改进的dna亚硫酸氢盐转化的制作方法

专利名称：改进的dna亚硫酸氢盐转化的制作方法
改进的DNA亚硫酸氢盐转化本分案申请是基于申请号为200480029442. 3，申请日为2004年10月11日，发明名称为“改进的DNA亚硫酸氢盐转化”的中国专利申请的分案申请。
背景技术：
本发明涉及DNA中胞嘧啶甲基化的检测方法。5-甲基胞嘧啶是真核细胞DNA中最常见的共价修饰碱基。例如，它在转录调控、遗传印记和肿瘤发生中起作用(综述参见 Millar 等人Five not four :History and significance of the fifth base.在 S. Beck 和 A.01ek，eds. :The Epigenome. Wiley-VCH Verlag Weinheim 2003, S. 3-20) 因此 5-甲基胞嘧啶作为遗传信息组分的鉴定是非常有意义的。但是不能通过测序鉴定5-甲基胞嘧啶的位置，原因是5-甲基胞嘧啶与胞嘧啶有相同的碱基配对行为。此外，在PCR扩增时， 5-甲基胞嘧啶携带的后生信息(印igenetic information)完全丢失。对甲基化分析的通常方法基本上依据两个不同的原理操作。或者使用甲基化特异的限制酶，或者对未甲基化的胞嘧啶进行选择性的化学转化(亚硫酸氢盐处理)成尿嘧啶。然后对经过酶学或者化学预处理的DNA进行扩增，可以用不同的方法进行分析(综述参见 Fraga 禾口 Esteller :DNA Methylation :A Profile of Methods and Applications. Biotechniques 33 :632-649, Sept. 2002). WO 02/072880 pp.Iff)。因为甲基化特异的酶的使用只限于含有被所述酶识别的限制位点的某些序列，所以对于大多数应用进行的是亚硫酸氢盐处理(综述参见US 10/311,661)。根据本发明“亚硫酸氢盐反应”、“亚硫酸氢盐处理”或者“亚硫酸氢盐方法”指的是在亚硫酸氢根离子存在的条件下将核酸中的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶碱基的反应， 而5-甲基胞嘧啶基本上没有转化。亚硫酸氢盐反应含有脱氨基步骤以及脱磺酸基步骤， 这两步可以分别或者同时进行(在EP1394172A1中描述了进一步的细节并且显示了反应方案，该文献的全部在此引用作为参考)。有各种不同的文献讨论了亚硫酸氢盐反应的特殊方面，包括 Hayatsu 等人，Biochemistry 9(1970)2858-28659 ；Slae 和 Shapiro, J. Org. Chem. 43(1978)4197-4200 ；Paul in 等人，Nucl. Acids Res. 26(1998)5009-5010 ； Raizis ^ A, Anal Biochem. 226(1995),161-1666 ；Wang ^ A Nucleic Acids Res. 8(1980)4777-4790。这些文献在EP 1394172A1中给予总结(在此引用其全部作为参考)。亚硫酸氢盐处理通常按照以下的方式进行分离基因组DNA，用机械或者酶学方法使其片段化，氢氧化钠变性，使用浓亚硫酸氢盐溶液转化几个小时，最后脱磺酸基和脱盐 (例如Frommer等人:A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc Natl Acad Sci USA. 1992 Mar 1 ；89 (5) :1827-31 ；在此引用其全部作为参考)。最近开发出了亚硫酸氢盐方法的几种技术改进。琼脂糖小珠法将研究的DNA加入到琼脂糖基质中，这样防止了 DNA的扩散和复性(亚硫酸氢盐只与单链的DNA反应)， 并且所有的沉淀和纯化步骤被快速透析所替代(Olek A.等人A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis,Nucl. Acids Res. 1996,24，5OM-5O66)。在专利申请 1001/985沘(=DE IOO299I5 ;= US 申请 10/；311，66I)中，描述了亚硫酸氢盐转化，其中在变性剂和/或溶剂以及至少一种清除剂(scavenger)存在下， DNA样品与浓度范围在0. lmol/L到6mol/L的亚硫酸氢盐溶液共同温育。在所述的专利申请中描述了几种适宜的变性剂和清除剂(文献的全部在这里引用作为参考)。在专利申请 WO 03/038121( = DE 10154317 ；= 10/416,624)中，公开了在亚硫酸氢盐处理过程中将要被分析的DNA结合到固相表面的方法。因此有助于纯化和洗涤步骤的进行。在专利申请 EP1394173A1和EP1394172A1 (其整体在这里引用作为参考)中描述了进一步的改进。但是亚硫酸氢盐处理中的主要问题是需要长的反应时间，以确保完全转化并且排除假阳性结果。但是由于长的反应时间，这同时导致DNA的降解。更高的反应温度的确产生更高转化率，但是也产生更为强烈的DNA降解。最近对温度、反应时间、转化率以及降解之间的相互作用进行了系统的研究。这样能够表明最高的转化率在温度为55°C (反应时间在4到18小时之间)和95°C (反应时间为1小时)时获得。但是一个严重的问题时在这一过程中DNA的降解。在反应温度为55°C时，84-96%的DNA被分解。95°C时降解实际上更高(Grunau 等人Bisulfite genomic sequencing :systematic investigation of critical experimental parameters. Nucleic Acids Res. 2001 Jul 1 ；29 (13) :E65_5 ; 其全部在这里引用作为参考)。因此，大多数作者使用的反应温度是大约50°C (参见 Frommer等人，在上述引文中1992,p. 1827 ；Olek等人，在上述引文中1996,p. 5065 ；Raizis et al :A bisulfite method of 5-methylcytosine mapping that minimizes template degradation. Anal Biochem. 1995 Mar 20 ；226(1) :161_6，162)。除了高的DNA降解率，在传统的亚硫酸氢盐方法中还有另外一个问题，即至今还没有描述对转化后DNA的强有力的纯化方法。许多作者使用沉淀(参见Grimau等人，在上述引文中)。也已经有通过DNA结合表面进行的纯化(参见Kawakami等人 Hypermethylated APC DNA in plasma and prognosis of patients with esophageal adenocarcinoma. Journal of the National Cancer Institute, Vol.92, No. 22,2000, pp. 1805-11)。但是这些纯化的产率有限。由于传统亚硫酸氢盐处理中DNA的大量损失，如果研究中需要进行分析的DNA只有有限量，使用这些方法进行研究是有问题的。但是甲基化分析的一个特别有趣的领域是， 通过对来自体液例如血液或者尿的DNA进行分析，诊断与甲基化状态改变相关的癌症疾病或者其他病症。但是DNA只是以很小的浓度存在于体液中，使得甲基化分析的应用受到传统亚硫酸氢盐处理的低产量的限制。因此，基于甲基化分析的特殊重要性以及所描述的传统方法学的缺点，对亚硫酸氢盐转化的改进方法有急切的技术上的需要。现在发现加入某些变性溶剂，以出人意料的、令人惊奇的方式提高亚硫酸氢盐反应的转化率。同时，降低了所需的反应时间因此降解率也降低。尽管在本领域中已经知道使用变性溶剂，但是本领域内的技术人员还是不能预料在本发明中选择的溶剂能够产生如此强烈的效果。除了明显提高的转化率和降低的降解率以外，使用所述的溶剂产生另一个重要的优点通常亚硫酸氢盐处理是在高浓度亚硫酸氢盐的条件下进行的(Fraga和 hteller推荐的最终浓度是5mol/l ；参见以上，p. 642，左栏，第二段)。但是如此高的盐浓度导致高的降解，并且使接下来的纯化和扩增中产生问题。根据本发明，与已知的变性溶剂相比，使用正烷撑二醇(n-alkylenglycol)作为变性剂的另一个优点是这些溶剂具有更高的水溶性。所以反应化合物包括清除剂可以在更广的浓度范围下进行应用。将这些新型溶剂与优化的反应条件和新型纯化方法相组合，转化效率可以进一步提高。对组织或者体液进行敏感的DNA甲基化分析就变得可能了。发明描述本发明的一个实施方案是DNA的亚硫酸氢盐转化方法，其中DNA与亚硫酸氢盐试剂反应，其特征在于所述的反应在选自二喊烷、其衍生物之一以及类似的脂肪族环醚的化合物的存在下进行。本发明的另一个实施方案是DNA的亚硫酸氢盐转化方法，其中DNA与亚硫酸氢盐试剂反应，其特征在于所述的反应在具有下式的化合物存在下进行η = 1-35000m = 1-3R1 = H, Me, Et, Pr, BuR2 = H，Me，Et，Pr，Bu因此优选的是正烷撑二醇化合物，特别是其二烷基醚，特别是二甘醇二甲醚 (DME) ο对于两个实施方案，研究的DNA可以来自不同的来源，这取决于是诊断还是科学研究的目的。对于诊断研究，优选使用组织样品作为原料，但是体液，特别是血清或者血浆也可以使用。也可以使用来自痰、粪便、尿或者脑脊液的DNA。优选地，DNA从生物样本中分离。根据标准的方法，例如使用Qiagen UltraSens DNA提取试剂盒从血液中提取DNA。其他纯化DNA的方法对本领域内的技术人员是已知的。接下来可以对分离的DNA进行片段化，例如通过与限制酶进行反应。反应条件和使用的酶对于本领域内的技术人员是已知的，且来自例如生产商提供的实验方案。可以根据以上所示的已知的实验方案进行亚硫酸氢盐转化。反应可在溶液中进行，也可以在结合在固相上的DNA上进行。优选地，使用sodium disulf ite (=亚硫酸氢钠 /焦亚硫酸钠)，原因是它在水中比亚硫酸钠更易溶。在水溶液中，disulf ite盐与胞嘧啶转化所需的亚硫酸氢根(hydrogen sulfite)阴离子不成比例。在以下讨论亚硫酸氢盐的浓度时，这指的是在反应溶液中亚硫酸氢根和亚硫酸根阴离子的浓度。对于根据本发明的方法，可能的浓度范围是0. l-6mol/L (参见上面)。特别优选的是浓度范围是l-6mol/L，最特别优选的是2-4mol/L。但是，在使用二.喊烷时，能够使用的亚硫酸氢盐最大浓度更低(参见以下)。在选择亚硫酸氢盐浓度时，必须要考虑高浓度的亚硫酸氢盐产生高的转化，但是由于更低的PH，也导致高的分解率。可以使用不同浓度的二喊烷。优选地，二喊烷的浓度从10%到35% (体积/体积)，特别优选的是20-30%，最特别优选的是22-28 %，特别是25 %。高于35 %的二碌烷浓度是有问题的，因为这会使反应溶液中产生两相。在使用浓度22-28%的二,碌烷的特别优选的实施方案中，最终的优选亚硫酸氢盐浓度是3. 3-3. 6mol/L，在使用浓度25%的二喊烷的最特别优选的实施方案中，最终的优选亚硫酸氢盐浓度是3. 5mol/L (参见实施例)。可以在不同浓度范围内使用根据本发明的正烷撑二醇混合物。优选使用的DME浓度是1-35% (体积/体积)。优选为5-25%，最优选是10% DME。
根据本发明使用的优选清除剂是色烷(chromane)衍生物，例如6_羟基_2，5，7， 8-四甲基色烷2-羧酸(也被称为Trolox-C )。在专利申请W001/98528 ( = DE 10029915 ； =US申请10/311，661 ；其整体在这里引用作为参考)中列出了其他的清除剂。可以在0_95°C摄氏度的广阔温度范围内进行亚硫酸氢盐转化(参见以上)。但是由于在更高温度下DNA的转化和分解率都提高，在优选的实施方案中反应温度在30-70°C。 特别优选的范围是45-60°C。最特别优选的是50-55°C。亚硫酸氢盐处理最佳的反应时间取决于反应的温度。反应时间一般是1到18小时(参见Grunau等人2001，在上述引文中)。 对于50°C的反应温度，反应时间一般是4-6小时。在根据本发明的方法的特别优选的实施方案中，亚硫酸氢盐转化在温和的反应温度下进行，其中在反应进行的过程中，反应温度至少一次明显地短暂升高。这样，亚硫酸氢盐的转化效率可以被令人惊奇地明显升高。短暂持续的温度升高在以下被称为“热尖峰 (thermospikes) ”。在热类峰以外的标准反应温度定义为基础反应温度。如以上所描述的， 基础反应温度为0-80°C，优选在30-70°C，最优选在45-55°C。在热尖峰中，通过至少一次热尖峰使反应温度升高到85°C以上。最佳的热尖峰数目是基础温度的函数。最佳热尖峰数目越多，基础温度越低。在每个情况下至少需要一个热尖峰。另一方面，原则上任何数目的热尖峰都是可能的。当然必须考虑到温度多次提高，DNA的分解速率也提高，就不能再保证最佳的转化。因此优选的热尖峰数目是每次1到10个热尖峰，这取决于基础反应温度。因此特别优选的热尖峰数目是2到5个。热尖峰使反应温度优选升高到85-100°C，特别优选升高到90-98°C，最优选升高到94-96°C。热尖峰的持续时间也取决于反应批次的体积。必须确保温度在整个反应溶液中均勻升高。在使用热循环仪时，对于20 μ 1的反应批次，持续时间在15秒到1. 5分钟，特别地优选持续时间为20到50秒。在一个特别优选的实施方案中持续时间是30秒。对100 μ 1 的体积进行操作时优选的范围在30秒到5分钟之间，特别是在1到3分钟之间。特别优选是1. 5分钟。对于600 μ 1的体积，优选的持续时间是1到6分钟，特别是2到4分钟。特别优选的持续时间是3分钟。本领域内的技术人员能够很容易地根据各种不同的反应体积确定适宜的热尖峰持续时间。在亚硫酸氢盐转化反应中，即使没有使用以上描述的变性溶剂，以上描述的使用热尖峰产生了显著更好的转化率。根据本发明，DNA的亚硫酸氢盐转化方法特征在于基础反应温度在0-80°C，在转化过程中，反应温度至少一次短暂升高到85°C以上。可以根据以上的描述处理原料。优选的温度范围、热尖峰的数目以及它们的持续时间与以上描述的范围一致。因此基础反应温度在0-80°C，优选在30-70°C，最优选在45-55°C。通过至少一次热尖峰使反应温度升高到85°C以上。优选的热尖峰数目是1到10个热尖峰，这取决于基础反应温度。 特别优选的热尖峰数目是2到5个。在热尖峰中，反应温度优选升高到85-100°C，特别优选升高到90-98°C，最优选升高到94-96°C。温度升高的持续时间也取决于反应批次的体积(参见以上)。完成亚硫酸氢盐转化后，将DNA去磺酸基并纯化。已知对于这个目的有不同的方法(例如参见 DE 10154317A1 = US 10/416，6 ;Grunau 等人 2001，在上述引文中)。一般地，首先使用氢氧化钠处理反应溶液。接下来进行DNA的中和以及乙醇沉淀。在根据本发明的上述实施方案的优选实施方案中，通过凝胶过滤例如使用kphadex-G25柱进行纯化。这样可以非常有效地除去亚硫酸氢盐，不需要进一步的洗涤步骤。在另一个优选的实施方案中，通过DNA结合表面例如通过Promega的Wizard DNA纯化树脂(参见Kawakami 等人，在上述引文中)进行纯化。第三个优选的实施方案使用磁性颗粒用于纯化，例如使用 Magna-Pure方法。这些纯化方法与根据本发明的正烷撑二醇化合物组合，特别是与DME组合，产生特别好的结果。根据生产商的说明进行纯化。本领域内的技术人员还知道通过使用标准的实验，改变生产商的说明产量可能得到进一步提高。因此，经过优化的实验方案也是本发明的一部分。通过凝胶过滤、DNA结合表面以及磁性颗粒纯化核酸的进一步技术说明是本领域的技术人员已知的，并且在例如生产商的说明中提供。在最特别优选的实施方案中，使用超滤方式进行纯化。这一方法具有几个技术优势，并且使转化后的DNA被令人惊奇地成功纯化。转化后的DNA回收率非常高(大于85%，参见实施例6)。这对于高分子量的DNA以及片段化的DNA如体液中发现的DNA都是如此。相反，分离亚硫酸氢盐处理的DNA 的通常方法，其回收率只有大约25%。超滤还有其他优点。例如，就使用的样品体积而言， 纯化是非常灵活的。此外，亚硫酸氢盐可以几乎完全除去。而且，去磺酸基可以在滤膜上进行，这进一步节约了时间。本领域内技术人员知道不同的商品化的超滤系统，可以在根据本发明的方法中使用它们。在一个优选的实施方案中，使用了 Millipore的Microcon 柱。这样纯化可以根据修改后的生产商的实验方案进行。为此将亚硫酸氢盐反应溶液与水混和， 加到超滤膜上。接下来离心超滤溶液大约15分钟，然后使用IXTE缓冲液洗涤。在这一处理中，DNA留在了膜上。接下来进行去磺酸基。为此加入0.2mol/L氢氧化钠，并将DNA温育10分钟。然后进行另一次离心(10分钟)，接下来使用IXTE缓冲液洗涤。接下来洗脱 DNA。为此，用50μ 1温的IXTE缓冲液(50°C )与膜混和10分钟。根据生产商的说明将膜反过来，重复离心，这样将DNA从膜上移下来。现在可以直接使用洗脱物用于计划中的检测反应。本领域内的技术人员已知使用其他超滤系统时可能涉及其他的步骤，也可以通过改变以上提到的条件得到良好的产量。相应的实施方案也是本发明的部分。在不使用以上描述的变性溶剂或者在不使用热尖峰进行转化时，使用以上描述的超滤也促进了亚硫酸氢盐转化后的DNA纯化的显著改善。因此，根据本发明，DNA的亚硫酸氢盐转化的方法特征在于转化后的DNA的纯化通过超滤方式进行。这样可以根据以上的描述处理原料。也可以使用热尖峰。优选的温度范围、热尖峰的数目以及它们的持续时间与以上描述的范围一致(参见以上)。而且，超滤优选地根据以上描述进行。因此，可以使用不同的超滤系统。在优选的实施方案中，使用Millipore的Microcon 柱。纯化优选根据修改的生产商的实验方案按照以上的描述进行。本领域内的技术人员已知使用其他超滤系统时可能涉及其他的步骤，也可以通过改变以上提到的条件得到进一步提高的产量。相应的实施方案也是本发明的部分。通过以上描述的不同实施方案经过转化和纯化的DNA，现在可以用不同方式进行分析了。非常优选地首先通过聚合酶链式反应扩增DNA。这样，可以通过不同的方法，例如通过所谓的“重甲基(HeavyMethyl) ”方法(综述参见Cottrell等人；A real-time PCR assay for DNA-methylation using methyIation-specific blockers. Nucleic Acids Res. 2004 Jan 13 ;32 (1) :elO. W002/072880)或者所谓的“甲基化敏感 PCR”( 〃 MSP"； 参见 Herman 等人Methylation-specific PCR -.a novel PCR assay for methylationstatus of CpG islands. Proc Natl Acad Sci USA. 1996Sep 3 ；93(18) :9821-6)确保对原来甲基化或者非甲基化的DNA进行选择性的扩增。可以通过常规方法例如引物延伸反应(“MsSNuPE"；参见例如=DE 10010280 = US 10/220, 090)或者与寡聚体阵列杂交(参见例如Adorjan 等人，Tumour class prediction and discovery by microarray-based DNA methylation analysis. Nucleic Acids Res. 2002Mar 1 ；30 (5) :e21)对得至Ij 的扩增产物进行检测。在另一个特别优选的实施方案中，使用实时PCR的变异方法(参见US 6，331，393〃 Methyl Light")对扩增产物进行分析。因此优选的变异方法是“Taqman”以及 “Lightcycler” 方法。这里公开的方法优选地用于患者或者个体的有害事件的诊断和/或预后，其中这些有害事件属于以下的种类的至少一种不希望的药物相互作用；癌症疾病；CNS机能障碍、损伤和疾病；攻击症状或者行为障碍；脑损伤的临床、心理以及社会的后果；精神障碍和性格疾患；痴呆和/或相关的综合征；心血管疾病、功能障碍和损伤；胃肠道功能障碍、损伤或者疾病；呼吸系统功能障碍、损伤或者疾病；损伤、发炎、感染、免疫性和/或恢复期；由于发育过程异常产生的身体的功能障碍、损伤或者疾病；皮肤、肌肉结缔组织或者骨骼的功能障碍、损伤或者疾病；内分泌和代谢功能障碍、损伤或者疾病；头痛或者性功能障碍。新方法还以特别优选的方式区分细胞类型、组织或者研究细胞分化。新方法还以特别优选的方式用于分析患者对药物治疗的反应。本发明的对象还是试剂盒，试剂盒含有含亚硫酸氢盐的试剂、变性剂或者溶剂以及清除剂，用于产生扩增产物的引物以及选择地，超滤管或者进行检测的说明。
实施例 以下的实施例解释了本发明。实施例1 自动进行的亚硫酸氢盐反应本实施例描述了检测基因组DNA样品中因子VIII基因的胞嘧啶甲基化状态的方法的应用，根据生产商的说明DNA样品使用限制性核酸内切酶处理。该方法基于具有四个分开的、垂直可移动的适配器的用于可交换的吸头的自动化移液系统(MWG RoboSeq 4204) 的应用，这样避免交叉污染。移液系统可使100 μ 1 (等分试样)移液误差小于士2 μ 1。自动化移液系统的操作台配有六个用于移液吸头的架子以及八个移液位置(其中两个可以被冷却)，可以冷却的试剂架，可以堆放10个微量滴定平板的堆垛系统(stacking system)， 移液吸头清洗站以及将移液吸头从适配器上分开的装置。自动移液系统通过连续的界面与计算机相连，通过软件程序被控制，软件程序可以对本发明方法的应用所需的所有移液步骤进行自由编程。在本方法的第一步中，手动将DNA样品的等分试样置于微量滴定板96个可自由选择的位置中的一个。然后使用Eppendorf MasterCycler将微量滴定板加热到96°C， 使预处理的DNA样品变性。然后将微量滴定板转移到自动移液系统中。将变性剂(二碟烷)、3. 3M亚硫酸氢钠溶液以及溶于所使用变性剂中的清除剂溶液的等分试样以程控的方式一个接一个从试剂架上移液到所有含有DNA的位置中。然后微量滴定板在Eppendorf Mastercycler中温育，使DNA样品中所有未甲基化的胞嘧啶残基在亚硫酸氢钠的作用下转化为亚硫酸氢盐的加合物。
在亚硫酸氢盐处理以后，将微量滴定板从热循环仪中转移到自动移液系统中。然后装上相同类型的第二微量滴定板。首先将碱性的Tris-HCl缓冲液(pH9. 5)然后将亚硫酸氢盐处理的DNA等分试样转移到在所有室(chamber)内的第二块微量滴定板上的相应位置中(它们在第一块平板上的相应的位置处含有亚硫酸氢盐处理的DNA样品)。在碱性溶液中未甲基化的胞嘧啶残基的亚硫酸氢盐加合物被转化为尿嘧啶残基。通过聚合酶链式反应(PCR)进行亚硫酸氢盐处理的DNA的一条链(在本实施例中是有义链)的靶向扩增。使用了一对类型1引物(AGG GAG TTT TTT TTA GGG AAT AGA GGG A(SEQ. ID 1)禾口 TAA TCC CAA AAC CTC TCC ACT ACA ACA A(SEQ ID :2)，这使被亚硫酸氢盐成功处理的DNA链被特异地扩增，而未甲基化的胞嘧啶残基没有被转化或者被完全转化为尿嘧啶残基的DNA链则不能被扩增。将第三个相同类型的微量滴定板置于自动移液系统中进行PCR反应。在所有的室中(其在第一块平板上的相应的位置含有亚硫酸氢盐处理的 DNA样品)首先自动移入含有PCR缓冲液、DNA聚合酶以及类型1引物的储液的等分试样。 然后将稀释后的亚硫酸氢盐处理的DNA的等分试样从第二块微量滴定板的每一个位置自动转移到第三块微量滴定板的相应位置上，之后将第三块平板转移到循环仪中进行PCR反应。使用琼脂糖凝胶电泳以及接下来溴乙啶染色鉴定PCR产物(

图1)。图1显示了 PCR扩增的亚硫酸氢盐处理的DNA链的凝胶图像(左侧分子量标志，右侧PCR产物)。实施例2 通过加入二碌烷对亚硫酸氢盐转化进行优化，用于检测血浆样品中的 DNA将会显示优化的亚硫酸氢盐方法可对来自体液的DNA进行敏感甲基化分析。为了这个目的，将1毫升人血浆与特异量的人DNA混和。使用Magna Pure方法(Roche)根据生产商的说明从血浆样品中分离DNA。纯化得到的100 μ 1洗脱物完全用于以下的亚硫酸氢盐反应中。根据标准方法(Frommer等人，在上述引文中)进行转化作为对照。根据本发明的方法的步骤如下洗脱物与3Μ μ 1亚硫酸氢盐溶液(5. 89mol/L)以及146 μ 1含有自由基清除剂(6-羟基-2，5，7，8-四甲基色烷2-羧酸，98. 6毫克溶于2. 5毫升二喊烷)的二碌烷混和。反应混合物在99°C变性3分钟，接下来在以下的温度程序中温育，共5小时 500C 30分钟；一次热尖峰(99. 90C ) 3分钟；50°C 1. 5小时；一次热尖峰(99. 9°C )3分钟； 500C 3小时。接下来通过超滤使用Millipore的Microcon 柱纯化对照和根据本发明的方法的反应混合物。纯化基本上根据生产商的说明进行。为此将反应混合物与300 μ 1水混和，加到超滤膜上，离心15分钟，然后使用IXTE缓冲液洗涤。在这一处理中，DNA留在了膜上。接下来进行脱磺酸基。为此加入0.2mol/L氢氧化钠，并温育10分钟。然后进行离心 (10分钟)，接下来使用IX TE缓冲液洗涤。这以后洗脱DNA。为此，用50 μ 1温的IX TE缓冲液(50°C)与膜混和10分钟。根据生产商的说明将膜反过来。接下来重复离心，这样将 DNA从膜上移下来。使用10 μ 1洗脱物用于以下的Lightcycler实时PCR。对人β -肌动蛋白的一部分进行分析(参见Miyamoto Nucleotide sequence of the human beta-actin promoter 5' flanking region ；Nucleic Acids Res. 15 (21)，9095 (1987))。使用以下的弓丨物和探针正向引物:TGG TGA TGG AGG AGG TTT AGT MG T(SEQ ID 3)；反向引物-MC CM TM AAC CTA CTC CTC CCT TAA (SEQ ID 4)；供体探针TTG TGA ATT TGT GTT TGT TAT TGT GTG TTG-flou(SEQ ID 5)；受体探针LC Red640_TGG TGG TTA TTT TTT TTA TTA GGT TGT GGT-Phos (SEQ ID 6)。通过亚硫酸氢盐特异的试验进行扩增。使用Lightcycle软件对荧光信号进行检测和计算。可以与标准曲线进行比较对转化的并且分离的DNA定量。优化的方法产生的DNA浓度是133. 21ng/100 μ 1，而传统的方法产生的DNA浓度是41. 03ng/100 μ 1。 因此根据本发明的方法能使DNA产量比传统方法高3倍。 实施例3通过加入DME优化亚硫酸氢盐转化，用于检测血浆样品中的DNA
将会显示优化的亚硫酸氢盐方法可对来自体液的DNA进行敏感甲基化分析。为了这个目的，将1毫升人血浆与特异量的人DNA混和。使用Magna Pure方法(Roche)根据生产商的说明从血浆样品中分离DNA。纯化得到的100 μ 1洗脱物完全用于以下亚硫酸氢盐反应中。根据标准方法(Frommer等人，在上述引文中)进行的转化作为对照。根据本发明的方法的步骤如下洗脱物与3M μ 1亚硫酸氢盐溶液(5. 89mol/L)以及46 μ 1含有自由基清除剂(6-羟基-2，5，7，8-四甲基色烷2-羧酸，98. 6毫克溶于787 μ 1的DME)的DME混和。 反应混合物在99°C变性3分钟，接下来在以下的温度程序中温育，共5小时50°C 30分钟； 一次热尖峰(99. 9°C ) 3分钟；50°C 1. 5小时；一次热尖峰(99. 9°C ) 3分钟；50°C 3小时。接下来通过超滤使用Millipore的Microcon 柱纯化对照和根据本发明的方法的反应混合物。纯化基本上根据生产商的说明进行。为此将反应混合物与300 μ 1水混和，加到超滤膜上，离心15分钟，然后使用IXTE缓冲液洗涤。在这一处理中，DNA留在了膜上。接下来进行脱磺酸基。为此在DNA中加入0. 2mol/L氢氧化钠，温育10分钟。然后进行离心(10分钟)，接下来使用IXTE缓冲液洗涤。这以后洗脱DNA。为此，用50μ1温的IXTE缓冲液 (500C )与膜混和10分钟。根据生产商的说明将膜反过来。接下来重复离心，这样将DNA从膜上移下来。使用10 μ 1洗脱物用于以下的Lightcycler实时PCR。通过使用实施例2中所述的引物和探针对人肌动蛋白区域进行分析。通过亚硫酸氢盐特异的试验进行扩增。 使用Lightcycler软件计算的结果在图2中示出。左侧的曲线对应于优化的方法，而右侧的曲线对应于传统方法。显示即使使用小的循环数目，优化后的方法也产生了显著的荧光信号。因此DNA产量比传统方法高。可以与标准曲线进行比较对转化的DNA定量。优化的方法产生的DNA浓度是133. 27ng/100 μ 1，而传统的方法产生的DNA浓度是41. 03ng/100 μ 1。 因此根据本发明的方法能使DNA产量比传统方法高3倍。实施例4在热尖峰的帮助下进行亚硫酸氢盐转化向1 μ 1 MssI酶切的高纯度人DNA(Promega ； 160ng)中加入2 μ 1 ddH20。样品在 96°C下变性10分钟。然后加入大约10 μ 1亚硫酸氢盐溶液(5. 85mol/L)和7 μ 1自由基消除剂/ 二碌烷混合物(5 μ 1 二喊烷和2 μ 1清除剂)。这以后取出第一个样品(0小时)置于冰上。反应混合物在961温育30秒然后在501温育59.5分钟。取出第二个样品(1小时)置于冰上。第三个样品O小时)再次在96°C孵育30秒然后在50°C育59. 5分钟。然后该样品也置于冰上。第四个样品(3小时)再次在96°C温育30秒然后在50°C温育59. 5 分钟，接下来冷却。向样品中加入30 μ 1 ddH20。通过G25S印hadex柱纯化反应混合物。洗脱物与50 μ 1 1 OOmmo 1/L Tris-HCl (ρΗ9. 5)混和在96°C下脱磺酸基20分钟。每个PCR反应使用2 μ 1该溶液。在PCR中每次扩增两个亚硫酸氢盐特异的片段、两个非特异的片段以及一个基因组片段。随着亚硫酸氢盐转化进行，亚硫酸氢盐特异的片段被更为强烈地扩增出来。非特异片段的扩增与亚硫酸氢盐转化无关，它提供了 DNA降解的指示。只有没有被亚硫酸氢盐转化的基因组DNA仍然存在才有基因组片段被扩增。因此基团组DNA扩增是不完全亚硫酸氢盐转化的测量。在琼脂糖凝酸中分离的扩增产物可参见图3。这里显示在根据本发明的方法中即使在1小时以后大部分的DNA都已经被转化。最晚3小时以后已经不能再检测出基因组DNA 了，即亚硫酸氢盐的转化是完全的。在传统的亚硫酸氢盐处理中，相应的数值最早也要在5小时以后(参见下面)才产生。实施例5使用热尖峰的亚硫酸氢盐处理与没有热尖峰的亚硫酸氢盐处理的比较如实施例4中进行处理的样品温育3或者5小时的反应时间，具有两次热尖峰。对照反应没有热尖峰。根据以上的描述进行纯化和PCR。扩增了两个亚硫酸氢盐特异的片段。 其中一个片段富含胞嘧啶。这样需要相对较长的反应时间以获得完全的转化。相反，另一个片段具有少量的胞嘧啶因此在相对较短的时间之后即被完全转化。扩增的结果示于图4 中。在左图中可以看到传统的亚硫酸氢盐转化，而在右图中可以看到使用热尖峰的优化的转化。每一幅图内富含胞嘧啶的片段都示于左侧，而含少量胞嘧啶的片段示于右侧。图中显示根据本发明的方法能进行明显更灵敏的检测。因此，使用热尖峰处理，即使在3小时以后，富含胞嘧啶的片段也可以被明确地检测出来，而使用传统的方法即使在5小时反应时间之后，富含胞嘧啶的片段也不能被检测出来。实施例6在根据本发明的方法中DNA的回收率将会显示根据本发明的方法能非常有效地进行亚硫酸氢盐转化和纯化。为了这个目的，将不同量的M13-DNA和人DNA溶于100 μ 1水中。DNA溶液与3Μ μ 1亚硫酸氢盐溶液 (5. 89mol/L)以及146 μ 1含有自由基清除剂(6-羟基-2，5，7，8-四甲基色烷2-羧酸，98. 6 毫克溶于2.5毫升二喊烷)的二.喊烷混和。反应混合物在99°C变性3分钟，接下来在以下的温度程序中温育，共5小时50°C 30分钟；一次热尖峰(99. 9°C )3分钟；50°C 1. 5小时； 一次热尖峰(99. 9°C ) 3分钟；500C 3小时。接下来使用Millipore的Microcon 柱通过超滤纯化反应混合物。纯化基本上根据生产商的说明进行。为此，将反应混合物与300μ1水混和，加到超滤膜上，离心15分钟，然后使用IXTE缓冲液洗涤。在这一处理中，DNA留在了膜上。接下来进行脱磺酸基。为此加入0.2mol/L氢氧化钠，温育10分钟。然后进行离心(10分钟)，接下来使用IXTE缓冲液洗涤。这以后洗脱DNA。为此，用50 μ U^WlXTE 缓冲液(50°C )与膜混和10分钟。根据生产商的说明将膜反过来。接下来重复离心，这样将DNA从膜上移下来。然后荧光测定法测定DNA的浓度(橄榄绿)。数据示于表1中。DNA 的回收率至少为75%。相反，在已知的DNA亚硫酸氢盐转化和纯化的方法中，DNA的回收率低于25%。表 权利要求
1.DNA亚硫酸氢盐转化的方法，其中基因组DNA与亚硫酸氢盐试剂反应，该方法的特征在于所述的反应在色烷衍生物存在下进行。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于所述色烷衍生物是6-羟基-2，5，7，8-四甲基色烷-2-羧酸。
3.根据权利要求1或2的方法，其特征在于所述反应进一步包括在选自二哦烷、其衍生物之一和相似的脂肪族环醚存在下进行。
4.根据权利要求3的方法，其进一步特征在于所述化合物的浓度是10-35%体积。
5.根据权利要求3的方法，其进一步特征在于所述化合物的浓度是20-30%体积。
6.色烷衍生物用于DNA亚硫酸氢盐转化的用途。
7.根据权利要求6的用途，其特征在于所述色烷衍生物是6-羟基-2，5，7，8-四甲基色烷-2-羧酸。
全文摘要
本发明涉及DNA亚硫酸氢盐转化的改进方法。将变性溶剂、新的反应条件以及新的纯化方法组合在一起，亚硫酸氢盐转化的效果得到了明显提高。接下来可以通过不同的方法分析被转化的DNA。本发明有助于对胞嘧啶甲基化的分析。
文档编号C12Q1/68GK102517389SQ20111043390
公开日2012年6月27日 申请日期2004年10月11日 优先权日2003年10月9日
发明者K·博林, K·卡顿, M·保豪瑟 申请人:Epi基因组股份公司