专利名称：新的土壤微生物、从所述土壤微生物分离的新氧化还原酶、编码所述氧化还原酶的基因和 ...的制作方法
技术领域：
本文内容涉及一种从土壤分离的新的微生物，从所述微生物分离的氧化还原酶，以及利用上述物质将各种植物糖苷去糖基化并产生各种糖苷配基的方法。
背景技术：
人参(Panax ginseng C.A.Meyer)是一种草药,在亚洲国家包括朝鲜、中国和日本其通常用于多种疾病的治疗和预防。人参皂苷是人参的主要活性成分，已知具有多种生理活性，包括在中枢神经系统、心血管系统和免疫系统中的抗衰老活性、抗炎活性、抗氧化活性、抗糖尿病活性和抗肿瘤活性。迄今为止，已经分离并鉴定出超过40种人参皂苷。人参皂苷(其是具有包括糖苷配基的达玛烷结构的糖苷)大致上可以分为原人参萜二醇和原人参萜三醇。属于原人参萜二醇类的人参皂苷主要是Rbl、Rb2、Rc和Rd，属于原人参萜三醇类的人参皂苷主要是Re和Rgl(参见
图1和图2)。 吸收后，人参皂苷通过肠道微生物代谢，已知代谢产物具有多种生理活性。例如，典型的基于原人参萜二醇的皂苷Rbl、Rb2和Re被人肠道微生物代谢为CK，基于原人参萜三醇的皂苷Re和Rgl被肠道微生物代谢为Rhl或F1，进而显示多种生理活性。已知CK诱导预防肿瘤侵袭和形成的抗转移或抗癌功效。并且，据报道与糖附着的对应物Rh2相比，其糖苷配基PH) (S)具有更高的生理活性。因此，已经研究将人参皂苷转化为具有更少糖的代谢物。除了酶促法之外，已经报道了使用弱酸的水解，使用碱的降解等等。但是，因为这些方法诱导数种副反应诸如差向异构、水合、羟化等等，所以最近研究了使用酶、肠道微生物等等转化为活性人参皂苷的方法。但是，大部分报道的微生物是厌氧肠道微生物，在工业应用中存在限制。此外，因为大部分酶缺乏将人参皂苷转化为糖苷配基的活性并具有它们自己的特异性，它们只适用于特定人参皂苷的生产。尽管到目前为止已对通过肠道微生物将人参皂苷Rbl的代谢物生物转化为CK进行了大量研究，但对其糖苷配基的产生几乎没有研究。并且，据报道，在皂苷主链上具有一个糖的人参皂苷不再被微生物的酶所降解。已知糖苷配基形式的人参皂苷更容易被吸收入血流并作为活性化合物起作用。此外，作为多种人参皂苷骨架的糖苷配基的产生将为所需人参皂苷类型的特定生产提供基础技术。因此，需要探索参与人参皂苷糖苷配基产生的酶。
发明内容
技术问题本文内容涉及提供一种新的微生物，从所述微生物分离的显示去糖基化活性的一种新的氧化还原酶和一种使用编码所述氧化还原酶的基因和重组蛋白产生多种人参皂苷糖苷配基、异黄酮糖苷配基或类黄酮糖苷配基的方法。技术方案在一个一般方面，提供新的根瘤菌(Rhizobium sp.)GIN611 (KCTC11708BP)或其细胞提取物。在另一个一般方面，提供一种使用根瘤菌GIN611或其细胞提取物作为生物催化剂将天然产物去糖基化的方法。在另一个一般方面，提供一种使用根瘤菌GIN611或其细胞提取物作为生物催化剂从多种糖苷产生糖苷配基的方法。在另一个一般方面，提供具有SEQ ID N03的氨基酸序列的氧化还原酶或包括所述氧化还原酶的细胞提取物。在另一个一般方面，提供编码具有SEQ ID N03的氨基酸序列的氧化还原酶的DNA，具有SEQ ID N02序列的DNA，包括具有SEQ ID N02序列的DNA的重组DNA载体，用包括具有SEQ ID N02序列的DNA的重组DNA载体转化的宿主细胞或包括用包括具有SEQ ID N02序列的DNA的重组DNA载体转化的宿主细胞的细胞提取物。在另一个一般方面，提供一种与SEQ ID N03的序列具有至少60%的序列相同性并具有去糖基化活性的氧化还原酶或包括所述氧化还原酶的细胞提取物。在另一个一般方面，提供一种使用生物催化剂将天然产物去糖基化的方法，所述生物催化剂选自:具有SE Q ID N03的氨基酸序列的氧化还原酶，包括具有SEQ ID N03的氨基酸序列的氧化还原酶的细胞提取物，用包括DNA (其编码具有SEQ ID N03的氨基酸序列的氧化还原酶)的重组DNA载体转化的宿主细胞，包含用包括DNA (其编码具有SEQ ID N03的氨基酸序列的氧化还原酶)的重组DNA载体转化的宿主细胞的细胞提取物，用重组DNA载体(其包括具有SEQ ID N02序列的DNA)转化的宿主细胞，用重组DNA载体(其包括具有SEQ ID N02序列的DNA)转化的宿主细胞的细胞提取物，用包括DNA(其编码与SEQ ID N03的序列具有至少60%的序列相同性并具有去糖基化活性的蛋白)的重组DNA载体转化的宿主细胞，包括用包括DNA (其编码与SEQ ID N03的序列具有至少60%的序列相同性并具有去糖基化活性的蛋白)的重组DNA载体转化的宿主细胞的细胞提取物，与SEQID N03的序列具有至少60%的序列相同性并具有去糖基化活性的氧化还原酶，和包括与SEQ ID N03的序列具有至少60%的序列相同性并具有去糖基化活性的氧化还原酶的细胞提取物。在另一个一般方面，提供一种使用生物催化剂从多种糖苷产生糖苷配基的方法，所述生物催化剂选自:具有SEQ ID N03的氨基酸序列的氧化还原酶，包括具有SEQ ID N03的氨基酸序列的氧化还原酶的细胞提取物，用包括DNA (其编码具有SEQ ID N03的氨基酸序列的氧化还原酶)的重组DNA载体转化的宿主细胞，包括用包括DNA(其编码具有SEQ IDN03的氨基酸序列的氧化还原酶)的重组DNA载体转化的宿主细胞的细胞提取物，用重组DNA载体(其包括具有SEQ ID N02序列的DNA)转化的宿主细胞，用重组DNA载体(其包括具有SEQ ID N02序列的DNA)转化的宿主细胞的细胞提取物，用包括DNA(其编码与SEQ IDN03的序列具有至少60%的序列相同性并具有去糖基化活性的蛋白)的重组DNA载体转化的宿主细胞，包括用包括DNA(其编码与SEQ ID N03的序列具有至少60%的序列相同性并具有去糖基化活性的蛋白)的重组DNA载体转化的宿主细胞的细胞提取物，与SEQ ID N03的序列具有至少60%的序列相同性并具有去糖基化活性的氧化还原酶，和包括与SEQ ID N03的序列具有至少60%的序列相同性并具有去糖基化活性的氧化还原酶的细胞提取物。在另一个一般情况下，提供一种制备以下物质的方法:根瘤菌GIN611的细胞提取物，包括具有SEQ ID N03的氨基酸序列的氧化还原酶的细胞提取物，包括用包括DNA(其编码具有SEQ ID N03的氨基酸序列的氧化还原酶)的重组DNA载体转化的宿主细胞的细胞提取物，包括用包括DNA (其具有SEQ ID N02的序列)的重组DNA载体转化的宿主细胞的细胞提取物，或包括氧化还原酶(其与SEQ ID N03的序列具有至少60%的序列相同性并具有去糖基化活性)的细胞提取物，包括通过添加人参皂苷来诱导酶表达。有益效果通常，已知人参皂苷去糖基化酶属于葡糖苷酶家族。本发明人发现属于氧化还原酶家族但不属于葡糖苷酶家族的一种酶对人参皂苷具有去糖基化活性。这种新的氧化还原酶在序列上完全不同于先前已知的去糖基化酶，与氧化还原酶家族的酶具有序列相似性，并在天然存在的糖苷中通过氧化糖来诱导自发的去糖基化。附图描述图1显示基于原人参職二醇(PPD)的人参阜苷。图2显示基于原人参職三醇(PPT)的人参阜苷。图3描述了一种反应，其中通过去糖基化从人参皂苷化合物K(CK)产生糖苷配基PPD (S)。图4显示新的氧化还原酶的活性分析结果。星号代表氧化的CK，三角形代表PPD(S)0色谱图3显示3小时反应的结果，色谱图4显示12小时反应的结果。底物CK的量随着时间减少，其中间物(氧化的CK)增加然后减少，其终产物PPD(S)始终随着时间增加。 图5显示图4中分析的氧化CK的质量分析结果。图6比较在完全培养基和M9/人参皂苷培养基中表达的蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。图7显示比较从在完全培养基和M9/人参皂苷培养基中培养的细胞获得的蛋白反应性的结果。图8显示利用人参皂苷作为碳源生长的新的土壤微生物根瘤菌GIN611的16S DNA序列。图9显示由根瘤菌GIN611产生的氧化还原酶的氨基酸序列及编码其的基因序列。图10显示新的氧化还原酶的反应机理。图11显示新的氧化还原酶对于多种人参皂苷和异黄酮的反应性分析结果。可以看出所述酶对葡萄糖具有特异反应性。图12显示测量camelliaside A和camelliaside B混合物的去糖基化活性的结
果O图13显示测量淫羊藿苷去糖基化活性的结果。最佳方式本文内容使用的术语是相关领域常用的那些，可以被本领域技术人员容易地理解。简单描述其中一些术语。(I)人参皂苷:人参的活性成分。
(2)化合物K (CK): 20-0- β -D-吡喃葡糖基_20 (S)-原人参萜二醇。(3)人参阜昔Rh2:3_0_ β-D-卩比喃匍糖基-20 (S)-原人参職二醇。(4)人参皂苷F2:3-0- ( β -D-吡喃葡糖基)-20-0- ( β -D-吡喃葡糖基)-20⑶原
人参萜二醇。(5)人参皂苷Rbl:3-0-[(i3-D-吡喃葡糖基)(1，2)-β- -吡喃葡糖基]-20-0-[ ( β -D-卩比喃匍糖基)(1，6) - β -D-卩比喃匍糖基]~20 (S)原人参職二醇。(6)人参皂苷Rb2:3-0-[(i3-D-吡喃葡糖基)(I, 2)-β-D-吡喃葡糖基]-20-0-[(a -L-吡喃阿拉伯糖基)(1，6)-β -D-吡喃葡糖基]_20 (S)原人参萜二醇。(7)人参皂苷Rc:3-0-[(^-D-吡喃葡糖基)(I, 2)-β-D-吡喃葡糖基]-20-0-[(a -L-阿拉伯呋喃糖基)(1，6)-β -D-吡喃葡糖基]_20 (S)原人参萜二醇。(8)人参皂苷Rb3:3-0-[(i3_D-吡喃葡糖基)(1，2)-β- -吡喃葡糖基]-20-0-[ ( β -D-卩比喃木糖基)(1，6) - β -D-卩比喃匍糖基]~20 (S)原人参職二醇。(9)人参皂苷Fl: 20-0- β -D-吡喃葡糖基-20⑶-原人参萜二醇。(10)人参皂苷Re:6-0-[a-L-吡喃鼠李糖基(1，2)-@_D-吡喃葡糖基]-20-0- ( β -D-吡喃葡糖基)-20 (S)-原人参萜三醇。(11)大豆苷:黄苷元7-0-β-D-糖苷。
(12) PPD (S): 20 (S)-原人参萜二醇。(13)化合物Y:20-0-[(a-L-吡喃阿拉伯糖基)(I，6) - β-D-吡喃葡糖基]-20⑶
原人参萜二醇。(14)化合物Mc: 20-0- [( a -L-阿拉伯呋喃糖基)(1，6) - β -D-吡喃葡糖基]-20 (S)原人参萜二醇。(15)化合物Mx:20-0-[(i3-D-吡喃木糖基)(l，6)-13_D-吡喃葡糖基]-20⑶原
人参萜二醇。(16) PPT (S): 20 (S)-原人参萜三醇。(17)人参皂苷Rg2:6-0_[ a -L-吡喃鼠李糖基(1，2) - β -D-吡喃葡糖基]-20 (S)-原人参萜三醇。(18)黄苷元:7-羟基-3-(4-羟苯基)色烯_4_酮。(19)淫羊藿苷:3，4’，5，7_四羟基_8_异戊烯基黄酮_4’-Me乙醚-3-0-alpha-L-吡喃鼠李糖苷，7-0-beta-D-吡喃葡糖苷。(20)Camelliaside A:茨非醇3_0_(2_0_卩比喃半乳糖基-6-0-卩比喃鼠李糖基)批
喃葡糖苷。(21)Camelliaside B:茨非醇3_0_(2_0_卩比喃木糖基-6-0-卩比喃鼠李糖基)卩比喃
葡糖苷。(22)甘油栓:粘附到糖苷上的糖分子。(23)全细胞反应:使用全细胞且不破坏细胞或分离酶的反应。(24)氧化还原酶:催化为生物体提供能量必需的氧化和还原反应的酶。有机化合物的大部分氧化通过脱氢作用发生。(25)氧化还原酶提取物:包括通过破坏根瘤菌GIN611的细胞获得的氧化还原酶或表达所述氧化还原酶的重组蛋白的细胞提取物。
(22)MALD1-T0F质谱:基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱。(26)HPLC:高效液相层析。(27)PCR:聚合酶链式反应；一种特异性扩增DNA区域的技术。(28) ORF:开放读框；在起始密码子和终止密码子之间的序列。(29)克隆:一种技术，将DNA片段插入重组DNA克隆载体并使用获得的重组DNA转化宿主细胞。(30) bp:碱基对。本文内容提供新的微生物根瘤菌GIN611或其细胞提取物。本文内容的发明人已经选择出利用多种人参皂苷的混合物作为碳源生长的微生物并证实所述微生物具有利用人参皂苷CK作为底物的反应性。在一个实施方案中，本文内容提供一种使用根瘤菌GIN611或其细胞提取物作为生物催化剂将天然产物去糖基化的方法。天然产物可以是人参皂苷糖苷、异黄酮糖苷或类黄酮糖苷，但不限于此。在另一个实施方案中，本文内容提供一种使用根瘤菌GIN611或其细胞提取物作为生物催化剂从糖苷产生各种糖苷配基的方法。天然产物可以是人参皂苷糖苷、异黄酮糖苷或类黄酮糖苷，但不限于此。糖苷配基可以是人参皂苷糖苷配基、异黄酮糖苷配基或类黄酮糖苷配基，但不限于此。
人参皂苷糖苷不特别限定，但可以选自例如人参皂苷化合物K(CK)、人参皂苷Rh2、人参皂苷F2、人参皂苷Rb 1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Re、人参皂苷Rb3、人参皂苷Fl和人参皂苷Re。特别地，其可以是人参皂苷化合物K(CK)。人参皂苷糖苷配基不特别限定，但可以选自例如人参皂苷Pro (S)、人参皂苷化合物Y、人参皂苷Me、人参皂苷化合物Mx、人参皂苷PPT (S)和人参皂苷Rg2。特别地，其可以是人参皂苷PPD (S)。人参皂苷糖苷和人参皂苷糖苷配基概述于表I。表I
权利要求
1.新的根瘤菌61恥110((1'(117088 )。
2.权利要求I的根瘤菌GIN611的细胞提取物。
3.一种利用权利要求I的根瘤菌GIN611或权利要求2的细胞提取物作为生物催化剂将天然产物去糖基化的方法。
4.权利要求3的将天然产物去糖基化的方法，其中所述天然产物是人参皂苷糖苷、异黄酮糖苷或类黄酮糖苷。
5.权利要求3的将天然产物去糖基化的方法，其中所述天然产物选自人参皂苷化合物K(CK)、人参皂苷Rh2、人参皂苷F2、人参皂苷Rb I、人参皂苷Rb2、人参皂苷Re、人参皂苷Rb3、人参阜苷F1、人参阜苷Re、大豆苷、淫羊藿苷、camelliaside A和camelliaside B。
6.权利要求3的将天然产物去糖基化的方法，其中所述去糖基化的天然产物的糖选自葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖和木糖，并且所述糖通过氧化降解。
7.权利要求6的将天然产物去糖基化的方法，其中通过氧化葡萄糖残基的3-羟基(OH)基团将葡萄糖降解。
8.一种从人参皂苷糖苷、异黄酮糖苷或类黄酮糖苷产生人参皂苷糖苷配基、异黄酮糖苷配基或类黄酮糖苷配基的方法，所述方法使用权利要求I的根瘤菌GIN611或权利要求2的细胞提取物作为生物催化剂。
9.一种氧化还原酶，其包含SEQ ID N03的氨基酸序列。
10.一种细胞提取物，其包括权利要求9的氧化还原酶。
11.一种DNA，其编码权利要求9的氧化还原酶。
12.权利要求11的DNA，其包含SEQID N02的序列。
13.一种重组DNA载体，其包含权利要求11或12的DNA。
14.一种用权利要求13的重组DNA载体转化的宿主细胞。
15.一种细胞提取物，其包括权利要求14的宿主细胞。
16.一种氧化还原酶，其与SEQ ID N03的序列具有至少60%的序列相同性并具有对天然产物的去糖基化活性。
17.权利要求16的氧化还原酶，其中所述天然产物是人参皂苷糖苷、异黄酮糖苷或类黄酮糖苷。
18.权利要求16的氧化还原酶，其中所述天然产物选自人参皂苷化合物K(CK)、人参皂苷Rh2、人参皂苷F2、人参皂苷此1、人参皂苷此2、人参皂苷此、人参皂苷此3、人参皂苷卩1、人参阜苷Re、大豆苷、淫羊藿苷、camelliaside A和camelliaside B。
19.权利要求16的氧化还原酶，其中所述糖选自葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖和木糖，并且所述糖通过氧化降解。
20.权利要求16的氧化还原酶，其从人参皂苷糖苷、异黄酮糖苷或类黄酮糖苷产生人参皂苷糖苷配基、异黄酮糖苷配基或类黄酮糖苷配基。
21.权利要求16的氧化还原酶，其中所述氧化还原酶来源于土壤杆菌属(Agrobacterium sp.)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium sp.)或狭长平胞属(Stenotrophomonas sp.)。
22.一种细胞提取物，其包括权利要求16的氧化还原酶。
23.一种使用生物催化剂将天然产物去糖基化的方法，所述生物催化剂选自包括SEQID N03的氨基酸序列的氧化还原酶，包括包含SEQID N03的氨基酸序列的氧化还原酶的细胞提取物，用包含编码包含SEQID N03的氨基酸序列的氧化还原酶的DNA的重组DNA载体转化的宿主细胞，包括用包含编码包含SEQ ID N03的氨基酸序列的氧化还原酶的DNA的重组DNA载体转化的宿主细胞的细胞提取物，用包含括SEQ ID N02的序列的DNA的重组DNA载体转化的宿主细胞，用包含包括SEQ ID N02的序列的DNA的重组DNA载体转化的宿主细胞的细胞提取物，用包含编码与SEQ ID N03的序列具有至少60%的序列相同性并具有去糖基化活性的蛋白的DNA的重组DNA载体转化的宿主细胞，包括用包含编码与SEQ IDN03的序列具有至少60%的序列相同性并具有去糖基化活性的蛋白的DNA的重组DNA载体转化的宿主细胞的细胞提取物，与SEQ ID N03的序列具有至少60%的序列相同性并具有去糖基化活性的氧化还原酶，以及包括与SEQ ID N03的序列具有至少60%的序列相同性并具有去糖基化活性的氧化还原酶的细胞提取物。
24.权利要求23的将天然产物去糖基化的方法，其中所述天然产物是人参皂苷糖苷、异黄酮糖苷或类黄酮糖苷。
25.权利要求23的将天然产物去糖基化的方法，其中所述天然产物选自人参皂苷化合物K(CK)、人参皂苷Rh2、人参皂苷F2、人参皂苷Rb I、人参皂苷Rb2、人参皂苷Re、人参皂苷Rb3、人参阜苷F1、人参阜苷Re、大豆苷、淫羊藿苷、camelliaside A和camelliaside B。
26.权利要求23的将天然产物去糖基化的方法，其中所述去糖基化的天然产物的糖是葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖或木糖，并且所述糖通过氧化降解。
27.一种使用生物催化剂从人参皂苷糖苷、异黄酮糖苷或类黄酮糖苷产生人参皂苷糖苷配基、异黄酮糖苷配基或类黄酮糖苷配基的方法，所述生物催化剂选自包含SEQ ID N03的氨基酸序列的氧化还原酶，包括包含SEQ ID N03的氨基酸序列的氧化还原酶的细胞提取物，用包含编码包含SEQ ID N03的氨基酸序列的氧化还原酶的DNA的重组DNA载体转化的宿主细胞，包括用包含编码包含SEQ ID N03的氨基酸序列的氧化还原酶的DNA的重组DNA载体转化的宿主细胞的细胞提取物，用包含包含SEQ IDN02的序列的DNA的重组DNA载体转化的宿主细胞，用包含包含SEQ IDN02的序列的DNA的重组DNA载体转化的宿主细胞的细胞提取物，用包含编码与SEQ ID N03的序列具有至少60%的序列相同性并具有去糖基化活性的蛋白的DNA的重组DNA载体转化的宿主细胞，包括用包含编码与SEQID N03的序列具有至少60%的序列相同性并具有去糖基化活性的蛋白的DNA的重组DNA载体转化的宿主细胞的细胞提取物，与SEQ ID N03的序列具有至少60%的序列相同性并具有去糖基化活性的氧化还原酶，以及包含与SEQ ID N03的序列具有至少60%的序列相同性并具有去糖基化活性的氧化还原酶的细胞提取物。
28.一种制备下列细胞提取物的方法，包括通过添加人参皂苷来诱导酶表达根瘤菌GIN611的细胞提取物，包括包含SEQ ID N03的氨基酸序列的氧化还原酶的细胞提取物，包括用包含编码包含SEQ ID N03的氨基酸序列的氧化还原酶的DNA的重组DNA载体转化的宿主细胞的细胞提取物，包括用包含包括SEQ ID N02的序列的DNA的重组DNA载体转化的宿主细胞的细胞提取物，包括用包含编码与SEQ ID N03的序列具有至少60%的序列相同性并具有去糖基化活性的蛋白的DNA的重组DNA载体转化的宿主细胞的细胞提取物，或包含与SEQ ID N03的序列具有至少60%的序列相同性并具有去糖基化活性的氧化还原酶的细胞提取物。
全文摘要
本发明涉及新的根瘤菌GIN611KCTC11708BP或其细胞提取物，显示糖酵解活性的新氧化还原酶，编码所述氧化还原酶的基因，包括重组载体蛋白的重组菌株，或编码重组蛋白的表达载体，以及使用上述物质作为生物催化剂将天然产物糖酵解的方法。本发明还涉及一种使用上述物质从各种天然产物产生糖苷配基的方法。从本发明新的微生物分离的新氧化还原酶不属于葡糖苷酶类，但属于氧化还原酶类，并具有针对天然产物的糖酵解活性。新的氧化还原酶氧化天然产物糖苷配基中的糖，从而产生各种糖苷配基。
文档编号C12N9/02GK103237884SQ201180038765
公开日2013年8月7日 申请日期2011年6月14日 优先权日2010年6月14日
发明者朴葰星, 金德嬉, 金汉坤, 金恩美, 金秉祺 申请人:株式会社爱茉莉太平洋, 首尔大学校产学协力团