专利名称：通过在获自细胞培养物的液体中改变ph灭活蛋白酶的方法
技术领域：
本发明属于制造生物制药产品的领域。其具体涉及通过在不含细胞的细胞培养物上清液中灭活蛋白水解活性酶来改进制备生物制药产品的方法。背景生物分子(例如蛋白、多核苷酸、多糖等)不断获得商业重要性，以用作药物、诊断试剂、食品添加剂、洗涤剂等，用作研究试剂和用于许多其他应用。对所述生物分子(例如蛋白)的需求一般不再通过从天然来源分离分子而得以满足，而是需要使用生物技术生产方法。经生物技术制备蛋白通常由克隆DNA片段至合适的表达载体中开始。转染所述表达载体至合适的原核或真核表达细胞及随后选择受感染的细胞后，将受感染的细胞在发酵罐中培养，并表达所需蛋白。然后采集细胞或培养物上清液，并将其中所含的蛋白进行后处理和纯化。 众所周知，蛋白酶存在于采集的液体中，例如在不含细胞的培养物上清液中。生物药物(例如单克隆抗体或重组蛋白)以及色谱材料(例如固定的蛋白A)均被蛋白酶迅速降解或破坏结构。这导致损害产物品质(同质性、功能性)，而且在色谱材料中降低结合容量，导致污染结合的产物级分。尤其在不含血清的培养和高产量细胞中，制备的生物药物以高相对浓度存在，因此尤其易于被蛋白水解性损坏其分子结构，导致同时产率降低和产物品质降低。蛋白酶导致的蛋白损坏甚至可以在中性pH发生，但是尤其当不含细胞的培养物上清液必须调节至酸性PH水平以用于纯化方法时(例如，为了为捕获步骤(例如阳离子交换色谱(预处理))创造所需的结合条件)，可以观察到广泛的蛋白降解。众所周知，通过改变pH水平不可逆地灭活了一些蛋白酶(例如消化酶，例如胃蛋白酶)(Z. Bohak, Purification and Characterization of Chicken Pepsinogenand Chicken Pepsin, Journal of Biological Chemistry244(17)(1969)4633 - 4648;B.Turk, V. Turk, Lysosomes as Suicide Bags in Cell Death:Myth or Reality , Journalof Biological Chemistry284 (33) (2009) 21783 - 21787) 0 已经提议加入蛋白酶抑制剂(A. J. Barrett, A. A. Kembhavij M. A. Brown, H. Kirschkej C. G. Knight, M. Tamai and K. Hanada，L-trans-Epoxysuccinyl-leucylamido(4-guanidino)butane(E-64) and its analoguesas inhibitors of cysteine proteinases including cathepsins Bj H and Lj Biochem.J. 201 (1982) 189 - 198)。然而，这些蛋白酶抑制剂非常昂贵、具有毒性且难以从产物中去除。因此，蛋白酶抑制剂不是经济地生产安全药物的选择。发明概述本发明涉及通过在纯化生物药物的方法开始时，重复地改变细胞培养物上清液的pH而灭活蛋白酶的方法。本发明的优点在于提高产物品质和产物产率，以及延长色谱材料的寿命。令人奇地，已经发现采集的哺乳动物细胞系(例如CH0，〃中国仓鼠卵巢〃细胞)的不含细胞的发酵上清液中含有以下蛋白酶其可以通过改变至酸性pH而活化，也可以在最适pH通过随后改变pH至中性范围而不可逆地灭活其活性。在中性pH水平具有活性的蛋白酶也可以在中性条件下通过改变至酸性PH水平而不可逆地灭活其活性。本发明具体涉及在获自细胞培养物的液体中灭活蛋白酶的方法，包括以下步骤(a)调节所述液体的pH至3-5，然后(b)调节所述液体的pH至7-9。
图1 :通过两次改变pH活化和灭活来自CCF的蛋白酶。图2:在酸性pH降解模型底物干扰素(IFN)。将O. lmg/ml干扰素在37 ° C与10%(v/v)细胞培养物上清液(CCF) —起在pH4培养O或14小时，伴随和不伴随pH改变(泳道2至4)，并通过SDS-PAGE分离。在20。C进行pH改变，且在pH4和pH7暂停5分钟。与没有PH灭活相比，通过改变pH (泳道3)使得IFN的降解显著减少。14小时后，IFN已经完全分解(泳道4)。泳道的布置:
1-标记2 -1FN (O. lmg/mL)，培养前3 - CCF+IFN pH4,伴随改变pH，培养14小时4 - CCF+IFN pH4,不伴随改变pH，培养14小时图3 :通过与CCF、10%(v/v)在pH4. O培养3小时降解蛋白IFN，用RP-HPLC分析。通过中和灭活蛋白酶及随后与IFN在pH4. O培养后，3小时后，仍可通过RP-HPLC检测到72%的IFN，与此同时，没有灭活时，仅43%的IFN仍然完整。因此与野生型蛋白相比，蛋白水解活性减半。图4 :在酸性和中性pH的荧光测试。CCF中的蛋白酶在ρΗ3· 5 ( ·)和ρΗ7 ( ▲)具有活性。作为在ΡΗ3. 5和pH7，CCF中的蛋白酶产生的蛋白水解活性的量度，测量了通过裂解肽底物释放的荧光团。图5 :伴随和不伴随pH改变时中性蛋白酶的蛋白水解活性。通过酸化至pH〈5及随后中和，中性蛋白酶可能最完全地且不可逆地灭活。在各种情况下，所述测量在PH7进行，测量通过裂解肽底物释放的荧光团作为蛋白水解活性的量度。图6 :伴随和不伴随pH改变时酸性蛋白酶的蛋白水解活性。激活/灭活CCF中的蛋白酶类似于图1通过改变PH进行。活化的蛋白酶在pH〈5具有活性且裂解底物。在pH3. 7，活化的蛋白酶(其已经通过在PH > 7短暂培养灭活)展示的残留活性降低至35%。在各种情况下，所述测量在PH3. 7进行，测量通过裂解肽底物释放的荧光团作为蛋白水解活性的指标。发明详述本发明涉及灭活蛋白酶的方法，其通过在纯化方法开始时，重复地改变细胞培养物上清液的PH进行。本发明的优点在于提高产物品质和产率，以及延长色谱材料的寿命。令人奇地，发现采集的哺乳动物细胞系(例如CH0，〃中国仓鼠卵巢〃细胞)的不含细胞的发酵上清液中含有以下蛋白酶其可以通过改变至酸性PH而活化，也可以在最适pH通过随后改变pH至中性范围而不可逆地灭活其活性。在中性pH水平具有活性的蛋白酶也可以在中性条件下通过改变至酸性pH水平而不可逆地灭活其活性。在另一方面，本发明涉及在获自细胞培养物的液体中减少蛋白降解的方法，包括以下步骤(a)调节所述液体的pH至3-5，然后(b)调节所述液体的pH至7-9。酸化细胞培养物上清液后，明显地出现现有蛋白酶的活化，表明存在原来溶酶体的蛋白水解酶(组织蛋白酶)。这些蛋白酶参与降解内吞的蛋白，普遍地表达在所有组织中作为非-活化的形式，并且在细胞内位于核内体内。这些隔室成熟形成溶酶体伴随显著降低PH，其同时导致自催化和反式激活溶酶体的蛋白酶。在肿瘤组织转移的背景下简要讨论了组织蛋白酶分泌进入细胞外隙，并且已经公开了一些个别组织蛋白酶分泌入细胞培养物中。在中性pH值的蛋白水解活性可以一方面归因于分泌的蛋白酶，另一方面归因于原本位于膜中的蛋白酶，其推定在生产过程中 从细胞膜中分离出来并在溶液中继续具有活性。典型地，在生物制药方法中，通过离心或过滤将细胞从含有产物的细胞培养物上清液中分离。然后将不含细胞的上清液无菌过滤(最大0.2μΜ孔径)并渗滤(diafilter)用于在捕获步骤前重新缓冲(rebuffer)。通过两次改变pH灭活，可以在细胞培养物上清液分离细胞后第一时间进行，并用于任一随后的方法步骤。当选择pH水平时，产物分子和技术设备不应被损坏，因此应当避免pH〈3 (发生产物蛋白的化学修饰和钢容器的腐蚀增加)，以及PH>9(发生天冬酰胺和谷氨酰胺去酰胺化)。在各自PH值的保留时间还取决于产物蛋白的稳定性。通过酸化活化蛋白酶的时间长度应当尽可能短，但有利地为至少5分钟(min)。例如，5至30分钟之间的保留时间是有利的，优选5至15分钟。对于在酸性pH水平更长的活化保留时间，可能出现蛋白水解降解靶蛋白的增加。在中性PH灭活酸性蛋白酶的随后保留步骤的时间长度不关键，且所述pH也可保持数个方法步骤或再次改变，因为所有在中性具有活性的蛋白酶已经被灭活，而且不可再检测到蛋白水解活性。例如，中和步骤有利的保留时间为5至60分钟。各自目标pH值的调节可以在溶液中通过一次性加入或滴定酸(例如乙酸或盐酸)或碱液/碱(例如氢氧化钠溶液或Tris)伴随搅拌进行。在酸步骤中，3至5之间的pH值是有利的，例如PH为3. 5-4. 5，优选4。对于随后通过中和灭活酸性蛋白酶，已经证明pH值为7-9是有效的，优选pH为7. 4-8. 5。本发明可以在4° C至37° C，优选15° C至37° C，优选20-37° C的温度范围内进行。进行本发明的优选范围为20° C至30° C。通过两次改变pH灭活酸性和中性蛋白酶的方法成功地在哺乳动物细胞(CH0和NS0)的不含细胞的培养物上清液中进行。结果还可以转移至其他生产微生物的培养物上清液，并且可以在需要产物蛋白(尤其其PH稳定性)的范围内用于制造各种生物制药产品。
本发明利用纯物理和生物化学方法。通过两次改变pH经过不同的pH单位(图1)，不可逆地消除高达75%的酸性蛋白酶活性和高达90%的中性蛋白酶活性。所述蛋白酶活性可以使用两种检测方法进行检测，a)通过肽裂解后释放的荧光，以及b)通过降解天然蛋白底物。对产物和设备有害的蛋白酶可以在生产生物药物期间通过快速且简单的理化方法被不可逆地灭活。所述细胞培养物上清液可以以多种方式使用且可以通过多种纯化技术获得。加入酸和碱液是非常迅速的且容易进行，并且还可以放大用于工业使用。灭活蛋白酶后，细胞培养物上清液可以以非常多的方式进行纯化方法。静置时间或PH值是不关键的，这与常规的生产方法不同。
实施例工作实施例1 :采集后、捕获步骤前改变pH将CHO细胞在最终容 量80L的分批补料罐(fed batch)中生长11天。将细胞培养物上清液(CCF)保持在20° C，并使用通流盘式离心机分离细胞，并经串联滤器无菌-过滤。然后通过加入乙酸将CCF的pH值降低至pH4。达到目标pH后，将其保持5-10分钟，然后通过加入氢氧化钠溶液将CCF中和至pH7. 5。进一步处理(捕获步骤)前，将CCF经50kD MWCO膜超滤/渗滤，以达到适于捕获步骤的结合条件。工作实施例2 :分离CCF与细胞后、无菌过滤前直接改变pH将CHO细胞在最终容量80L的分批补料罐中生长11天。将细胞培养物上清液(CCF)使用通流盘式离心机分离细胞，并保持在20° C。然后通过加入乙酸并不断搅拌将CCF的pH值降低至pH4。达到目标pH后，将其保持5-10分钟，然后通过加入氢氧化钠溶液将CCF中和至pH7.5。然后将处理的CCF经串联滤器无菌-过滤。进一步处理(捕获步骤)前，将CCF经50kDMWC0膜超滤/渗滤，以达到适于捕获步骤的结合条件。工作实施例3 :在rProtA捕获步骤后、灭活病毒前改变pH将CHO细胞在最终容量80L的分批补料罐中生长11天。将细胞培养物上清液(CCF)使用通流盘式离心机分离细胞，经串联滤器无菌-过滤，并经50kD MWCO膜超滤/渗滤，以达到适于捕获步骤(在PBS pH7. 5上的rProteinA亲和性色谱)的结合条件。向MabSelect色谱柱中装入32mg mAb/mL柱基质,并在步骤中将抗体用乙酸盐缓冲液(pH3. 5)洗脱。通过加入IM Tris伴随搅拌将含有产物的级分的pH调节至pH7. 5，并将pH在室温保持10分钟，然后选择酸性灭活病毒的合适条件。原料和方法细胞培养物上清液将经优化用于分泌生产治疗蛋白的鼠类和CHO生产细胞系在不含血清的培养基中培养许多天。通过过滤或离心将细胞培养物上清液(CCF，不含细胞的细胞培养液体)分离细胞和不溶性组分，并在调节至各自PH后，将其以10-20%(v/v)用于活性测试。pH值的调节将细胞培养物上清液通过加入乙酸酸化。立即将样品混合并在所选pH培养5-10分钟。通过离心压紧沉淀组分并弃去。通过加入氢氧化钠溶液或IM Tris碱升高pH。
测定蛋白酶类型的抑制实验为了抑制个别的蛋白酶类型，将CCF与不同的商品化抑制剂一起培养，然后在活性测试中研究任何剩余的活性。所用抑制剂的浓度为生产商的推荐浓度。活性测试通过释放荧光团分析的荧光测试用于动力学和定量测定蛋白水解活性的底物为不同的肽-荧光团轭合物，该轭合物的裂解产生释放荧光染料(例如氨基甲基香豆素(AMC))，或消除N-甲基氨基苯甲酰基-二氨基丙酸(Nma)上的二硝基苯基(Dnp)的淬灭作用。荧光信号的增加可以在Multilabel-Counter Victor2’3 (Perkin Elmer, Massachusetts, USA)中在入 Ex=380nm、入 Em=460nm (AMC), A Ex=340nm、A Em=460nm 以光度测定方式监测(图 3)。所有动力学和定量分析的测试在底物饱和时进行，即在0. 2mM肽_AMC、10_20 U M肽-MCA 或 5-10 u M DnP-肽-Nma,在 10-20% (v/v) CCF 的存在下，在 pH7 (IOOmM Tris/HCl,200mM NaCl)和 pH3. 5 (IOOmM 乙酸钠，200mM NaCl)下进行。通过PAGE和RP-HPLC分析的降解测试用于定量分析蛋白水解活性的底物为干扰素家族(IFN)的天然蛋白。IFN为
22.5kD大小且在溶液中以单体存在。对于降解测试，将0. lmg/ml IFN与10%(v/v)CCF —起在37° C在pH4培养24小时，并通过SDS-Pa`ge和银染色检测，根据Heukeshoven (Heukeshoven,J.，Dernick, R.，Improved silver staining procedure for fast stainingin PhastSystem Development Unit.1. Staining of sodium dodecyl sulphate gels.Electrophoresis^, (1988)28-32.)进行，或通过RP-HPLC测定蛋白的降解作为蛋白水解活性的量度。所述 RP-HPLC 分析在 Waters 制造的具备 UV 检测器(Waters2487Dual AbsorbanceDetector)的 HPLC 仪器(Waters2695alliance)上，通过 Vydac214TP_C4 柱以 0. 2% (v/v) TFA的水溶液(溶液A)至0. 15%(v/v) TFA的乙腈溶液(溶液B)的梯度系统的方式进行(表I)。表1:RP-HPLC_C4柱的洗脱梯度。梯度运行由水溶液至有机溶剂
时间溶液A溶液B
I分钟丨丨％丨丨％|
5.06040
15.03070
15.11090
19.01090
19.16040 21.0 60 40结果通过来自CCF的蛋白酶裂解的底物具有两个峰，其在酸性pH值pH〈5和在约为pH7的中性范围出现。各自蛋白酶的活性可以通过蛋白分解和裂解荧光肽底物后释放的荧光得以监测(图2和4)。图2显示了在pH4在10%(v/v)CCF的存在下IFN的降解。仅几小时后，IFN在酸性条件下(泳道4)分解，图4显示了在pH3. 5和pH7培养后，Dnp-肽-Nma-底物随时间被20%(v/v) CCF裂解的过程。荧光信号的增加为肽底物裂解的量度。在酸性和中性pH值均观察到活性。该活性可以被蛋白酶类型-特异性抑制剂抑制，因此显示出许多蛋白酶类型存在于CCF中，并且可分为两类在酸性条件具有活性的蛋白酶，其仅在低pH水平具有活性，以及在中性条件具有活性的蛋白酶，其仅在中性PH水平具有活性。所述在酸性条件具有活性的蛋白酶在中性PH值不具活性，而在中性条件具有活性的蛋白酶在酸性pH值不具活性。虽然所述在中性条件具有活性的蛋白酶在细胞分离时已经具有活性，但是CCF中的在酸性条件具有活性的蛋白酶未被活化，直至反应条件被酸化。用于灭活中性蛋白酶的两步pH改变来自未处理的CCF的中性蛋白酶的活性可以在荧光测试中在pH7测定(图5，圆圈)。如果将CCF进行由pH7至pH〈5，然后中和的两步pH改变，在荧光测试中在pH7实际上不能再检测到活性(图5，三角形)。CCF的短暂酸化且随后中和导致在中性条件具有活性的蛋白酶完全和不可逆地丧失蛋白水解活性。
用于灭活酸性蛋白酶的两步pH改变通过酸化CCF活化的蛋白酶的蛋白水解活性可以在荧光测试中在pH3. 5以及在蛋白降解测试中检测(图6，正方形)。然而，如果在酸化后将CCF中和，则该活性不再维持。如果中和后恢复了酸性蛋白酶最优的PH3. 5的反应条件，则与未处理的CCF相比，荧光测试中可测量的酸性蛋白酶的活性降低最多65%(图6，三角形)。蛋白的降解还通过两次改变pH减少。模型蛋白IFN的降解在中和步骤后显著降低(图3，灰色条)。可能由于重复改变pH，将天然蛋白底物IFN的降解降低50%(图3，通过RP-HPLC
定量)。
权利要求
1.在获自细胞培养物的液体中灭活蛋白酶的方法，其包括以下步骤 (a)调节所述液体的pH至3-5，然后 (b)调节所述液体的pH至7-9。
2.在获自细胞培养物的液体中减少蛋白降解的方法，其包括以下步骤 (c)调节所述液体的pH至3-5，然后 (d)调节所述液体的pH至7-9。
3.权利要求1或2的方法，其特征在于步骤(a)的pH的范围为3.5-4. 5。
4.权利要求1至3中任一项的方法，其特征在于步骤(a)的pH保持5分钟至30分钟的时间。
5.权利要求1至4中任一项的方法，其特征在于步骤(a)的pH的调节在20-30°C的温度进行。
6.权利要求1至5中任一项的方法，其特征在于步骤(b)的pH的范围为7.4-8. 5。
7.权利要求1至6中任一项的方法，其特征在于步骤(b)的pH保持5分钟至60分钟的时间。
8.权利要求1至7中任一项的方法，其特征在于步骤(b)的pH的调节在20-30°C的温度进行。
9.权利要求1至8中任一项的方法，其特征在于所述液体是来自哺乳动物细胞培养物的液体。
10.权利要求9的方法，其特征在于所述液体是来自哺乳动物细胞培养物的不含细胞的液体。
全文摘要
本发明涉及通过在纯化生物药物的方法开始时，重复地改变细胞培养物上清液的pH而灭活蛋白酶的方法。将所述pH首先调节至3-5，然后调节至7-9。
文档编号C12P21/00GK103068999SQ201180038752
公开日2013年4月24日 申请日期2011年8月12日 优先权日2010年8月20日
发明者A.贾克比, D.阿姆布罗西斯, P.杜伯西恩, C.厄科曼, F.诺蒂尔弗 申请人:贝林格尔.英格海姆国际有限公司