专利名称：用于人多能细胞培养的简化基础培养基的制作方法
用于人多能细胞培养的简化基础培养基相关申请的交叉引用不适用。关于联邦政府资助的研究或开发的声明本发明受到政府支持，在国立卫生研究院授予的ES017166支持下完成。政府在本发明中有一定权利。
背景技术：
多能细胞，例如胚胎干(ES)细胞和诱导性多能干(iPS)细胞，具有分化为所有三种原胚层细胞的潜力(Thomson等，Science282，1145-1147 (1998))。已证实多能细胞的巨大发展潜力可用于基础研究和临床应用。人多能细胞培养的许多基础方法，例如生长培养基、铺板和其它条件，已得到开发与改进(Ludwig等，Nat.Biotechnol24, 185-187(2006)；Ludwig等，Nat.Methods3，637-646 (2006))。例如，当在含有胎牛血清(FBS)的培养基中，在鼠胚胎成纤维细胞(murine embryonic fibroblast, MEF)饲养细胞上起始培养人ES细胞时，现可获得完全限定培养基(fully defined media)和限定的蛋白质基质(Ludwig等，Nat.Biotechnol24, 185-187(2006))。在过去的十年，多能细胞培养方法有显著进展。开发了若干生长培养基，其为多能细胞的生存和扩增提供基础营养物质和生长因子，并直接决定细胞如何生长与分化。TeSR 是首批限定培养基中的一种，其在无饲养细胞或条件培养基时，支持多能细胞经多次培养传代仍保持在未分化状态(Ludwig等，Nat.Methods3，637-646 (2006);美国专利号7，449，334，各文件通过引用纳入本文并如其完整形式)。TeSR 除本身包含52种成分的基础培养基DMEM/F12外，还包含18种成分(表I)。可用于多能细胞培养的不同生长培养基的多样性造成了研究结果不一致。现用于多能细胞衍生和生长的培养基(包括完全限定培养基)含有会以不同方式影响多能细胞的成分。在本文描述的本发明之前，仍然未知各培养基成分在细胞培养中如何(单独地还是与其它成分联合)影响不同多能细胞的功能，如活力、多能性或分化。例如，在大多数培养基中含量最丰富的蛋白质——白蛋白，是一种脂质载体，并且同样可以通过其联合的脂质来影响多能性的分化或保持。白蛋白及其联合的脂质的质量决定它是否能用于人多能细胞培养。然而，白蛋白的质量随其来源而定，差异很大，甚至产自重组遗传材料时差异也很大，造成在不同等效实验条件下进行的实验之间的差异。同样，虽然可获得克隆的人血清白蛋白，但由于其价格相对昂贵而很少用于常规实验。从培养基中去除白蛋白的努力已被证实是不成功的。去除白蛋白或TeSR中存在的任何其它生长因子都会导致人ESC培养性能显著下降，例如细胞活力、增殖和多能性的减少(Ludwig 等，Nat.Biotechnol24, 185-187 (2006))。为充分开发多能细胞用于药物发现、测试和移植治疗的潜力，需要使这些细胞在完全限定且理想的无异源条件下衍生和生长。因此，本领域中存在对不含引起不一致性的成分的培养基的未被满足的需求 ，以保持对多能细胞培养条件的控制。本技术领域中特别需要多能细胞培养基，其仅包含支持对特定培养目标而言有重要性的多能细胞功能的那些成分。简述本发明一般涉及用于衍生和培养多能细胞的培养基、组合物和方法，更具体地涉及用于多能细胞的完全限定培养基。本发明的第一方面概括为支持多能细胞的活力、生长和多能性的无白蛋白培养基。在所述第一方面的一些实施方式中，所述培养基包含硒。在所述第一方面的一些实施方式中，所述培养基包含NODAL。在所述第一方面的一些实施方式中，所述培养基包含转铁蛋白。在所述第一方面的一些实施方式中，所述培养基包含转化生长因子-P (TGF-3 )。在所述第一方面的一些实施方式中，所述培养基仅包含水、盐、氨基酸、维生素、碳源、胰岛素和成纤维细胞生长因子(FGF)，各所述成分的量足以支持多能干细胞的活力。在所述第一方面的一些实施方式中，所述培养基仅包含水、盐、氨基酸、维生素、碳源、胰岛素、FGF、硒、转铁蛋白、以及TGF-P和NODAL 二者之一，各所述成分的量足以支持多能干细胞的增殖。在所述第一方面的一些实施方式中，所述培养基支持多能细胞在传代、冷冻、增殖、多能性、衍生和克隆化后的存活。在所述第一方面的一些实施方式中，所述培养基是无异源的。本发明的第二方面概括为用于在限定培养基中培养多能干细胞的方法。在所述第二方面的一些实施方式中，用于培养多能细胞的所述培养基仅包含水、盐、氨基酸、维生素、碳源、胰岛素和FGF，各所述成分的量足以支持多能细胞的活力。在所述第二方面的一些实施方式中，用于培养多能细胞的所述培养基仅包含水、盐、氨基酸、维生素、碳源、胰岛素、FGF、硒、转铁蛋白、以及TGF- ^和NODAL 二者之一，各所述成分的量足以支持多能干细胞的增殖。在所述第二方面的一些实施方式中，所述培养基包含支持多能细胞的扩大生长、多能性、克隆化、冷冻或衍生的限定的因子。在所述第二方面的一些实施方式中，所述用于培养多能细胞的培养基是无异源的。本发明的第三方面针对在基本不含￠-巯基乙醇和白蛋白的培养基中培养多能细胞的体外细胞培养组合物。在所述第三方面的一些实施方式中，所述培养组合物不含成纤维细胞饲养细胞、条件培养基和异源污染物。本发明的第四方面概括为用于在完全限定的条件下从成熟个体衍生iPS细胞的方法。所述方法包括以下步骤:在培养基中培养来自成熟个体的体细胞，所述培养基包含水、盐、氨基酸、维生素、碳源、胰岛素和FGF，所述成分的量皆足以保持活力，以及在限定条件(例如用来衍生iPS细胞的条 件)中重编程所述细胞。在所述第四方面的一些实施方式中，所述培养基在部分或全部所述重编程步骤中包含TGF- 3。在所述第四方面的一些实施方式中，所述培养基包含丁酸盐。在所述第四方 面的一些实施方式中，所述培养基包含氢化可的松。在所述第四方面的一些实施方式中，所述培养基是无异源的。
本发明的第五方面概括为用于在无白蛋白培养基中克隆多能干细胞的方法。所述方法包括以下步骤:将多能干细胞以克隆密度在支持多能干细胞克隆化的无白蛋白培养基中铺板。在所述第五方面的一些实施方式中，所述培养基包含ROCK抑制剂。在所述第五方面的一些实施方式中，所述培养基包含肌球蛋白抑素(blebbis tatin)。在所述第五方面的一些实施方式中，所述培养基仅包含水、盐、氨基酸、维生素、碳源、胰岛素、FGF、硒、转铁蛋白、以及TGF-P和NODAL 二者之一，各所述成分的量足以支持多能干细胞的克隆化。本发明的第六方面概括为在无白蛋白培养基中冻存保存多能干细胞的方法。所述方法包括以下步骤:在无白蛋白培养基中冷冻多能干细胞。在所述第六方面的一些实施方式中，所述培养基仅包含水、盐、氨基酸、维生素、碳源、胰岛素、FGF、硒、转铁蛋白、TGF-P和NODAL 二者之一、以及二甲亚砜(DMSO)。本发明的第七方面概括为在无白蛋白条件下衍生的iPS细胞。在无白蛋白存在时衍生的iPS细胞不受内源白蛋白的污染。本文中描述的方法和组合物可用于各种应用以衍生、培养和使用多能细胞。本发明的一个目的是为多能细胞限定短期和长期培养条件，所述多能细胞受限于支持所需培养目标的因子。本发明的另一个目的是为多能细胞提供培养条件，在所述培养条件下，处于未分化状态的培养细胞的百分比最大化。本发明的另一个目的是提供培养基，所述培养基可作为必要平台用以检测各种条件如何影响多能细胞，并用于比较先前报道的在不同培养基背景下的实验。本发明的这些及其它特征、目的和优势将从以下的说明中得到更好的理解。在该说明中，以附图作为参考，这些附图是本文的一部分，这一部分仅以说明方式呈现，而并非对本发明的限制或者实施方式。优选实施方式的说明并非限制本发明以概括所有变化形式、等价形式和可选形式。因此，应参考本文列举的权利要求来理解本发明的范围。附图简要说明考虑以下详细描述将更好地理解本发明，并且除以上所述之外的特征、方面和优势将会更加明显。所述详细的说明参考以下附图，其中:
图1A-E显示在培养中使人ES细胞存活和自我更新的培养基成分。图1A显示铺板在不同培养基中的个体化细胞的24小时存活指数。培养基缩写列于表I中。胰岛素和成纤维细胞生长因子(IF)、牛血清白蛋白(BSA)、0_巯基乙醇(BME)的存在以“ + ”表示，不存在以表示。图1B显示铺板在不同培养基中的个体化细胞的24小时或96小时存活指数。胰岛素和成纤维生长因子(FGF)的添加以“ + ”表示，去除以表示。图1C显示培养在有维生素C的TeSR 培养基(TeSR)、无维生素C的TeSR 培养基(TeSR _LAA)或DF5培养基中的个体化细胞的24小时或129小时存活指数。图1D显示各在DF5、添加硒的DF5 (DF5+硒)、DF12或已去除硒的DF12(DF12-硒)中传三代后的细胞增殖。图1E显示十二种不同基础培养基的对比分析。图2A-F显示人ES细胞和iPS细胞使用DF5S的培养条件的优化。图2A显示在DF5S(下图)或TeSR (上图)中以低密度(约1，500个细胞/cm2)接种，并于不同O2和CO2 浓度(015C5:15%02 和 5%C02 ；015C10:15%02 和 10%C02 ；05C10:5%02 和 10%C02)培养的个体化细胞的存活指数。在24小时和124小时检测细胞存活。图2B显示培养在存在小分子HA100 (+HA100)或不存在小分子撤100化11100:含100叩/1111 FGF的条件培养基)的不同培养基中的Hl细胞的克隆率(cloning efficiency)。图2C显示不同培养基中Hl细胞和衍生自包皮成纤维细胞的iPS细胞的克隆率。图2D显示不同培养基中衍生自包皮成纤维细胞的iPS细胞的克隆率。DF5StrFe代表其中加入了全转铁蛋白的DF5S培养基。图2E显示在存在HA100 (10 u M，24小时)、肌球蛋白抑素(10 y M，4小时)、或Y27632 (10 u M，24小时)的不同培养基中培养的Hl细胞的克隆率，与不存在这些因子(对照)时的克隆率做比较。星号代表P〈0.05。图2F显示在条件培养基(CM)、含有ROCK抑制剂(HA100)的CM、含有ROCK抑制剂的TeSR和含有ROCK抑制剂的E8中，在含氧量正常(深灰柱)和低氧(浅灰柱)条件中的Hl细胞的克隆率。误差柱代表均值的标准误差；星号代表P〈0.05。图3A-B显示补充了胰岛素、转铁蛋白、硒、L-抗坏血酸、FGF2和TGF-P或NODAL的DMEM/F12 (在本文中分别称为“E8 (TGF- ^ ) ”和“E8 (NODAL) ” )中的多能细胞生长和基因表达。图3A显示在TeSR (深灰线)或E8 (TGF-P)(浅灰线)中保持的HlES细胞(上图)和iPS细胞(下图)的倍数扩增。图3B显示在E8 (TGF-P)中生长的HlES细胞和在TeSR 中生长的HlES细胞的全基因表达。通过用伊鲁米那基因组分析仪(Illumina Genome Analyzer)GAIIX(全基因表达相关系数R=0.954(斯皮尔曼相关(Spearman Correlation)))进行RNA-测序，分析在TeSR或E8 (TGF ^ )培养基中保持三代的Hl细胞的RNA。图4A-F显示在多种限 定条件下的iPS细胞衍生。图4A显示添加了各种成纤维细胞生长因子(FGF)的基于DF5SFe培养基中的包皮成纤维细胞增殖，与在含有FBS的培养基中的增殖做比较。图4B显示补充了氢化可的松的不同培养基中的成纤维细胞生长。图4C显示多能性标记物0CT4(左图)和SSEA4(右图)的表达。图4D显示由包皮成纤维细胞、hES细胞、在饲养细胞上衍生的iPS细胞(iPS细胞(饲养细胞))以及在E8培养基中衍生的iPS细胞(iPS细胞(E8))的所选基因表达。在RNA分析之前，除了成纤维细胞被保持在含有氢化可的松的E8中，所有细胞都保持在E8 (TGF ^ )培养基中。图4E显示在E8 (TGF ^ )培养基中衍生的人ES和iPS细胞的全基因表达(R=0.955)。图4F是在MEF上衍生的iPS细胞和在E8 (TGF ^ )培养基中衍生的iPS细胞的全基因表达。图5A-C显示用于iPS细胞衍生的培养基的改进。图5A显示补充了 TGF-P、氢化可的松、TGF- ^和氢化可的松、或TGF- ^和氢化可的松但不含FGF的DF5SFe培养基中的包皮(深灰柱)和PRPF8-2成熟成纤维细胞(浅灰柱)增殖。图5B显示TGF- ^和丁酸盐对包皮成纤维细胞重编程的影响。在重编程转染开始后的四 五周，对转化细胞和真iPS细胞的克隆数进行评分，并计算iPS克隆与非iPS细胞克隆的比率。图6A-B显示在未经二次传代的完全限定条件下，从成熟成纤维细胞衍生iPS细胞。图6A显示重编程方案的一个示例。图6B显示通过流式细胞术分析在补充了胰岛素、转铁蛋白、硒、L-抗坏血酸、FGF2以及TGF-P或N0DAL( “E8”)的DMEM/F12传代20次维持的iPSC细胞系所测定的多能性标记物0CT4和SSEA4的表达。阴影峰:由0CT4 (左)和SSEA4(右)特异性抗体染色；非阴影峰:小鼠IgG对照抗体。图7A-C显示不同培养基中的人成纤维细胞重编程效率。图7A显示使用小鼠成纤维细胞饲养细胞(MEF)或在基于E8的培养基中经重编程处理的每80，OOO个成纤维细胞的iPS细胞克隆数。为提高效率，向两种条件中都添加了 IOOii M 丁酸钠。图7B显示在TeSR 中或在基于E8的培养基中经重编程处理的每80，000个成纤维细胞的iPS细胞克隆数。图7C显示与TGF-P和丁酸盐的接触时间对完全限定条件下的包皮成纤维细胞重编程效率的影响。成纤维细胞在补充了胰岛素、转铁蛋白、硒、L-抗坏血酸和FGF2的DMEM/F12(E8无TGF-￠)或在E8中(存在或不存在100 PM 丁酸盐)重编程。在重编程30天后检测所有条件下的重编程效率。星号代表P〈0.05。由于本发明易受不同变化和选择形式的影响，因此通过附图中实施例的方式显示示例性实施方式，并在本文中详细描述。但是应理解，对示例性实施方式的说明不是为了将本发明限制于所公开的特定形式，而与之相反，本发明适用于如所附权利要求所限定的所有落入本发明的精神和范围内的变化形式、等量形式和可选形式。实施方式的示例性说明本发明涉及本发明人的如下观察:曾被认为是培养多能细胞所必需的某些培养基成分可从多能细胞培养基配方中去除以达到某种的培养目的。本文中所用术语“多能细胞(pluripotent cell) ”指的是有能力分化为所有三种胚层细胞的细胞。多能细胞的例子包括胚胎干细胞和诱导性多能干(iPS)细胞。本文中所用术语“ iPS细胞”指的是在遗传上与其各自分化的来源体细胞基本上相同，并显示与较高潜能细胞(比如本文所述的ES细胞)相似特性的细胞。所述细胞可通过非多能细胞(例如专能(multipotent)细胞或体细胞)的重编程而获得。本发明涉及不含对特定培养目标非必需的因子的新培养基。培养目标的实施例包括但不限于:细胞存活、传代、增殖、多能性、克隆化和iPS细胞衍生。本发明特别涉及无白
蛋白培养基。澄清一点:“传代”和“克隆化”是不同的方法。“传代”描述的是将培养容器中已培养至一定密度的细胞分成团块，然后将其放入新培养容器中的过程。这些团块可包含任意数量的细胞，一般在100 1，000个细胞之间，其易起始在培养基中的生长。相反，“克隆化”指的是通过从单个个体ES细胞生长人ES细胞克隆来创建纯系集落。本文所用的术语“克隆率”指的是形成新细胞集落的个体化细胞的数量除以在培养物中铺板的个体化细胞的数量。克隆率根据培养条件的不同具有很大差异。例如，在限定且无异源的条件下，
MATR1GEL/上的人ES细胞的克隆率很低(即少于约0.1%),而用成纤维细胞-条件培养基培养的这些细胞的克隆率尽管仍然低(即少于约2%)，但就创建纯系ES细胞集落而言已足够高了。现有所用的某些培养基成分会对培养`的细胞或诱导性分化有害。例如，^ -巯基乙醇会损伤或甚至杀死培养的多能细胞。血清培养基添加剂，如牛血清白蛋白(BSA)或胎牛血清(FCS)，会诱导培养的多能细胞分化。市售可得的血清成分在其组成上也可有显著差异(甚至当其由同一来源供应)，引起不可预期的培养可变性。本文所述的培养基基本不含在大多数传统多能细胞培养基中存在的损伤性、有差异、不确定的因子。所公开的培养基已成功用于各种培养目的，比如支持短期多能细胞活力(例如24小时)、短期增殖(例如4 5天)、在延长的培养周期(例如在3个月内传代多于25次)中维持多能细胞以及用慢病毒和附加型载体从胎儿和成人成纤维细胞衍生iPS细胞。
开发了为某些细胞培养目的而特别定制的新型最简培养基。测试单一或联合的各种培养基成分，例如盐、维生素、葡萄糖源、矿物质和氨基酸，以测定它们对于活力、增殖或多能性的单独影响。开发了新的存活分析方法，并将其用于测定哪些成分对解离(dissociation)后多能细胞的存活是必需的。测试了新型培养基支持增殖和保持多能性的能力。这些培养基也用于克隆分析，以测定各培养基如何影响单个细胞及其克隆率。表I列出了本文所述的各新型培养基的完整成分列表(浅色和深色阴影区域代表该培养基中存在该成分，格纹区域表示可互换的成分，无色区域表示该培养基中不存在该成分)。表1.培养基成分
权利要求
1.一种无白蛋白培养基，所述培养基支持多能干细胞增殖。
2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基包含: 水、盐、氨基酸、维生素、碳源、胰岛素、FGF、硒、转铁蛋白、以及TGF-P和NODAL 二者之一，各所述成分的量足以支持多能干细胞增殖。
3.一种用于培养 多能干细胞的方法，所述方法包括以下步骤: 将多能干细胞置于基质上；以及 使所述细胞接触无白蛋白培养基，所述培养基支持多能干细胞增殖。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述培养基包含: 水、盐、氨基酸、维生素、碳源、胰岛素、FGF、硒、转铁蛋白、以及TGF-P和NODAL 二者之一，各所述成分的量足以支持多能干细胞增殖。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述基质包含层粘连蛋白。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述基质包含玻连蛋白。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，使所述细胞在低氧条件下接触所述培养基。
8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述多能干细胞是胚胎干细胞。
9.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述多能干细胞是诱导性多能干细胞。
10.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述多能干细胞是人细胞。
11.一种用于克隆多能干细胞的方法，所述方法包括以下步骤: 在无白蛋白培养基中以克隆密度将多能干细胞铺板，所述培养基支持多能干细胞克隆。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述培养基包含: 水、盐、氨基酸、维生素、碳源、胰岛素、FGF、硒、转铁蛋白、以及TGF-P和NODAL 二者之一，各所述成分的量足以支持多能干细胞克隆。
13.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述培养基还包含ROCK抑制剂。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述ROCK抑制剂选自HA100和Y27632。
15.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述培养基还包含肌球蛋白抑素。
16.一种冻存多能干细胞的方法，所述方法包括以下步骤: 在无白蛋白培养基中冷冻多能干细胞。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述培养基包含: 水、盐、氨基酸、维生素、碳源、胰岛素、FGF、硒、转铁蛋白、以及TGF-P和NODAL 二者之一，各所述成分的量足以支持多能干细胞增殖。
18.一种用于在限定条件下衍生诱导性多能干(iPS)细胞的方法，所述方法包括以下步骤: 在无白蛋白培养基中重编程体细胞，所述培养基支持体细胞的重编程以衍生iPS细胞。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述培养基包含: 水、盐、氨基酸、维生素、碳源、胰岛素、FGF、硒、转铁蛋白、以及TGF-P和NODAL 二者之一，各所述成分的量足以支持iPS细胞衍生。
20.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述重编程步骤包括使所述细胞接触TGF-3 5 10 天。
21.如权利要求20所述的方法，其还包括以下步骤: 在5 10天后移除TGF- P ；以及 使所述细胞接触培养基，所述培养基基本由以下成分组成: 水、盐、氨基酸、维生素、碳源、胰岛素、FGF、硒和转铁蛋白。
22.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述重编程步骤包括使所述细胞接触氢化可的松。
23.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述重编程步骤包括使所述细胞接触丁酸盐。
24.如权利要求18所述的方法，其特征在于，在无异源条件下衍生所述iPS细胞。
25.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述体细胞是成熟体细胞。
26.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述重编程步骤包括使用病毒载体。
27.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述重编程步骤包括使用附加型载体。
28.一种无白蛋白生长培养基，所述培养基支持多能干细胞的长期培养，所述培养基基本由以下成分组成:水、盐、氨基酸、维生素、碳源、胰岛素、FGF、硒、转铁蛋白、以及TGF-3和NODAL 二者之一，各所述成分的量足以支持多能干细胞的长期培养。
29.一种用于培养多能干细胞的方法，所述方法包括以下步骤: 将多能干细胞置于基质上；以及 使所述细胞接触无白蛋白培养基，所述培养基基本由以下成分组成: 水、盐、氨基酸、维生素、碳源、胰岛素、FGF、硒、转铁蛋白、以及TGF- ^和NODAL 二者之一，各所述成分的量足以支持多能干细胞的长期培养。
全文摘要
描述了支持多能干细胞活力、增殖、克隆和衍生的完全限定培养基，以及包括这些培养基的方法和组合物。还描述了用于在限定的、无异源条件下，从成熟个体衍生iPS细胞的方法。
文档编号C12N5/00GK103180434SQ201180038596
公开日2013年6月26日 申请日期2011年8月5日 优先权日2010年8月5日
发明者J·A·托马森, 陈国凯 申请人:威斯康星校友研究基金会