀用渗透压稳定剂洗涤2 3次，制得预处理后的菌丝；(2)将步骤(1)得到的预处理后的菌丝加入混合酶液中，每300 500mg菌丝加入ImL 混合酶液，置于28 30°C水浴恒温培养2 3h，隔30 40min摇动一次，得到酶解液；(3)将酶解液过滤，滤液于3000 4000r/min离心15 20min，弃上清液，收集沉淀， 即为双孢蘑菇原生质体。
4.根据权利要求3所述的双孢蘑菇原生质体的制备方法，其特征在于将制得的双孢蘑菇原生质体精制，具体操作为将步骤(3)制得的双孢蘑菇原生质体加入1 1. 5ml渗透压稳定剂中，于3000 4000r/min离心15 20min，去上清液，用渗透压稳定剂洗涤下层悬浮液2 3次，再用与酶解液等体积的渗透压稳定剂重悬原生质体，得到双孢蘑菇原生质体精制悬液。
5.根据权利要求2 4任一项所述的双孢蘑菇原生质体的制备方法，其特征在于所述渗透压稳定剂是将0. 6mol/L KCl与0. 6mol/L的甘露醇按体积比1 1 1 1. 5混合得到。
6.根据权利要求3所述的双孢蘑菇原生质体的制备方法，其特征在于所述步骤(1) 中的双孢蘑菇菌丝是菌龄为6 9d的双孢蘑菇菌丝，其制备方法为将双孢蘑菇菌丝块接到液体PDA培养基中，于沈 32°C、160 180r/min的摇床培养7 12d，然后过滤，取 0. 4 0. 6g过滤后得到的菌丝转移到160 180mL液体PDA培养基中，于沈 32°C静置培养6 9d，过滤去上清液，得到双孢蘑菇菌丝。
7.根据权利要求3所述的双孢蘑菇原生质体的制备方法，其特征在于所述步骤(2) 的水浴温度为30 32°C。
8.根据权利要求3所述的双孢蘑菇原生质体的制备方法，其特征在于所述步骤(2) 的水浴恒温培养的时间为2. 0 2.池。
9.根据权利要求3所述的双孢蘑菇廉价原生质体的制备方法，其特征在于所述步骤 (3)的过滤是用6层擦镜纸过滤。
10.一种根据权利要求1 9任一项所述的方法制备的双孢蘑菇原生质体。
全文摘要
本发明属于生物工程领域，公开一种双孢蘑菇原生质体及其制备方法。该制备方法如下将菌龄为6～9d的双孢蘑菇菌丝用0.6mol/L KCl与0.6mol/L的甘露醇以体积比1∶1混合制得的渗透压稳定剂预处理后，于28～30℃用含有质量浓度为7.6％的纤维素酶和4％蜗牛酶的混合酶液酶解2～3h，然后离心分离，得到双孢蘑菇原生质体，该原生质体释放量达到9.9×106个/mL，在再生培养基中再生率达到2.11％。本发明采用纤维素酶和蜗牛酶作为混合酶系，比单一的溶壁酶价格低一半以上，降低了科研中双孢蘑菇原生质体的制备费用，为利用原生质体技术进行双孢蘑菇育种奠定了基础。
文档编号C12N5/04GK102492649SQ20111041095
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月12日 优先权日2011年12月12日
发明者梁大伟, 莫美华 申请人:华南农业大学