专利名称：一种获得红霉素链霉菌高产菌株的方法
技术领域：
本发明涉及到基因诱变和基因重组领域，具体表现为紫外诱变和快中子诱变技术，以及原生质体融合技术，获得高产菌株，不仅提高了企业的经济效益，也拓宽了微生物的遗传种质资源，丰富了基因库的内容。
背景技术：
目前红霉素生产菌发酵水平较低，生产成本相对较高，满足不了当今市场的需求。因此选育红霉素高产菌株是红霉素生产发展中有待解决的关键问题。目前常规的理化因子诱变育种在红霉素生产菌的选育中应用较多，诱变育种在一定程度上可以提高菌种生产能力，改善生产菌的性状和抗生素的品质。由于目前环境因素的改变使得红霉素生产菌抗性能力提高，利用单一诱变方法已很难较大程度的提高红霉素生产菌的生产能力。原生质体融合技术可以实现遗传物质的充分重组，能够提高融合子成为高产、并具有优良性状的重组子的可能性。而且原生质体融合往往能够引起细胞质粒的消除，这可以导致细胞染色体的改变，或是次级代谢途径的变化，从而增加高产菌株出现的几率。本发明将两种诱变方法得到的高产菌株经原生质体融合，大大提高了获得高产重组子的几率，能够为生产提供高产菌种，获得较高的经济效益；同时也拓宽了微生物的遗传种质资源，丰富了基因库的内容。
发明内容
本发明的内容与要点分述如下:
一.红霉素链霉菌高产菌株I的获得，其步骤是:
(O筛选出发菌株:选取效价较高且稳定的红霉素链霉菌作为出发菌株。(2)紫外线照射诱变:将出发菌株制备成孢子悬液进行紫外线照射诱变，稀释后涂布于培养皿上培养。(3)筛选高产菌株:随机挑选若干诱变后长出的菌株，制备母斜面，培养成熟后接摇瓶进行发酵培养，测定其效价。(4)遗传稳定性考察:对筛选得到的高产菌株进行多次传代试验，摇瓶考察其遗传性状的稳定性，最终筛选得到高产且稳定的菌株。之上所述的紫外照射条件为15W、30cm照射90s，利用摇瓶考察来筛选高产菌株，所用斜面培养基为:可溶性淀粉6g，玉米浆7g，硫酸铵3g，氯化钠3g，琼脂粉20g，加水定容至1000ml，调pH值至7.2，分析纯碳酸钙2.5g。种子瓶培养基配方为:玉米淀粉28g，糊精7g，中温黄豆饼粉12.6g，硫酸铵1.2g，硝酸铵1.2g，氯化钠3g，玉米浆7.lg，分析纯碳酸钙6g，豆油2ml，加水定容至1000ml，调pH值至7.0。发酵瓶培养基配方为:玉米淀粉18g，糊精24g,中温黄豆饼粉18g,硫酸铵2g,轻质碳酸|丐6g,豆油4ml,加水定容至1000ml,调pH值至7.0。 二.红霉素链霉菌高产菌株II的获得，其步骤是:(I)筛选出发菌株:选取效价较高且稳定的红霉素链霉菌作为出发菌株。(2)快中子照射诱变:将出发菌株制备成孢子悬液进行快中子辐射诱变，稀释后涂布于培养皿上培养。(3)筛选高产菌株:随机挑选若干诱变后长出的菌株，制备母斜面，培养成熟后接摇瓶进行发酵培养，测定其效价。 (4)遗传稳定性考察:对筛选得到的高产菌株进行多次传代试验，摇瓶考察其遗传性状的稳定性，最终筛选得到高产且稳定的菌株。之上所述的快中子辐射剂量为6X 10nN/cm2。之上所述的筛选培养基成分同一。三.高产菌株I和II的原生质体融合，其步骤是:
(I)孢子悬液的制备:将权利要求书I和2中所得到的高产菌株I和II分别制备成孢子悬液。(2)菌体的培养:取适量孢子悬液接入种子瓶内，在适宜条件下将菌体培养至对数生长期。(3)原生质体的融合:将权利要求1和2中得到的高产菌株I和II进行原生质体融合，包括原生质体的分离、融合及再生。(4)筛选高产菌株:随机挑选若干诱变后长出的菌株，制备母斜面，培养成熟后接摇瓶进行发酵培养，测定其效价。(5)遗传稳定性考察:对初筛的高产菌株进行多次传代试验，考察其遗传性状的稳定性，最终筛选得到高产且稳定的菌株。(6)发酵罐试验:将所筛选的高产菌株进行发酵罐试验，测定其效价。之上所述的原生质体融合过程中溶菌酶浓度为2.5mg/ml，34°C，酶解Ih ;热灭活温度为60°C，时间为IOmin ;紫外灭活照射条件为15W、30cm照射150s。本发明的优点及效果
1.本发明中首先对出发菌株进行两种方法的诱变以获得诱变后高产且稳定的菌株，菌株代谢能力起点较高，为后续获得高产的重组子奠定了良好的基础。2.本发明中采用原生质体融合技术对两株红霉素高产菌株进行融合，通过遗传物质的充分重组，获得了高产且具有优良性状的重组子。有效提高了菌株的代谢能力，获得了良好的经济效益，是一种比较理想的微生物菌种选育方法。同时也拓宽了微生物的遗传种质资源，丰富了基因库的内容。
具体实施例方式下面通过实施例子对本发明做进一步说明，下述实例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实例来限定本发明的保护范围。一.紫外和快中子诱变获得高产菌株I和II 1.出发菌株的筛选
用接种铲从沙土管中取适量含有红霉素链霉菌的沙土，放入盛有玻璃珠的三角瓶中，用力震荡以打散孢子，梯度稀释后按梯度分别涂布于平皿上，34土 TC，湿度50%培养9-lld。从平皿上挑取10个单菌落转接入斜面中，成熟后接入到摇瓶中测定其效价(表1)，选择效价高且较稳定的菌株SE7作为出发菌株(表2)。
2.诱变
A.紫外诱变
孢子成熟后，制备孢子悬液，用无菌玻璃珠打散均匀，血球计数板计数，将孢子浓度调整为IO8个/ml，作为待处理菌液，分别取4-5ml加到6个平皿中，打开平皿盖，用15w的紫外灯30 11处分别照射08、308、608、908、1208、1508后黑暗中放置201^11，在红灯下将诱变后的菌液分别稀释IO3-1O4,取0.1ml涂布于筛选培养皿上，用黑布包好后避光，340C，湿度50%培养条件下培养9-lld，记录菌落数，计算致死率。通过大量实验证明，紫外照射时间为90s时，正突变率较高，因此将紫外线照射时间确定为90s (表3)。B.快中子诱变
孢子成熟后，制备孢子悬液，用无菌玻璃珠打散均匀，血球计数板计数，将孢子浓度调整为IO8个/ml，作为待处理菌液，分别取4-5ml加到6个小瓶中，分别用剂量为OXlOllN'cm'3 X IO11N.Cnr2AxiollNcnr2Axio11Ncm'12 X IO11Ncm'15 X IO11N.CnT2 的快中子辐射，将诱变后的菌液分别稀释IO3-1O4,取0.1ml涂布于筛选培养皿上，34°C，湿度50%培养条件下培养9-lld，记录菌落数，计算致死率。通过大量实验证明，快中子剂量为6 X IO11N cnr2时正突变率最高，因此将快中子剂量确定为6X 10nN.CnT2 (表4)。3.筛选高产菌株
随机挑选若干株诱变后长出的菌株，制备母斜面，培养成熟后接摇瓶进行发酵培养，7天后，测定其效价。
其中紫外线诱变突变株UV17效价较高，为5931u/ml，较原始菌株SE7提高了6.1%。其中快中子辐射诱变突变株FN23效价较高。为6143u/ml，较原始菌株SE7提高了
9.3%。4.遗传稳定性考察
为确定初筛高产菌株的稳定性，将突变株UV17和FN23分别进行五次传代传代后转接摇瓶发酵培养，7d后测定各代菌株红霉素效价，效价测定方法为有机溶剂萃取与反萃取法。突变株UV17和FN23性状稳定，因此将两株菌株确定为诱变后高产菌株。二.高产菌株I和II的原生质体融合
1.孢子悬液的制备
取高产菌株I (UV17)和II (FN23)新鲜成熟孢子斜面各一支，将孢子刮下，放入装有无菌水和玻璃珠的三角瓶中，打散均匀后，血球计数板计数，将孢子浓度调整为IO8个/ml，作为待处理菌液。2.菌体培养
在250ml的三角瓶内装25ml种子培养基，接种孢子悬液0.5-1.0ml, 34°C，250rpm振荡培养46h左右。为使生长的菌丝体容易被溶菌酶酶解成原生质体，需加入等体积0.5%的甘氨酸高渗预处理Ih。3.原生质体的融合 A.原生质体的分离3000r/min离心IOmin收集生长较好的菌丝体,用高渗稳定液反复离心洗漆两次,弃上清，加入IOml 2.5mg/ml溶菌酶溶液用吸管轻轻吸打，使菌丝体均匀地悬浮于酶溶液中，34°C水浴中酶解lh，酶解后3000r/min离心lOmin，弃上清，用高渗稳定液反复离心洗涤两次以除去残余溶菌酶，再将原生质体悬浮于定量的高渗溶液中，使得孢子浓度达到IO7-1O8个/ml。B.原生质体的融合
取两种制备好的原生质体各Iml混合，离心去上清，用0.5M CaCl2洗涤，加入PEG4000溶液室温下震荡融合30min。C.原生质体的再生
为了简化融合子的筛选采用亲本灭活的方法处理融合前的原生质体，亲本I (UV17)选择热灭活方法，亲本2 (FN23)采用紫外灭活的方法。亲本I的原生质体悬液在60°C下灭活lOmin，用高渗溶液做10—1，10_2，10_3，10_4梯度稀释后，涂布于高渗完全培养基上。亲本2的原生质体悬液在15W、30cm照射150s，用高渗溶液做10—1，10_2，10_3，10_4梯度稀释后，涂布于高渗完全培养基上。平板分别在34°C培养7d。4.筛选高产菌株
随机挑选若干株融合后长出的菌株，制备母斜面，培养成熟后接摇瓶进行发酵培养，7天后，测定其效价(表5)。其中以融合子PF26效价最高，为6513，较出发菌株SE7提高了 14.5%，较紫外诱变菌株UV17提高了 8.9%，较快中子诱变菌株FN23提高了 5.7%。5.遗传稳定性考察 为确定初筛高产菌株PF26的稳定性，对其进行五次传代，每代菌转接摇瓶发酵培养，7d后测定其红霉素效价，效价测定方法为有机溶剂萃取与反萃取法。PF26性状稳定(表6)，可以确定其为高产且性状稳定的菌株。6.发酵罐试验:将高产菌株PF26进行发酵罐试验，接种量为10%，培养170h后，放罐测定其效价，小试发酵罐效价达到11000u/ml以上。附表:
表I原始菌株效价
权利要求
1.采用紫外线照射诱变选育红霉素链霉菌高产菌株I，其步骤是: (1)筛选出发菌株:选取效价较高且稳定的红霉素链霉菌作为出发菌株； (2)紫外线照射诱变:将出发菌株制备成孢子悬液进行紫外线照射诱变，稀释后涂布于培养皿上培养； (3)筛选高产菌株:随机挑选若干诱变后长出的菌株，制备母斜面，培养成熟后接摇瓶进行发酵培养，测定其效价； (4)遗传稳定性考察:对筛选得到的高产菌株进行多次传代试验，摇瓶考察其遗传性状的稳定性，最终筛选得到高产且稳定的菌株。
2.采用快中子照射诱变选育红霉素链霉菌高产菌株II，其步骤是: (O筛选出发菌株:选取效价较高且稳定的红霉素链霉菌作为出发菌株； (2)快中子照射诱变:将出发菌株制备成孢子悬液进行快中子辐射诱变，稀释后涂布于培养皿上培养； (3)筛选高产菌株:随机挑选若干诱变后长出的菌株，制备母斜面，培养成熟后接摇瓶进行发酵培养，测定其效价； (4)遗传稳定性考察:对筛选得到的高产菌株进行多次传代试验，摇瓶考察其遗传性状的稳定性，最终筛选得到高产且稳定的菌株。
3.采用原生质体融合技术将权利要求1和权利要求2中获得的高产菌株I和II进行融合，获得新的高产重组子，其步骤是: (1)孢子悬液的制备:将权利要求书I和2中所得到的高产菌株I和II分别制备成孢子悬液； (2)菌体的培养:取适量孢子悬液接入种子瓶内，在适宜条件下将菌体培养至对数生长期； (3)原生质体的融合:将权利要求1和2中得到的高产菌株进行原生质体融合，包括原生质体的分离、融合及再生； (4)筛选高产菌株:随机挑选若干诱变后长出的菌株，制备母斜面，培养成熟后接摇瓶进行发酵培养，测定其效价； (5)遗传稳定性考察:对初筛的高产菌株进行多次传代试验，考察其遗传性状的稳定性，最终筛选到高产且稳定的菌株； (6)发酵罐试验:将所筛选的高产菌株进行发酵罐试验，测定其效价。
4.根据权利要求1所述的采用紫外线照射诱变获得红霉素链霉菌高产菌株的方法，其特征在于:所述的紫外照射条件为15W、30cm照射90s。
5.根据权利要求2所述的采用快中子照射诱变获得红霉素链霉菌高产菌株的方法，其特征在于:所述的快中子辐射剂量为6X10nN/cm2。
6.根据权利要求3所述的采用原生质体融合的方式将两株高产菌株融合获得新的高产重组子的方法，其特征在于:溶菌酶浓度为2.5mg/ml，34°C，酶解Ih ;热灭活温度为60°C，时间为IOmin ;紫外灭活照射条件为15W、30cm照射150s。
7.根据权利要求1、 要求2和要求3中所述的红霉素链霉菌高产菌株的初筛和复筛方法，其特征在于:利用摇瓶发酵培养测定红霉素效价的方式来筛选高产菌株，所用斜面培养基为:可溶性淀粉6g,玉米楽；7g,硫酸铵3g,氯化钠3g,琼脂粉20g,加水定容至1000ml,调pH值至7.2，分析纯碳酸钙2.5g ;种子瓶培养基配方为:玉米淀粉28g，糊精7g，中温黄豆饼粉12.6g,硫酸铵1.2g,硝酸铵1.2g,氯化钠3g,玉米楽；7.1g,分析纯碳酸韩6g,豆油2ml,加水定容至1000ml，调pH值至7.0 ;发酵瓶培养基配方为:玉米淀粉18g，糊精24g，中温黄豆饼粉18g,硫酸铵2g,轻质碳酸|丐6g,豆油4ml,加水定容至1000ml,调pH值至7.0。
8.根据权利要求3所述的发酵罐试验的方法，其特征在于:所用种子罐培养基配方为:玉米淀粉15g,糊精30g,黄豆饼粉15g,氯化钠2g,硫酸铵1.2g,玉米楽；3g,轻质碳酸 丐8g,豆油5ml，消沫剂0.3ml ;发酵罐培养基为:玉米淀粉30g，糊精10g，黄豆饼粉30g，氯化钠2g,硫 酸铵1.8g,玉米楽:13g，轻质碳酸隹丐8g，豆油5ml,消沫剂0.3ml。
全文摘要
本发明涉及一种获得红霉素链霉菌高产菌株的方法，其特征是先利用紫外线和快中子分别诱变红霉素链霉菌，获得高产菌株Ⅰ和Ⅱ，再利用原生质体融合技术将两株高产菌株融合获得新的高产重组子。该重组子摇瓶效价为6513u/ml，较原始菌株提高了14.5%，较诱变菌株Ⅰ和Ⅱ分别提高了8.9%和5.7%，经多次传代后效价稳定，小试发酵效价达到11000u/ml以上。该方法有效地提高了菌株的代谢能力，获得了良好的经济效益，是一种比较理想的微生物菌种选育方法。
文档编号C12N15/03GK103160445SQ20111041102
公开日2013年6月19日 申请日期2011年12月12日 优先权日2011年12月12日
发明者李瑾, 程传东, 何海燕, 张丽丽, 于新令, 王凤滩 申请人:山东方明药业集团股份有限公司