专利名称：感染性腹泻快速检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及感染性腹泻快速检测试剂盒，特别涉及出血性大肠埃希氏菌 0157 :H7、福氏志贺氏菌、空肠弯曲菌和副溶血弧菌的检测试剂盒。
背景技术：
感染性腹泻主要由环境污染，垃圾粪便未及时处理，导致水源和食物污染，在食用病原菌污染的水和食物后容易引起腹泻。引起的腹泻的病原体有十种之多，其中出血性大肠埃希氏菌0157 :H7、福氏志贺氏菌、空肠弯曲菌和副溶血弧菌是战争期间引起腹泻的主要病菌。具有来势猛，传播快，发病率高，一旦出现腹泻病，很快波及无免疫力的易感人群， 在人员密集地区，很快出现流行高峰。如果不及时抢救，会有生命危险，从发病到死亡最快仅数小时。因此快速准确的检测出病原菌的种类，有利于选择合适的药物进行治疗，使病情得到缓解。传统的的检测方法采用血清学试验和生化试验进行判断，这种方法需要的周期较长，一般需要2-3天。免疫磁珠捕获法是一种应用抗体特异性，分离混合物中特异的细胞，具有分离速度快、效率高和可重复性好的优点，在微生物检测方面具有很大的优势。PCR 目前已广泛用于微生物的检测，具有快速，高效等优点。因此利用免疫磁珠捕获特异细胞并结合PCR可以快速的鉴定出血性大肠埃希氏菌0157 :H7、福氏志贺氏菌、空肠弯曲菌和副溶血弧菌。如果检测人员需要前往现场进行检测，同时携带多个试剂盒，不但携带不方便，而且试剂盒的固定就成为一个问题，若固定不稳，试剂瓶会相互碰撞并产生破裂或者泄露。因此，急需感染性腹泻快速检测试剂盒，能够很好的固定在试剂盒中方便携带，含有检测出血性大肠埃希氏菌0157 :H7、福氏志贺氏菌、空肠弯曲菌和副溶血弧菌的所有试剂，能够快速、有效和准确的检测出出血性大肠埃希氏菌0157 :H7、福氏志贺氏菌、空肠弯曲菌和副溶血弧菌。
实用新型内容有鉴于此，本实用新型所要解决的技术问题是提供固定牢固、携带轻便的快速检测出血性大肠埃希氏菌0157 :H7的试剂盒，能够快速、有效和准确的检测出血性大肠埃希氏菌0157 :H7、福氏志贺氏菌、空肠弯曲菌和副溶血弧菌。为了解决上述技术问题，采用以下技术方案本实用新型涉及感染性腹泻快速检测试剂盒，由盒体和固定座构成，所述固定座设置于盒体内，所述固定座设置有至少两个容器孔，所述容器孔呈线性排列，所述容器孔固定连接有样品分离瓶和PCR检测瓶，所述样品分离瓶装有分离磁珠，所述分离磁珠表面吸附有抗体，所述抗体为抗出血性大肠埃希氏菌0157 :H7抗体、抗福氏志贺氏菌抗体、抗空肠弯曲菌抗体和抗副溶血弧菌抗体，所述PCR检测瓶装有PCR反应液，所述PCR反应液为Taq DNA高保真聚合酶、PCR缓冲液、dNTPs、出血性大肠埃希氏菌0157 :H7检测引物ElF和E1R、 福氏志贺氏菌检测引物SHlF和SH1R、空肠弯曲菌检测引物C2F和C2R、副溶血弧菌检测引物Vptlh21和Vptlh22和去离子水混合。[0007]进一步，所述固定连接为可拆卸固定连接。进一步，所述固定座选自泡沫塑料。样品分离瓶内盛有分离磁珠，分离磁珠为羊抗兔IgG超顺磁微球(Dynabeads M-280 sheep anti-rabbit IgG，Invitrogen)，并在分离磁珠表面附有出血性大肠埃希氏菌 0157 :H7抗体、抗福氏志贺氏菌抗体、抗空肠弯曲菌抗体和抗副溶血弧菌抗体，用样品分离瓶的分离磁珠能够从样品中分离出出血性大肠埃希氏菌0157 :H7、福氏志贺氏菌、空肠弯曲菌和副溶血弧菌。PCR检测瓶含有用于出血性大肠埃希氏菌0157 :H7、福氏志贺氏菌、空肠弯曲菌和副溶血弧菌的PCR反应液PCR反应液中含有缓冲液10XPCR Buffer, dNTPs, Taq酶，双蒸水和引物，检测出血性大肠埃希氏菌0157 :H7使用的引物为 Elf: 5' -ttgaaccacactttgccgtaa-3', 禾口 ElR :5，_gcgBBBBctgtggBBttggg_3，， 检测福氏志贺氏菌使用的引物为SHlF 5’ -cttgaccgcctttccgata-3，和 SHlR 5，-agcgaaagactgctgtcgaag-3，； 检测空肠弯曲菌使用的引物为C2F: 5， -cgcaatttgataccttaagtgcagc-3，和 C2R: 5， _aggcacgcctaaacctatagct_3，， 检测副溶血弧菌使用的引物为 Vptlh21: 5，-aaagcggattatgcagaagcactg-3，和 Vptlh22: 5，-gctactttctagcattttctctgc-3，。在检测试剂盒中同时含有出血性大肠埃希氏菌0157 H7、福氏志贺氏菌、空肠弯曲菌和副溶血弧菌检测所用的引物，能够同时检测出样品中的出血性大肠埃希氏菌0157 :H7、福氏志贺氏菌、空肠弯曲菌和副溶血弧菌。本发明有益效果在于运用免疫磁珠捕获法，通过在磁珠微球上结合羊抗兔IgG 抗体，然后结合出血性大肠埃希氏菌0157 :H7、福氏志贺氏菌、空肠弯曲菌和副溶血弧菌的特异抗体，通过特异抗体从测试样品中分离到出血性大肠埃希氏菌0157 :H7、福氏志贺氏菌、空肠弯曲菌和副溶血弧菌，再通过PCR检测试剂盒快速检测出待测样品中是否含有出血性大肠埃希氏菌0157 :H7、福氏志贺氏菌、空肠弯曲菌和副溶血弧菌，为临床上疑似细菌性感染的患者提供早期准确的检测，以便及时制定治疗方案，减少因腹泻引起的死亡及后遗症，本试剂盒携带方便并轻便，在试剂盒中含有血性大肠埃希氏菌0157、福氏志贺氏菌、 空肠弯曲菌和副溶血弧菌检测的所有试剂，并且固定稳定，在运输过程中能够得到很好的保护，该试剂盒灵敏度高血性大肠埃希氏菌0157 :H7的敏感度达到1. 35X 102个，福氏志贺氏菌的敏感度达到3 X IO3个，空肠弯曲菌的敏感度达到2个，副溶血弧菌的敏感度达到5. 5 个。本实用新型的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本实用新型的实践中得到教导。本实用新型的目标和其他优点可以通过下面的说明书和权利要求书来实现和获得。
图1为本实用新型感染性腹泻快速检测试剂盒结构示意图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。实施例1如附图1为本实用新型感染性腹泻快速检测试剂盒结构示意图，本实用新型提供的感染性腹泻快速检测试剂盒用于检测引起感染性腹泻的出血性大肠埃希氏菌0157 :H7、 福氏志贺氏菌空肠弯曲菌和副溶血弧菌。由盒体1和固定座2构成，固定座2设置于盒体1 内，固定座2设置有两个容器孔3，容器孔3呈线性排列，容器孔3固定连接有样品分离瓶4 和PCR检测瓶5，样品分离瓶5包括分离磁珠6，分离磁珠6表面吸附有抗出血性大肠埃希氏菌0157 :H7抗体、抗福氏志贺氏菌抗体、抗空肠弯曲菌抗体和抗副溶血弧菌抗体，PCR检测瓶5含有检测出血性大肠埃希氏菌0157 :H7、福氏志贺氏菌、空肠弯曲菌和副溶血弧菌的 PCR反应液7。其中为了携带时减轻重量固定座优选为泡沫塑料。试剂盒中的样品分离瓶4和PCR检测瓶5为圆柱形，在容器孔3上具有与容器瓶形状、大小相应的孔，将分离瓶4和PCR检测瓶5放入容器孔3中，使容器瓶固定，容器瓶也可以为其他形状，其相应的容器孔3也为其他形状，也可以在容器孔3中设置其他结构用于固定容器瓶，使容器瓶用可拆卸方式固定与容器孔3中，使用时方便取拿。样品分离瓶内盛有分离磁珠，分离磁珠为羊抗兔IgG超顺磁微球(Dynabeads M-280 sheep anti-rabbit IgG，Invitrogen)，并在分离磁珠表面附有出血性大肠埃希氏菌 0157 :H7抗体、抗福氏志贺氏菌抗体和抗空肠弯曲菌抗体，用样品分离瓶的分离磁珠能够从样品中分离出出血性大肠埃希氏菌0157 :H7、福氏志贺氏菌、空肠弯曲菌和副溶血弧菌。PCR检测瓶含有用于出血性大肠埃希氏菌0157 H7、福氏志贺氏菌、空肠弯曲菌和副溶血弧菌的PCR反应液PCR反应液中含有5U/yL Taq DNA高保真聚合酶、PCR 缓冲液 IOXBuffer ( [600 mM Tris-S04 (ρΗ 8. 9)，180 mM (NH4) 2S04]、 50 mM MgS04)、dNTPs (10mM)、引物 ElF (IOmM),引物 ElR (IOmM),引物 SHlF (IOmM), 引物 SHlR (IOmM),引物 C2F (IOmM),引物 C2F (IOmM),引物 Vptlh21 (10mM)、引物 Vptlh22 (IOmM)和去离子水按照体积比为1:5:2:1:1:1:1:1:1:1:1 34混合，PCR反应液于-20°C冰箱保存。使用的引物序列为，检测出血性大肠埃希氏菌0157 :H7使用的引物序列为:E1F: 5' -ttgaaccacactttgccgtaa-3‘禾口 ElR -gcgaaaactgtggaattggg-3‘； 检测福氏志贺氏菌使用引物序列为SHlF 5，-cttgaccgcctttccgata-3，和SHlR 5’ -agcgaaagactgctgtcgaag-3‘； 检测空肠弯曲菌使用的引物序列为C2F: 5，-cgcaatttgataccttaagtgcagc-3，和 C2R: 5，_aggcacgcctaaacctatagct_3，；检测苜Ij 溶血弧菌使用的引物序列为 Vptlh21: 5，-aaagcggattatgcagaagcactg-3，和 Vptlh22: 5，-gctactttctagcattttctctgc-3，。在检测试剂盒中同时含有出血性大肠埃希氏菌0157 H7、福氏志贺氏菌、空肠弯曲菌和副溶血弧菌检测所用的引物，能够同时检测出样品中的出血性大肠埃希氏菌0157 :H7、福氏志贺氏菌、空肠弯曲菌和副溶血弧菌。本实用新型试剂盒的使用方法，其主要步骤为取待测样品于如附图1所示的样品分离瓶5中，样品分离瓶5中分离磁珠7表面的抗出血性大肠埃希氏菌0157 :H7抗体、抗福氏志贺氏菌抗体、抗空肠弯曲菌抗体和抗副溶血弧菌抗体分离出样品中的出血性大肠埃希氏菌0157 :H7、福氏志贺氏菌、空肠弯曲菌和副溶血弧菌，样品分离瓶5处理后的样品加入PCR检测瓶8，然后进行PCR扩增，PCR条件为94°C预变性2分钟一个循环；94°C变性30秒，56°C退火30秒，68°C延伸30秒，40个循环；最后68°C后延伸15秒。取IOyL PCR产物在1. 5%琼脂糖凝胶中进行电泳分离，在凝胶成像系统下进行拍照并分析，若出现大小为227bp的条带，表明待测样品中有出血性大肠埃希氏菌0157 :H7感染；若出现大小为117bp的条带，表明待测样品中有福氏志贺氏菌； 若出现大小为450bp的条带，表明待测样品中含有副溶血弧菌；若出现大小为84bp的条带， 表明待测样品中有空肠弯曲菌感染。如果同时出现两个条带，表明待测样品同时有对应条带的细菌感染；若出现四个条带，表明待测样品同时感染了出血性大肠埃希氏菌0157 :H7、 福氏志贺氏菌、空肠弯曲菌和副溶血弧菌。用梯度稀释法稀释出血性大肠埃希氏菌0157 H7并用含抗出血性大肠埃希氏菌0157 :H7抗体的磁珠捕获，再通过PCR检测证实出血性大肠埃希氏菌0157 :H7的敏感度达到1. 35 X IO2个。用同样方法检测福氏志贺氏菌的敏感度达到3 X IO3个，空肠弯曲菌的敏感度达到2个，副溶血弧菌的敏感度达到5. 5个。 最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
权利要求1.感染性腹泻快速检测试剂盒，由盒体(1)和固定座(2)构成，其特征在于所述固定座(2 )设置于盒体(1)内，所述固定座(2 )设置有至少两个容器孔(3 )，所述容器孔(3 )呈线性排列，所述容器孔(3)固定连接有样品分离瓶(4)和PCR检测瓶(5)，所述样品分离瓶(5) 装有分离磁珠(6)，所述分离磁珠(6)表面吸附有抗体；所述PCR检测瓶(5)装有PCR反应液⑴。
2.根据权利要求1所述感染性腹泻快速检测试剂盒，其特征在于所述固定连接为可拆卸固定连接。
3.根据权利要求1所述感染性腹泻快速检测试剂盒，其特征在于所述固定座(2)材料为泡沫塑料。
专利摘要本实用新型涉及感染性腹泻快速检测试剂盒，由盒体和固定座构成，固定座设置于盒体内，固定座上设置有至少两个容器孔并呈线性排列，容器孔固定连接有样品分离瓶和PCR检测瓶，样品分离瓶含有分离磁珠，分离磁珠表面有吸附抗出血性大肠埃希氏菌0157H7抗体、抗福氏志贺氏菌抗体、抗空肠弯曲菌抗体和抗副溶血弧菌抗体，PCR检测瓶含有检测出血性大肠埃希氏菌0157H7、福氏志贺氏菌、空肠弯曲菌和副溶血弧菌的PCR反应液，本新型提供的试剂盒设计合理，携带轻便，运用磁珠分离并通过PCR方法能够快速准确检测引起的感染性腹泻的出血性大肠埃希氏菌0157H7、福氏志贺氏菌、空肠弯曲菌和副溶血弧菌。
文档编号C12R1/01GK202322847SQ2011204543
公开日2012年7月11日 申请日期2011年11月16日 优先权日2011年11月16日
发明者何长龙, 吴力克, 毛青 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院