循环系统的制作方法

专利名称：循环系统的制作方法
循环系统引言本发明涉及一种自含式循环系统，它支持在多个毛细管生长区段中形成毛细管并且允许形成多个微型类器官和/或多个微型组织区段，用于监测一种或多种测试化合物的效果并且确定疗效、副作用、生物安全性、代谢产物、作用方式或器官再生；连同在所述自含式循环系统中建立这类微型类器官和/或微型组织的多种方法。
背景技术：
已经做出巨大的努力来开发用于体外培养的组织的生理营养供应和废物去除的多种循环系统。这些开发的目的在于体外产生器官等价物(例如肝、淋巴结(Giese (基泽)等人，2010，生物技术杂志(Journal of Biotechnology) 148，38-45)以及肺(Huh (许)等人，2010，科学(Science)，(328)5986，第 1662 - 1668 页)或甚至多器官系统(Sonntag(索恩塔格)等人，2010，生物技术杂志(Journal of Biotechnology) 148，70-75)),用于物质检测、器官再生研究或用于移植物制造。为了这些目的，最初使用了基于膜、中空纤维(Catapano (卡塔帕诺)和Gerlach (格拉奇).用于肝组织工程化的生物反应器.2.组织工程化课题(Bioreactors for Liver Tissue Engineering.2.Topics in TissueEngineering)，第 3 卷，2007.1-42 编辑 N Asha.mma.khi (阿沙马基),RReis (里斯)&EChiellini (基耶利尼))或微通道网络(Du (杜)等人，第7章:用于工程化血管化的组织构建体的微流体系统(Microfluidic Systems for Engineering Vascularized TissueConstructs) 〃.2008 (书本章节))的多种技术性的灌注系统。

在由Gerlach (格拉奇)与合作者开发的一个肝支持系统中，三束中空纤维被彼此地交织，形成用于血浆灌注和氧气供应的多个相同微型培养空间。通过两个微过滤中空纤维膜束来确保人血浆灌注，而通过一种不可渗透液体的氧气运输膜来进行充氧。基于这种原理的多个肝支持系统在若干周内具有良好的表现，这些肝支持系统被包括在患者的一个血浆流动回路中。Du (杜)等人概述了用于基于水凝胶和微加工技术来产生微血管化组织构建体的流体平台。该概述强调了在聚合材料内形成血管-毛细管网络样通道结构，用于通过组织培养进行有效液体灌注的技术能力。大多数所得微系统被用于高度有效的技术性灌注，但这些微系统不包括内皮细胞。这类系统局限于培养基或血浆的使用，但由于凝血现象而不能允许全血灌注。此外，它们不提供天然的血液组织屏障，该血液组织屏障在体内是由封闭的内皮细胞层组成。这允许穿过该细胞层的主动运输，连同允许从该组织发信号到该毛细管网络中。开发了不同的方法将技术性灌注系统(Song (宋)等人，2005，分析化学(Anal.Chem.)，2005，77，3993-3999)或合成的或生物的基质(Zhang (张)等人，2009，生物材料(Biomaterials)，30(19):3213-3223 ；ffalles (威尔斯)，2010，生物技术杂志(Journal ofBiotechnology) 148, 56-63)与内皮细胞联合。Song (宋)与合作者开发了一种微循环支持物以在确定的剪切应力下培养内皮细胞。可以在位于技术性运输通道之间的多个单独细胞培养隔区中建立内皮细胞的封闭单层。为了产生组织工程化血管移植物(tissue-engineeredvascular graft, TGVG),Zhang (张)等人开发了一种组织工程化构建体，该构建体使用了具有合适机械特性的管状静电纺丝的丝心蛋白支架来模仿血管结构。他们将人冠状动脉平滑肌细胞(HCASMC)和人主动脉内皮细胞(HAEC)种在这些管状支架的腔面上，并且在生理搏动流下培养，该生理搏动流是使用外部管材和泵在双循环生物反应器内产生的。Walles (威尔斯)等人使用了一种完全生物的基质用于在体外建立一个内皮化的脉管系统，他们将聚合物管材和受控的泵送系统连接至一个去细胞的动物肠段上。在该系统中，由内皮细胞全部覆盖的毛细管局限于该生物基质的功能上相关的区域。然而，现有技术循环系统中没有一个适用于基于如在本申请中所提供的全血的长期组织培养。本发明涉及一种封闭的并且自含式的循环系统，该循环系统在组织水平上模仿了脊椎动物的天然血液灌注环境。该系统使用了一种微型化的生理血液循环以提供微升体积的循环，从而支持几毫克的组织。这模仿了人的生理比例，其中在一种芯片兼容的微尺度(chip-compatible micro scale)下,几升的血液体积支持了几千克的组织。该自含式循环系统含有至少一个毛细管生长区段，该毛细管生长区段位于该系统的微型入口与微型出口之间。除了一个微型化的泵和多个运输通道，将用于形成血液毛细管、支持营养物交换的一个毛细管生长区段整合到该循环中。发明简述在第一方面，本发明涉及一种循环系统(1)，该系统是自含式的并且包括:a.至少一个毛 细管生长区段(2)，包括至少两个微型入口(3)和两个微型出口(4)，b.一个定向泵送装置(5)，以及c.连接定向泵送装置(5 )和这至少两个入口( 3 )的一个小动脉运输通道(6 )，和连接定向泵送装置(5)和这至少两个出口(4)的一个小静脉运输通道(7)。在第二方面，本发明涉及一种建立本发明的循环系统(I)的方法，包括以下步骤:a.将内皮细胞种到循环系统(I)中，并且b.孵育至少直至毛细管(14)已经在毛细管生长区段(2)中形成和/或直至一个内皮细胞层已经在这些运输通道中形成和/或直至一个内皮细胞层已经覆盖了泵送装置(5)的所有内表面。在第三方面，本发明涉及通过本发明的方法可生产的一种循环系统(I)。在第四方面，本发明涉及根据本发明的或根据本发明可生产的循环系统(I)用于监测一种或多种测试化合物的效果和/或用于确定疗效、副作用、生物安全性、代谢产物、作用方式或器官再生的用途。发明详细说明在以下详细描述本发明前，应当理解的是本发明不局限于在此描述的具体方法、实验方案以及试剂，因为这些可以改变。还应当理解的是，在此使用的术语仅是出于描述具体实施方案的目的，并且不是旨在限制本发明的范围，该范围将仅由所附权利要求书来限制。除非另外定义，否则在此使用的所有技术性和科学性的术语具有与本领域普通技术人员所普遍理解的相同含义。优选地，在此使用的术语如在“生物技术术语的多种语言词汇表:(IUPAC 推荐)(A multilingual glossary of biotechnological terms:(IUPACRecommendations) )” Leuenberger (洛伊恩贝格尔)，H.G.W, Nagel (纳格尔)，B.以及 Klbl(卡布)，H.编辑.(1995), Helvetica Chimica Acta 出版社，CH_4010Basel(巴塞尔)，瑞士)中所描述的，和如在由Axel (艾克塞尔)Kleemann (克林曼)&Jurgen (尤尔根)Engel (恩格尔)的“药物物质:合成、专利、申请(Pharmaceutical Substances: Syntheses, Patents, Applications)”，Thieme Medical Publishing 出版社,1999 ;由 Susan (苏珊)Budavari (布达瓦里)等人编辑的“默克索引:化学品、药物以及生物制品的百科全书(Merck IndexiAnEncyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals)”，CRC出版社，1996,以及由美国药典委员会公司(United States Pharmcopeial Convention, Inc.) , Rockville (罗克维尔)Md.(马里兰州)，2001出版的美国药典-25/国家处方集-20中所描述的来定义。除非上下文另有要求，否则贯穿本说明书和其后的权利要求书，词语“包括(comprise)”以及变体如“包括 了(comprises)”和“包括有(comprising)”将被理解为意指包括一种规定的特征、整体或步骤，或多个特征、整体或步骤的组，但不排除任何其他的特征、整体或步骤，或多个整体或步骤的组。在以下的段落中，更详细地定义了本发明的不同方面。除非清楚指出相反，否则这样定义的各个方面可以与任何其他的一个方面或多个方面组合。具体来说，被指为是优选的或有利的任何特征可以与被指为是优选的或有利的任何其他的一个特征或多个特征组合。贯穿本说明书的正文中引用了若干文件。在此引用的各文件(包括所有的专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、指示等)，无论是在上文或是下文，均通过引用以其全文结合在此。在此绝不应解释为许可本发明无权享有先于借助现有发明的这类公开内容的权利。在下文，提供了在本说明书中频繁使用的术语的一些定义。这些术语在其使用的每种情形下、在本说明书的其余内容中具有相应定义的含义和优选的含义:“细胞”意指脊椎动物或无脊椎动物的细胞系或原代细胞。“类器官”意指体外不同类型细胞的人工的、重新产生的、功能性的细胞聚集体，这些细胞聚集体显示出至少一种器官或组织功能，优选地显示出大多数或基本上所有的器官或组织功能。“组织”代表从患者或动物中取得的活检材料或外植体或体外产生的组织。“分化”意指培养的细胞的组织特异性功能的发展。“维持”描述了在给定的细胞培养过程内，保持给定的组织的所有功能恒定的能力，优选不具有细胞死亡和/或凋亡的明显标志。“培养基(Medium)”(复数:“培养基(media)”)意指具有用于培养细胞的营养物和物质的生长支持液体。合适的培养基的实例包括DMEM、汉姆氏(Ham’ s)F12以及RPMI。“基质”意指维持细胞的生活力、增强其增殖、分化以及功能、和/或类器官或器官形成的物质或物质的混合物。优选地，按可以符合存放毛细管生长区段(2)的空间的一种形式来提供基质材料。在本发明的背景中可使用的基质可以采用多种形状，包括例如，水凝胶、泡沫、织物或无纺织物。该基质材料可以包括天然存在的基质物质，像胞外基质蛋白类，优选地胶原类、层粘连蛋白类、弹性蛋白、玻连蛋白、纤连蛋白、小分子基质细胞蛋白类(small matricellular proteins)、小分子整联蛋白结合糖蛋白类、生长因子类或蛋白聚糖类，或可以包括人工的基质物质，像非可降解聚合物，例如聚酰胺纤维、甲基纤维素、琼脂糖或藻酸盐凝胶或可降解聚合物，例如聚丙交酯。“内表面”意指循环系统(I)的那些表面，这些表面是与循环的培养基、血浆和/或血液(例如全血)直接接触的。为了克服与现有技术细胞培养系统相关的问题，本发明提供了一种循环系统(1)，它是自含式的并且包括:a.至少一个毛细管生长区段(2)，包括至少两个微型入口(3)和两个微型出口
(4)，b.一个定向泵送装置(5)，以及 c.连接定向泵送装置(5 )和这至少两个入口( 3 )的一个小动脉运输通道(6 )，和连接定向泵送装置(5)和这至少两个出口(4)的一个小静脉运输通道(7)。“自含式的”是指以下事实:在该系统中的流体是在该系统内，即在定向泵送装置
(5)与这一个毛细管生长区段(2)或多个区段之间循环，并且优选不存在用于从一个外部的流体储罐连续地提供流体(例如培养 基、血液)到循环系统(I)中的流体连接。在此背景下的“外部”意指该流体储罐不是该循环系统的一个整体部分，例如，是经由管材连接至该循环系统上的。如果在孵育过程中必需对物质(例如营养物和/或流体)进行补充，优选的是通过一个注入口( 17)来间断地供应这些营养物或流体，该注入口是优选位于一个小动脉或小静脉运输通道中或连接至该毛细管生长区段。在前一种情况下，这些物质(例如营养物和/或流体)被直接注入到这些毛细管内部。这种注入可能会导致内皮细胞的损伤，这些内皮细胞内衬于循环系统(I)内表面上的注入口(17)的开口。在后一种情况下，该注入增加了在该毛细管生长区段中形成的毛细管周围的毛细管外空间中的流体压力。流体和营养物将由于该毛细管外空间中的分压增加而通过这些毛细管消散到该循环中。为了避免随着时间推移并且随着反复注入有待补充的物质而使该系统中压力增加，优选的是该循环系统进一步包括一个压力补偿储罐。如果安排注入口(17)来允许注入到这些毛细管的内部，优选的是将该压力补偿储罐连接至该毛细管外空间。相反地，如果安排注入口(17)来允许注入到该毛细管外空间中，优选的是将该压力补偿储罐连接至该内部或这些毛细管。在一些优选实施方案中，该压力补偿储罐具有一个开口，优选地一个小钻孔或一个单向阀，以便将气体从该压力补偿储罐中释放。这个开口优选地按以下方式配置:如果达到一个设定阈值压力，仅将气体释放到环境中。合适的工具是，例如弹簧加载的单向阀或具有一个狭缝的硅胶塞。通过这种工具可能防止对该循环系统过度加压，过度加压会损坏所形成的毛细管。考虑到在该系统中包括较小的总液体体积，优选的是在任何给定时间下注入非常小的体积，例如小于(less then)该总体积的10%。将流体和/或细胞加载到该循环中的优选的方法是:将一个注入器、优选地一个注入针引入到该注入口中，并且通过适应于内皮细胞的移动速度的一个注入器移动速度，将流体和/或细胞注入到该循环中。一旦已经形成一个封闭的内皮细胞单层，这是特别优选的。优选的是该注入口是自封式的，即一旦注入装置(例如注射器)已经取出，便封闭液体并且还优选是气密的。这类自封的注入口的实例是本领域熟知的，并且包括单向阀和娃胶栓(si I icon pluck)。在多个优选实施方案中，通过以下方式使注入口(17)和/或该压力补偿储罐从该循环或该毛细管外空间分开:一个细胞截留膜，即具有的平均孔径大小是小于在本发明的循环系统(I)中生长的细胞的平均大小的一种膜；或多个细胞排除通道，这些细胞排除通道是被设定大小以排除在本发明的循环系统(I)中生长的细胞，以便防止细胞堵塞或逃逸。可能的是，在该系统的初始填充期间或在后来的注入期间，将气体与流体共同注入。为了避免由捕集的气泡而阻塞循环，优选的是在循环系统(I)中提供用于气泡的一个或多个阱。这些阱可以具有在一个小动脉或小静脉运输通道的面向上的一侧上的空腔或缺口的形式。额外地，优选的是以一种被动的方式为毛细管生长区段(2)提供气体介质(例如02/C02)，例如通过穿过一种可气体渗透的生物相容性基质(8)和/或穿过小动脉运输通道(6)扩散到毛细管生长区段(2)中。循环系统(I)的一个优点是，可能在一个自含式系统内维持两个或更多个不同的组织和/或类器官(15)，这些 组织和/或器官通过相同的循环液体来灌注，并且因此是处于如在天然环境中的流体连接。通常由待维持的分开组织和/或类器官(15)的数目来确定毛细管生长区段(2)的数目。因此，在本发明的循环系统(I)的一个优选实施方案中，循环系统(I)包括至少两个毛细管生长区段(2);优选它包括3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个毛细管生长区段(2)。优选地，通过提供多个可气体渗透的肺泡状(alveolar)和小静脉的运输通道(7)来实现气体(例如o2/co2)的交换，即这些肺泡状和小静脉的运输通道包括一种可气体渗透的材料或由其组成。取决于该系统中的总流体体积和运输通道(5，6)的总表面积，穿过这些运输通道的内表面的02/C02灌注可能不足以维持循环系统(I)中的细胞和/或类器官
(15)。在这些情况下，优选的是毛细管生长区段(2)之一的材料是至少部分可气体渗透的，并且从而充当一个“微型肺”来为整个循环系统(I)供应02。相应地，优选的是该毛细管生长区段的一个或多个壁包括一种可气体渗透的材料或由其组成。合适的可气体渗透材料是本领域已知的。优选地，用来形成该毛细管生长区段的一个或多个壁的材料是聚二甲基硅氧烷(PDMS)。毛细管生长区段(2)是一个空间，提供该空间用于通过种到该系统中的内皮细胞以及任选的平滑肌细胞来组装毛细管(14)。优选地，该毛细管生长区段充满了一种基质
(8)，该基质用作为毛细管(14)提供一个生长支架的目的，一旦将内皮细胞种到该系统中并且使流体通过毛细管生长区段(2)来循环，这些毛细管就会自然形成。因此，优选的是生物相容性的基质(8)包括多个微型通道、结构和/或网络，这些允许并且支持了通过内皮细胞来形成毛细管(14)。优选地，这些结构自身不具有后来毛细管的形状，而只是为所形成的毛细管提供附着点和/或导向。优选的是毛细管生长区段(2)包括一种半固态、生物相容性的基质(8)或由其组成。一旦将内皮细胞种到该系统中，毛细管(14)将开始形成(典型地始于微型入口(3)处)并且将通过流体流动来定向生长，以便最后与这些微型出口(4)之一连接。替代地，单独亦或被包埋在如上所述的一种生物相容性基质(8)中来提供生物相容性的中空纤维(9)。这些中空纤维优选在一侧连接至该微型入口并且在另一侧连接至微型出口(4)，从而导向这些内皮细胞的生长。为了维持所得到的毛细管(14)的弹性，优选的是生物相容性的中空纤维(9)的材料是可生物降解的；因为这允许该毛细管一旦已经形成，它随着时间推移而去除。优选地，生物相容性的基质(8)包括基质胶、纤维蛋白凝胶、琼脂糖凝胶、藻酸盐凝胶、合成凝胶、可交联聚合物或由其组成，并且生物相容性的中空纤维(9)优选地由选自下组的一种材料组成，该组由以下各项组成:聚乳酸(PLA)、聚丙交酯-乙交酯共聚物(PLGA)、聚己酸内酯(PCL)以及聚反丁烯二酸酐-癸二酸酐共聚物、聚乙烯醇、丙烯酸乙烯共聚物、聚丙烯酸、聚乙醇酸交酯、聚丙交酯、纤维素衍生物、甲酯基/乙基/羟丙基、透明质酸、叶酸连接的环糊精/葡聚糖、肌氨酸/氨基酸间隔的聚合物、角叉菜胶、果胶/壳聚糖、壳聚糖、葡聚糖、胶原或其混合物。优选的可交联聚合物是具有化学式PEG-(DCR-CG)η的PEG衍生物，其中PEG是聚(乙二醇)，DCR是一个降解控制区，CG是一个交联基团，并且η等于或大于3。用于生物相容性的中空纤维(9)的特别优选的材料是PLA和PLGA。该基质和/或中空纤维连同小动脉或小静脉运输通道的材料的选择确定了本发明的循环系统的内表面是被内皮细胞快速并且完全覆盖的。氧气运输的分析已经导致了离毛细管的向内流入端(inflow end)最远的组织位点构建了一个致命的角落(lethal corner)的想法(Intaglietta (因塔列塔)等人，1996，心血管研究(CardiovascularResearch) 32，632-643)。由于在身体中(例如在肿瘤组织中)还存在具有低O2分压的区域，本发明的一个目的在于在毛细管生长区段(2)内建立一个所谓的“新生血管形成(neovascularisation)”区(16),即一个区段,其中在本发明的循环系统(I)中初始建立毛细管(14)过程中，没有形成毛细管(14)。这通过提供一个在毛细管生长区段(2)内的子区段(16)来实现，该子区段是没有微型入口(3)和出口(4)的。如果将这个子区段(16)移开离相应的微型入口(3)和微型出口(4)足够远，那么在这个子区段中的毛细管(14)形成会削弱。如果其中没有毛细管形成，该子区段是被移开足够远的，优选地，它被移开至少ΙΟΟμπι和高达500 μ m,优选该子区段具有离微型入口(3)和/或微型出口在100 μ m至300 μ m的范围内的距离。然后可能将选择的任何组织或类器官放置在这个区域(例如肿瘤组织)中，以便研究用于构建毛细管(14)或再生过程的线索。如下所更详细地概述，优选的是可以移开界定毛细管生长区段(2)的一部分材料，以便允许通向毛细管生长区段(2)。设想通过这个开口将细胞和/或类器官引入到毛细管生长区段(2)中。之后覆盖这个开口以成为流体密封的。该盖子的材料优选地是选自半透明的材料，例如玻璃或塑料，这些材料允许通过显微法来进行毛细管生长区段(2)的显微检查。优选地，该材料不是可气体渗透的。然而，在实施方案中，其中一个或多个毛细管生长区段具有“微型肺”的功能，用一种可气体渗透的盖子来覆盖这样的毛细管生长区段。优选地，将毛细管生长区段(2)模制或打磨成给定材料的固体嵌段，优选地是以长方体形式。在该实施方案中，优选的是该开口是在该嵌段的上侦牝并且在毛细管生长区段(2)的整个表面积上延伸。如果待血管化的区域没有被供应氧气，那么促进了通过内皮细胞的毛细管(14)的形成。此外，毛细管(14)的最大长度应该不超过4mm，因为处于天然密度的周围组织完全消耗了通过这种距离内的这类毛细管(14)而提供的营养物，尤其是氧气。

因此，在一个优选实施方案中，有待通过新形成的毛细管(14)而连接的微型入口(3)与微型出口(4)之间的距离不应该超过这个最大距离，以便培养毛细管(14)的生长。因此，优选的是在一个微型入口(3)与最近的微型出口(4)之间的距离是在0.2_至4_、更优选地0.3至2mm、甚至更优选地0.4mm至Imm的范围内，优选地约0.5mm。毛细管生长区段(2)的宽度是在0.5_与1.5_之间，优选地1.0mm和/或毛细管生长区段(2)的高度是在
0.3至0.7mm之间，优选地0.5mm。毛细管生长区段(2)的体积是在0.03 μ I至4.2 μ I之间，优选地在0.5μ I至1.0μ I之间。毛细管生长区段(2)、小动脉运输通道(6)、小静脉运输通道(7)以及定向泵送装置(5)的总体积是在Ι.Ομ I至100μ I之间，优选地在5.0μ I至15 μ I之间。为了促进线性毛细管连接的生长，优选的是将这些微型入口(3)和微型出口(4)各自安排在毛细管生长区段(2)的相反端。优选的是该毛细管生长区段具有一种基本上长方体的，优选地立方的形状。优选地，将该微型入口和微型出口安排在该长方体的相反面上。该长方体的长度则由这些微型入口与微型出口之间的距离来确定。特别优选的是将各微型入口(3)与对应的微型出口(4)直接成一线。希望的是，通过这些毛细管对毛细管生长区段提供氧气，因此，优选的是形成该毛细管生长区段的壁的材料具有一种低的或不具有气体渗透性。然而，如果一个或多个毛细管生长区段具有微型肺的功能，则如上所概述来设计这些生长区段。优选地，该壁材料选自下组，该组由玻璃或塑料组成。如上所述，一旦被种有内皮细胞，在毛细管生长区段(2)内就会自发形成毛细管
(14)。这些内皮细胞的一个重要定向线索是流体穿过系统的流动。为了促进具有正确大小的毛细管(14)的生长，优选的是 微型入口(3)和/或微型出口(4)的直径是在5 μ m至50μπκ更优选15μπι至30μπι之间。所形成的毛细管(14)具有在I至ΙΟμπκ优选地5至
6μ m范围内的直径。如下将更详细描述，在该毛细管生长区段中的微型入口和微型出口的数目对应于这些小动脉和小静脉运输通道的表面积。为了向组织提供足够的氧气，将相应数目的微型入口和微型出口优选地分布在该毛细管生长室的相应侧的表面上。出于相同的原因，所形成的两个毛细管之间的距离应该不低于30 μ m。因此，优选的是微型入口(3)之间的距离是在30 μ m至500 μ m的范围内，优选地在80 μ m至200 μ m的范围内，和/或微型出口(4)之间的距离是在30μπι至500μπι的范围内，优选地在80μπι至200μπι的范围内。在一个优选实施方案中，将这些微型入口(3)和/或微型出口(4)安排成一排、两排、三排或四排。设想将组织和/或类器官(15)放置在一个或多个毛细管生长区段(2)中，这将执行它们的天然功能。因此，在一个优选实施方案中，毛细管生长区段(2)进一步包括一种毛细管外流体和/或废物收集器(10)。通过毛细管内压力差来驱动毛细管外流体的排放。这用作从毛细管外分泌流体的组织和/或类器官(15)(例如胰腺、肾、肠)中排放掉流体的目的。优选地，以一种方式将废物收集器(10)与生物相容性的基质(8)和/或生物相容性的中空纤维(9)分开，这防止了血细胞和/或组织或类器官细胞从毛细管生长区段(2)中流出。优选地，通过以下方式使该毛细管外的流体和/或废物收集器(10)与剩余的毛细管生长区段(2)分开:一个细胞截留膜(11)，即具有的平均孔径大小是小于在本发明的循环系统(I)中生长的细胞的平均大小的一种膜；或多个细胞排除通道，这些细胞排除通道是被设定大小以排除在本发明的循环系统(I)中生长的细胞。
为了监测该系统的状态，优选的是将一个或多个传感器(12)安排在本发明的循环系统(I)中，优选地在一个肺泡状的和/或小静脉的运输通道(7)中、在毛细管外流体和/或废物收集器(10)、和/或该定向泵送装置中。可以使用的传感器(11)包括但不局限于:PH传感器、p02传感器；分析物捕获传感器、电导传感器、等离子体共振传感器、温度传感器、CO2传感器；N0传感器、趋化性传感器、细胞因子传感器、离子传感器、压力传感器、电位传感器、电流传感器、流通传感器、填充传感器、阻抗传感器、电导传感器、电磁场传感器、表面声波传感器、以及代谢传感器。在本系统中使用的传感器(12)可以是监测毛细管生长区段(2)和/或流出毛细管生长区段(2)的培养基的传感器，或可以是被位于该废物通道和/或储罐(10)内的传感器(12)。这些运输通道模仿了血液系统中的更小动脉和静脉，并且用作定向泵送装置(5)与毛细管生长区段(2)之间的连接。因此，优选的是这些运输通道是适合被涂布平滑肌细胞和内皮细胞的。具有希望的直径和形态的运输通道可以通过微机械加工在一个生物相容性基质(8)中的相应结构来提供，或可以是生物相容性的中空纤维(9)。然而，还可能使用去细胞化的生物小动脉和/或小静脉。这些运输通道(6，7)的表面积足以为大多数的系统提供所需要的O2，除非存在太多的毛细管生长区段(2)。因此，优选的是所述生物相容性的基质(8)或生物相容性的中空纤维 (9)是至少部分可气体渗透的，优选地包括PDMS或由其组成。PDMS是一种基于硅的有机聚合物，是光学透明的、粘弹性的，并且可以例如通过表面电荷光刻来直接地图案化。在本发明的一个优选实施方案中，小动脉运输通道(6)和/或小静脉运输通道(7)在其与定向泵送装置(5)相连接处的直径是在300 μ m与2.0mm之间，优选500 μ m。希望的是，在循环系统(I)中的流体流动的速度在该流体循环期间，不会贯穿该系统中显著变化。优选地，该系统中的流速是在0.02cm/s至0.lcm/s、更优选0.03至0.07cm/s的范围内，最优选约0.05cm/s。然而，这些微型入口(3)和微型出口(4)通常具有分别小于小动脉微型入口(3)和小静脉微型出口(4)的直径和因此更小的表面积，这将导致当该流体进入这些微型入口(3)时该流速增加。因此，优选的是分别地，小动脉运输通道(6)分支至少一次以与这至少两个入口连接，并且小静脉运输通道(7)分支至少一次以与这至少两个出口(4)连接。为了防止该流体流动的明显改变，优选的是在分支点(13)后的这些小动脉通道的组合横截面积是与在分支点(13)前的小动脉通道的横截面积基本相同，和/或在分支点(13)后的这些小静脉运输通道(7)的组合横截面积是与在分支点(13)前的小静脉通道的横截面积基本相同。通常，被连接至定向泵送装置(5 )的小动脉通道(6 )或小静脉通道(7 )分支成两个或三个更小直径的小动脉和小静脉的通道(6，7)。为使小动脉的和小静脉通道的直径减小到相应微型入口(3)和微型出口(4)的直径所要求的分支点(13)的数目和/或分支的数目，是由小动脉通道(6)和小静脉通道(7)的相应横截面积以及它们分别连接的微型入口(3)和微型出口(4)的直径和横截面积来确定的。例如，如果小动脉通道(6)具有Imm的直径，并且微型入口(3)的直径是50 μ m,则(than) 400个微型入口(3)具有与处于定向泵送装置(5)处的小动脉通道(6)相同的表面积。因此，要求提供如所需要的一样多的双向、三向、四向或更多向的分支点(13)，以便将各单独的微型入口与一个分支的小动脉通道
(6)相连接。在一个优选实施方案中，分支点(13)是双向分支点(13)，并且因此，由公式2n来确定微型入口(3)的数目，其中η是在各流动路径中的分支点(13)的数目。在循环系统(1)包括两个或更多个毛细管生长区段(2)的情况下，使该流动路径分支来分开连接这两个毛细管生长区段(2)。并不要求两个分支具有相同的横截面积，只要分支点(13)后的组合横截面积与分支点(13)前的横截面积相同或基本上相同。例如，在一种“微型肺”已经在一个毛细管生长区段(2)中形成的情况下，可以不要求如同到另一个类器官(15)的毛细管生长区段(2)—样，将类似量的流体引导至这个类器官(15)。因此，在分支点(13)处，连接该肺-类器官的小动脉分支将具有比连接另一个毛细管生长区段(2)的小动脉分支更小的表面积。所有入口(3)的组合横截面积与所述一个小动脉通道和/或多个小动脉通道的横截面积基本上相同，并且所有出口(4)的组合横截面积与所述一个小静脉通道和/或多个小静脉通道的横截面积，优选是多个小动脉通道(6)和多个小静脉通道(7)的横截面积基本上相同。优选地，定向泵送装置(5 )是一种生物泵、液压泵、压电泵、蠕动泵、气动泵、电磁泵或磁性泵。例如通过心肌细胞来形成一种生物泵，优选地将这些心肌细胞种在具有一种形状的弹性聚合物上，该形状支持了在心肌细胞收缩下的搏动性流动(Tanaka等人，2006，实验室芯片(Lab Chip), 6，362-386)。这些心肌细胞的颤搐提供了泵送行为必需的收缩。该流动的方向性(即从泵送装置(5)的这些小静脉通道进入该泵送装置的小动脉通道)可以通过泵(5)的致动模式来确立，这导致仅在泵送装置(5)的一个侧面上驱逐流体，或在多种情况下，其中泵送装置(5)只是通过培养进入这些小动脉通道中的一种定向流动的另外的元件来搏动。因此，在一个优选实施方案中，定向泵送装置(5)包括一个或多个定向流动元件，优选地选自下组，该组由一个喷嘴样的元件和一个单向阀元件组成。可以将这些流动元件安排在定向泵送装置(5)前的离开小静脉运输通道(7)的流动路径中，和/或在定向泵送装置(5)后的进入小动脉通道的流动路径中。在喷嘴样的元件的情况下，优选将它们安排在定向泵送装置(5)的两端。优选地，该泵送机制是基于通过泵送室而致动的优选弹性PDMS-基质/膜的搏动，以便产生培养基 的一种连续的蠕动流动。优选地，所述运输通道和/或定向泵送装置(5)的内表面涂覆有选自下组的一种物质，该组由以下各项组成:促进细胞粘附在生物相容性的聚合物上的肽类或蛋白类、或其混合物。适用维持这些细胞的粘附分子是选自下组，该组由以下各项组成:整联蛋白类、白蛋白类、纤维蛋白类、粘附素类(adhesins)和/或胶原类、或其混合物。这种涂层培养了循环系统(I)的内表面被内皮细胞和/或平滑肌细胞所完全覆盖。在本发明的循环系统(I)的一个优选实施方案中，进一步包括在毛细管生长区段
(2)中形成的毛细管(14)和/或类器官(15)。优选地，将毛细管生长区段(2)、该定向泵送装置、这一个或多个小动脉运输通道
(6)以及小静脉运输通道(7)制造为整体。该整体可以由彼此粘附的不同材料组成。例如，定向泵送装置(5)、这一个或多个小动脉运输通道(6)以及小静脉运输通道(7)例如通过微机械加工或铸造，在可气体渗透材料(例如PDMS)的一个嵌段中形成。包括该毛细管生长区段以及这些微型入口和微型出口的部分是在一种非可气体渗透材料中形成，该部分粘附至其他部分的方式是:各微型入口和微型出口分别与一个小动脉运输通道(6)和小静脉运输通道(7)对准。当还优选的是被安排在该毛细管生长区段中的基质(8)和/或中空纤维是由一种不同于该毛细管生长区段的材料制成的时，优选的是分开生产这个部分并且将其插入到该毛细管生长区段中。优选地，然后通过一个非可气体渗透的盖子来覆盖该毛细管生长区段，除非它充当一种微型肺的功能。优选地，本发明的循环系统(I)的尺寸支持了 4_8μ I的全血穿过系统的连续循环，该系统的内表面完全覆盖有内皮细胞、优选地是它们一个单层。优选地，配置这个循环系统以便在若干月的培养中，为各自具有微升规模的至少两个不同的微型类器官提供营养物。血液(优选为全血)的使用确定了一个强缓冲系统、为这些组织提供了血浆的所有必需蛋白，支持了通过红细胞的氧气运输，并且提供了一种通过白细胞的对抗污染性微生物的免疫活性。本发明提供了一种建立一个循环系统(I)的方法，包括以下步骤:a.将内皮细胞种到循环系统(I)中，并且b.孵育至少直至毛细管(14)已经在毛细管生长区段(2)中形成和/或直至一个内皮细胞层已经在这些运输通道中形成和/或直至一个内皮细胞层已经覆盖了泵送装置(5)的所有内表面。 如果放置在提供一个生长支架、营养物和氧气以及任选的血管生成因子(angionic factor)(像FGF和/或血管内皮粘I丐蛋白(Cadherine) (VEC))的一种环境中，这些内皮细胞能够形成毛细管(14)。因此，优先通过进入口将这些内皮细胞种到该系统中，并且孵育直至毛细管(14)形成，这通常需要2至10天、优选2至6天，取决于种的内皮细胞的数目、待连接的微型入口(3)与微型出口(4)之间的距离、以及有待被内皮细胞覆盖的本发明的循环系统的总内表面。典型地，将在500至5，000个范围内的细胞种到具有在I μ I至100 μ I范围内、优选地在5μ1至50μ1范围内的总流体体积的一个系统中。天然地小动脉和小静脉不仅由内皮细胞构成，而且包括平滑肌细胞和生物相容性的基质。这些平滑肌细胞为这些小动脉和小静脉提供了柔韧性，并且赋予它们流体不可渗透性。因此，在该方法的一个优选实施方案中，进一步包括在内皮细胞之前、同时亦或之后种平滑肌细胞。优选地，种的内皮细胞和平滑肌细胞的比率是在5比I与0.5比I之间，优选地2比I。优选地，本发明的方法进一步包括以下步骤:一旦一个内皮细胞单层已经覆盖所有表面，就将全血注入到该微循环中。在该孵育期间，如果将这些内皮细胞不断地暴露于机械力，它们更可能形成完整的毛细管(14)，因此优选地步骤b)是在剪切力下进行的。通过将培养基循环穿过本发明的循环系统(I)来产生这些剪切力。优选地，在微型入口(3)和微型出口(4)处的流动是在5至20达因/cm2的范围内。为了允许这些细胞粘附至循环系统Cl)的内表面和/或迁移至毛细管生长室(2)，循环系统(I)充满了一种流体。相应地，在一个优选实施方案中，在培养基、血浆或血液、优选地全血中包括种的细胞。还可以在导致毛细管(14)形成的孵育步骤期间使用的一种特别优选的“种培养基”包含:例如补充有氢化可的松、胎牛血清(FCS)、猪VEGF、人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF)、人表皮生长因子(hEGF)、胰岛素样生长因子(R3IGF)、抗坏血酸、青霉素、链霉素的内皮细胞基础培养基-2(EBM-2)，如果该培养基是血浆或血液，优选的是补充有以上指出的物质的一种或多种。为了确定毛细管(14)是否已经在步骤b)中形成，使用了微型传感器(12)和/或视觉检测。合适的微型传感器(12)测量了跨内皮细胞电阻(TEER)。优选地，将一种或多种非内皮细胞类型种到循环系统(I)中，优选地种到毛细管生长区段(2)中，以便在毛细管生长区段(2)中建立组织和/或类器官(15)。可以在步骤a)之前、与步骤a)同时、在步骤a)之后或在步骤b)之后种这类另外的细胞。衍生出这些细胞的组织类型优选地是选自下组，该组由以下各项组成:肝、皮肤、肺、肾、肠、神经元、心肌和/或肿瘤类。本发明提供了一种通过所描述的方法可生产的循环系统(1)，例如具有建立的毛细管和/或类器官的一个循环系统。本发明提供了循环系统(I)用于监测一种或多种测试化合物的效果和/或用于确定疗效、副作用、生物安全性、代谢产物、作用方式或器官再生的用途。优选地，通过经由该注入口注入一种或多种测试化合物来进行这种测试。项目I涉及一种循环系统(1)，它是自含式的并且包括:a.至少一个毛细管生长区段(2)，包括至少两个微型入口(3)和两个微型出口
(4)，b.一个定向泵送装置(5)，以及

c.连接定向泵送装置(5 )和这至少两个入口( 3 )的一个小动脉运输通道(6 )，和连接定向泵送装置(5)和这至少两个出口(4)的一个小静脉运输通道(7)。项目2涉及项目I所述的循环系统(I)，其中循环系统(I)包括至少两个毛细管生长区段(2)。项目3涉及项目I或2中任一项所述的循环系统(1)，其中一个毛细管生长区段(2)是至少部分可气体渗透的。项目4涉及项目I至3中任一项所述的循环系统(1)，其中毛细管生长区段(2)包括一种半固态、生物相容性的基质(8 )和/或半固态、生物相容性的中空纤维(9 )或由其组成。项目5涉及项目4所述的循环系统(I)，其中生物相容性的中空纤维(9)是可生物降解的。项目6涉及项目4或5所述的循环系统(1)，其中生物相容性的基质(8)包括选自下组的一种材料或由其组成，该组由以下各项组成:基质胶、纤维蛋白凝胶、琼脂糖凝胶、藻酸盐凝胶、合成凝胶、可交联聚合物，并且生物相容性的中空纤维(9)由选自下组的一种材料组成，该组由以下各项组成:聚乳酸、聚丙交酯-乙交酯共聚物或其混合物。项目7涉及项目4至6中任一项所述的循环系统(I)，其中生物相容性的基质(8)包括多个微型通道、结构和/或网络，它们允许通过内皮细胞来形成毛细管(14)。项目8涉及项目I至7中任一项所述的循环系统(1)，其中毛细管生长区段(2)的一个区段是没有微型入口(3)和出口(4)的。项目9涉及项目I至8中任一项所述的循环系统(I)，其中这些微型入口(3)与微型出口(4)之间的距离是0.2mm至4臟，优选地0.5mm。项目10涉及项目I至9中任一项所述的循环系统(1)，其中毛细管生长区段(2)的宽度是在0.5_与1.5_之间，优选地1.0_，和/或毛细管生长区段(2)的高度是在0.3至0.7mm之间，优选地0.5mm。项目11涉及项目I至10中任一项所述的循环系统(1)，其中毛细管生长区段(2)的体积是在0.03 μ I至4.2 μ I之间。项目12涉及项目I至11中任一项所述的循环系统(1)，其中这些微型入口(3)和微型出口(4)被安排在毛细管生长区段(2)的相反端。项目13涉及项目I至12中任一项所述的循环系统(1)，其中这些微型入口(3)和/或微型出口(4)的直径是在10至50 μ m之间。项目14涉及项目I至13中任一项所述的循环系统(1)，其中毛细管生长区段(2)进一步包括一种毛细管外流体和/或废物收集器(10)。项目15涉及项目I至14中任一项所述的循环系统(I )，其中通过一个细胞截留膜或通过多个细胞排除通道(11)使该毛细管外流体和/或废物收集器(10)与生物相容性的基质(8)和/或生物相容性的中空纤维(9)分开。项目16涉及项目14或15所述的循环系统(1)，其中至少一个传感器(12)被安排在该毛细管外流体和/或废物收集器(10)中。项目17涉及项目16所述的循环系统(1)，其中这至少一个传感器(12)是选自下组，该组由以下各项组成:pH传感器、p02传感器；分析物捕获传感器、电导传感器、等离子体共振传感器、温度传感器、CO2传感器；N0传感器、趋化性传感器、细胞因子传感器、离子传感器、压力传感器、电位传感器、电流传感器、流通传感器、填充传感器、阻抗传感器、电导传感器、电磁场传感器、表面声波传感器、以及代谢传感器。项目18涉及项目I至17中任一项所述的循环系统(1)，其中该运输通道是已经被微机械加工到一种生物相容性的基质(8 )中的或是一种生物相容性的中空纤维(9 )，其中所述生物相容性的基质(8)或生物相容性的中空纤维(9)是至少部分可气体渗透的，优选地包括PDMS或由其组成。项目19涉及项目I至18中任一项所述的循环系统(I)，其中小动脉运输通道(6)和/或小静脉运输通道(7)在其与定向泵送装置(5)相连接处的直径是在300 μ m与2.0mm之间，优选地500 μ m。 项目20涉及项目I至19中任一项所述的循环系统(1)，其中分别地，小动脉运输通道(6 )分支至少一次以与这至少两个入口( 3 )连接，并且小静脉运输通道(7 )分支至少一次与这至少两个出口(4)连接。项目21涉及项目20所述的循环系统(1)，其中在分支点(13)后面的这些小动脉通道的组合横截面积与在分支点(13)前的小动脉通道的横截面积基本上相同，和/或在分支点(13)后的这些小静脉运输通道(7)的组合横截面积与在分支点(13)前的小静脉通道的横截面积基本上相同。项目22涉及项目20和21中任一项所述的循环系统(I )，其中所有入口(3)的组合横截面积与所述一个小动脉通道和/或多个小动脉通道的横截面积基本上相同，并且所有出口(4)的组合横截面积与所述一个小静脉通道和/或多个小静脉通道的横截面积基本上相同，优选地与多个小动脉通道和多个小静脉通道的横截面积相同。项目23涉及项目I至22中任一项所述的循环系统(1)，其中定向泵送装置(5)是一种生物泵、液压泵、压电泵、蠕动泵、气动泵、电磁泵或磁性泵。项目24涉及项目I至23中任一项所述的循环系统(1)，其中定向泵送装置(5)包括一个或多个定向流动元件，优选地选自下组，该组由一个喷嘴样的元件和一个单向阀元件组成。项目25涉及项目I至24中任一项所述的循环系统(I )，其中至少所述运输通道和/或定向泵送装置(5)的内表面涂覆有选自下组的一种物质，该组由以下各项组成:促进细胞粘附在生物相容性的聚合物上的肽类或蛋白类、或其混合物。
项目26涉及项目25所述的循环系统(1)，其中促进细胞粘附的肽类或蛋白类是选自下组，该组由以下各项组成:整联蛋白类、白蛋白类、纤维蛋白类、粘附素类、胶原类。项目27涉及根据项目I至26中任一项所述的循环系统(I )，进一步包括在毛细管生长区段(2)中形成的毛细管(14)和/或类器官(15)。项目28涉及一种建立根据项目I至27中任一项所述的循环系统(I)的方法，包括以下步骤:a.将内皮细胞种到循环系统(I)中，并且b.孵育至少直至毛细管(14)已经在毛细管生长区段(2)中形成和/或直至一个内皮细胞层已经在这些运输通 道中形成和/或直至一个内皮细胞层已经覆盖了泵送装置(5)的所有内表面。项目29涉及根据项目28所述的建立一个循环系统(I)的方法，其中在培养基和血浆中包括种的细胞。项目30涉及根据项目28或29所述的建立一个循环系统(I)的方法，其中该方法进一步包括以下步骤:在步骤a)之前、同时或之后种平滑肌细胞。项目31涉及根据项目28至30中任一项所述的建立一个循环系统(I)的方法，其中该方法进一步包括以下步骤:将全血注入到所述循环系统中。项目32涉及根据项目28至31中任一项所述的建立一个循环系统(I)的方法，其中在剪切力下进行步骤b)。项目33涉及根据项目29至32中任一项所述的建立一个循环系统(I)的方法，其中优选地在步骤b)后，将具有一种或多种细胞类型的细胞种到所述毛细管生长区段(2)中。项目34涉及根据项目33所述的建立一个循环系统(I)的方法，其中这些细胞是选自下组，该组由以下各项组成:肝细胞、皮肤细胞、肺细胞、肾细胞、肠细胞、神经元细胞、心肌细胞和/或肿瘤细胞。项目35涉及一种通过项目28至34中任一项所述的方法可生产的循环系统(I)。项目36涉及根据项目27或35所述的循环系统(I)用于监测一种或多种测试化合物的效果和/或用于确定疗效、副作用、生物安全性、代谢产物、作用方式或器官再生的用途。兀件符号列表(I)自含式循环系统(2)毛细管生长区段(3)微型入口(4)微型出口(5)定向泵送装置(6)小动脉运输通道(7)小静脉运输通道(8)生物相容性的基质(9)生物相容性的中空纤维(10)外流体和/或废物收集器
(11)截留膜或细胞排除通道(12)传感器(13)分支点(14)毛细管(15)组织和/或类器官(16)新生血管形成区(17)注入口附图简要说明

图1:一种自含式循环系统(I)的一个优选实施方案的自顶向下视图，该循环系统包括两个毛细管生长区段(2)、定向泵送装置(5)以及小动脉运输通道(6)和小静脉运输通道(7)。在一个优选实施方案中，泵送装置(5)和这两个毛细管生长区段(2)是平行安排的。运输通道(6，7)用作定向泵送装置(5)与毛细管生长区段(2)之间的连接。在一个优选实施方案中，将一个注入口(17)(即用于支持缓冲)紧接该微型泵而定位。通常，被连接至定向泵送装置(5)的小动脉通道(6)或小静脉通道(7)在分支点(13)处分支成两个或三个更小直径的小动脉和小静脉的通道。优选地，由不同的组织和/或类器官(15)来定殖毛细管生长区段(2)，这些组织和/或类器官通过相同的循环`流体来灌注并且允许同时例如在多于一个类器官上进行一种化合物的效果的测试。图2:自含式循环系统(I)的毛细管生长区段(2 )的一个优选实施方案的自顶向下视图。毛细管生长区段(2)是多个空间，提供这些空间用于通过例如在微型入口(3)与出口(4)之间的内皮细胞来组装毛细管(14)。为了给毛细管(14)生长提供一个适当的环境，优选的是毛细管生长区段(2)包括一种半固态、生物相容性的基质(8)或由其组成。可替代地，提供生物相容性的中空纤维(9)，这些中空纤维在一侧连接至微型入口(3)并且在另一侧连接至微型出口(4)。离毛细管(14)的向内流入端最远的组织位点在毛细管生长区段
(2)内构建了一个新生血管形成区(16)，即一个区段，其中在循环中基本建立毛细管(14)期间，没有形成毛细管(14)。优选地，毛细管生长区段(2)进一步包括一种毛细管外流体和/或废物收集器(10)，通过一个细胞截留膜(11)使该毛细管外流体和/或废物收集器与其余的毛细管生长区段(2)分开。为了监测该系统的状态，将一个或多个传感器(12)安排在毛细管外流体和/或废物收集器(10)中。图3:在实例实验中使用的自含式循环系统的一个优选实施方案的自顶向下视图，该自含式循环系统装备有一个蠕动泵(5)、用于液体置换的三个阀、一个插入件(15)以及支持填充和冲洗该系统的两个收集器(10)。图4:在灌注培养七天后，完全覆盖有人内皮细胞的自含式微循环系统的通道的一个具体区段的钙黄绿素AM生活力染色。图5:在灌注七天后，完全覆盖有人内皮细胞的自含式循环系统芯片的CellMask1:突光质膜染色。实例通过用无菌培养基中的活的人内皮细胞完全覆盖如在图3中所示的一个生物反应器原型芯片的所有通道和表面，在14天的时期内已经建立了一个自含式循环系统(I)。使用一个蠕动微型泵(5)来产生穿过组织培养空间(15)的液体循环。将用于外流体和废物的收集器(10)与阀A、B以及C组合使用，以便管理该系统中的液面和交换。通过使用一个主片(master)和PDMS来铸造该芯片。然后将该PDMS层转移到一个载玻片上，并且插入到一个夹具中。通过在该PDMS载玻片顶部上的一个碳酸盐板，将用于细胞和组织接种物(15)的金属插件、和外流体或废物收集器(10)固定到该生物反应器芯片上。一个完全组装的自含式循环系统芯片在图4中示出。在第4-7段之间使用了从Promoce 11公司获得的人真皮微血管内皮细胞(HDMEC )。在使用前，使它们在37° C和5%C02 (潮湿的孵育器)下，在具有内皮细胞生长培养基MV-2((Promocell公司，5%FCS，1%青霉素-链霉素)的T-75烧瓶中生长，并且在80%铺满时传代。对于该实验，通过用PBS洗涤一次并且添加2ml的一种0.25%胰蛋白酶/EDTA溶液来收集细胞。在37° C下孵育5min内发生这些细胞的脱离。在用DMEM中的10%FCS来中和该胰蛋白酶溶液后，在300x g下将细胞离心5min，并且使用一个血细胞计数器来计数。用80%的乙醇对一个无菌的自含式循环系统芯片冲洗10分钟。然后使用一个注射器，将PBS注入到这些通道中，并且另外孵育10分钟。在用HDMEC培养基冲洗这些通道来替换PBS之后，将该芯片在4° C下孵育过夜。为了将该HDMEC种到这些微通道中，将细胞团块在HDMEC培养基中重新悬浮至2xl07细胞/毫升的最终浓度。将细胞悬浮液转移至空的插入件(图3，15)中。为了在该插入件空间与这些收集器(图3，10)之间产生静水压力差，将培养基从这些收集器中去除。然后打开该蠕动泵，以便让这些细胞填充这些通道。额外地，打开阀A以确保均匀填充整个芯片。为了允许这些内皮细胞附着和铺散在这些通道表面上，将该自含式循环系统芯片在37° C和5%C02下孵育2h。之后，按如上所述的相同方式，将50 μ I的HDMEC-培养基添加到该插入件中，并且将细胞重新悬浮以填充这些通道。然后用培养基装满收集器、关紧，并且将该装置倒置以便让这些细胞也 附着至这些通道的顶部。在静态孵育5h之后，将该芯片连接至气动泵装置，并且将阀B和C关闭以形成一个循环的流动。在0.16Hz的泵送频率和0.3巴的压力下，将该芯片孵育14天。每天替换该插入件和收集器空间的培养基。通过荧光显微法来确定剪切对内皮细胞形状和内皮细胞对所有通道表面的完全封闭覆盖的影响(图4和图5)。
权利要求
1.一种循环系统(1)，该循环系统是自含式的并且包括: a.至少一个毛细管生长区段(2)，该毛细管生长区段包括至少两个微型入口(3)和两个微型出口(4)， b.一个定向泵送装置(5)，以及 c.连接该定向泵送装置(5)和这至少两个入口( 3 )的一个小动脉运输通道(6 )，和连接该定向泵送装置(5)和这至少两个出口(4)的一个小静脉运输通道(7)。
2.如权利要求1所述的循环系统(I)，其中该循环系统(I)包括至少两个毛细管生长区段⑵。
3.如权利要求1或2中任一项所述的循环系统(I)，其中一个毛细管生长区段(2)是至少部分可气体渗透的。
4.如权利要求1至3中任一项所述的循环系统(I)，其中该毛细管生长区段(2)包括一种半固态、生物相容性的基质(8)和/或半固态、生物相容性的中空纤维(9)或由其组成。
5.如权利要求4所述的循环系统(1)，其中该生物相容性的基质(8)包括多个微型通道、结构和/或网络，它们允许通过内皮细胞来形成毛细管(14)。
6.如权利要求1至5中任一项所述的循环系统(1)，其中该毛细管生长区段(2)的一个区段是没有微型入口(3)和出口(4)的。
7.如权利要求1至6中任一项所述的循环系统(1)，其中该毛细管生长区段(2)进一步包括一种毛细管外流体和/或废物收集器(10)。
8.如权利要求 1至7中任一项所述的循环系统(I)，其中通过一个细胞截留膜或通过多个细胞排除通道(11)使该毛细管外流体和/或废物收集器(10)与该生物相容性的基质(8)和/或生物相容性的中空纤维(9)分开。
9.如权利要求8所述的循环系统(1)，其中至少一个传感器(12)被安排在该毛细管外流体和/或废物收集器(10)中。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的循环系统(I)，进一步包括在该毛细管生长区段(2)中形成的多个毛细管(14)和/或类器官(15)。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的循环系统(1)，其中两个或更多个不同的组织和/或类器官(15)被维持在一个自含式系统内，这些组织和/或类器官是通过相同的循环流体来灌注的。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的循环系统(1)，其中提供了在该毛细管生长区段(2)内的一个子区段(16)，该子区段是没有微型入口(3)和出口(4)的。
13.根据权利要求12所述的循环系统(1)，其中将该子区段(16)移开离对应的微型入口(3)和微型出口(4)足够远，使得在这个子区段中毛细管(14)的形成被削弱。
14.根据权利要求12或13所述的循环系统(I)，其中该子区段(16)具有离这些微型入口(3)和/或微型出口(4)至少100 μ m并且高达500 μ m、优选地100 μ m至300 μ m的距离。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的循环系统(I)，其中分别地，该小动脉运输通道(6 )分支至少一次以与这至少两个入口( 3 )连接，并且该小静脉运输通道(7 )分支至少一次以与这至少两个出口(4)连接。
16.如权利要求15所述的循环系统(1)，其中在该分支点(13)后的这些小动脉通道的组合横截面积与在该分支点(13)前面的小动脉通道的横截面积基本上相同，和/或在该分支点(13)后的这些小静脉运输通道(7)的组合横截面积与在该分支点(13)前面的小静脉通道的横截面积基本上相同。
17.如权利要求15或16所述的循环系统(1)，其中所有入口(3)的组合横截面积与所述一个小动脉通道和/或多个小动脉通道的横截面积基本上相同，并且所有出口(4)的组合横截面积与所述一个小静脉通道和/或多个小静脉通道的横截面积基本上相同，优选地与多个小动脉通道和多个小静脉通道的横截面积相同。
18.一种建立根据 权利要求1至17中任一项所述的一个循环系统(I)的方法，该方法包括以下步骤: a.将内皮细胞种到该循环系统(I)中，并且 b.孵育至少直至毛细管(14)已经在该毛细管生长区段(2)中形成和/或直至一个内皮细胞层已经在这些运输通道中形成和/或直至一个内皮细胞层已经覆盖了该泵送装置(5 )的所有内表面。
19.根据权利要求18所述的建立一个循环系统(I)的方法，其中该方法进一步包括以下步骤:将全血注入到所述循环系统中。
20.根据权利要求18或19中任一项所述的建立一个循环系统(I)的方法，其中在剪切力下进行步骤b)。
21.通过权利要求18至20中任一项所述的方法可生产的循环系统(I)。
22.根据权利要求1至17或权利要求21所述的循环系统(I)用于监测一种或多种测试化合物的效果和/或用于确定疗效、副作用、生物安全性、代谢产物、作用方式或器官再生的用途。
全文摘要
本发明涉及一种自含式循环系统，该自含式循环系统支持在多个毛细管生长区段中形成毛细管并且允许形成多个微型类器官和/或多个微型组织区段，用于监测一种或多种测试化合物的效果并且确定疗效、副作用、生物安全性、代谢产物、作用方式或器官再生；连同在所述自含式循环系统中建立这类微型类器官和/或微型组织的多种方法。
文档编号C12M3/06GK103080296SQ201180038546
公开日2013年5月1日 申请日期2011年8月5日 优先权日2010年8月6日
发明者U·马克思, G·林德勒, R·霍尔兰德, S·霍夫曼, R·劳斯特尔 申请人:柏林工业大学