专利名称：一种还原酶及其基因、重组酶及制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种还原酶及其基因，以及含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，以及其重组酶和该重组酶的制备方法，以及该还原酶或其重组酶作为催化剂在不对称还原前手性羰基化合物以制备光学活性手性醇中的应用。
背景技术：
含有特定功能基团的光学活性手性醇是合成医药、农药及其它精细化学品的重要手性砌块。研究人员已开发出多种光学活性手性醇合成的方法，包括动力学拆分和不对称合成。其中，利用前手性羰基化合物的不对称还原合成光学活性手性醇的途径，可实现理论 100%的产率，是生产光学活性手性醇的重要方法。化学家们已经发现手性金属化合物可作为催化剂用于羰基的不对称还原，尽管该化学方法已被用于工业生产，然而该方法操作难度大，反应条件苛刻，且产物中可能会残留重金属，因此其应用受到限制。生物催化方法不仅反应条件温和、对环境友好，具有高度的区域选择性和立体选择性，而且避免了产物中重金属残留，恰好弥补了化学方法的不足之处，因此近几年来生物催化的羰基不对称还原反应在手性醇不对称合成中的应用越来越受到重视。氧化还原酶是催化生物氧化/还原反应的一大类酶，被广泛应用于不对称合成光学活性手性药物和功能性类固醇等化合物，因此开发具有实际应用价值的氧化还原酶一直是生物技术领域的一项重要内容。醛酮还原酶(AKR)和短链醇脱氢酶(SDR)是羰基还原酶家族的两大重要超家族。其中AKR超家族可分成15个家族，包含约150个成员。相比而言，SDR超家族成员数目较为庞大，目前已有46000多个成员。醛酮还原酶多为NADPH依赖型，通常为单亚基结构，亚基大小一般在35 40kDa左右；而短链醇脱氢酶多数由双亚基或四个亚基组成，亚基大小一般在27kDa左右。还原酶来源十分广泛，在微生物中普遍存在。例如，面包酵母全基因组中包含49个编码还原酶的开放读码框，其中18个还原酶的基因已被克隆表达并用于酮酯的不对称还原(J. Am. Chem. S°C ·，2004，126 :12827-12832)。另外，从许多其它微生物中也分离得到了具有立体选择性的还原酶，有些被进一步克隆表达， 并应用于生物催化领域。例如，Kita等(J. Mol. Catal. B =Enzym.，1999，6 :305-313)从掷孢酵母(Sporobolomyces salmonicolor) AKU4429中分离得到三种可催化4-氯乙酰乙酸乙酯不对称还原的还原酶；Itoh 等(Appl. Microbiol. Biotehnol.，2004，66 :53-62)对青霉菌 (Penicillium citrinum) IF04631中的一种β -酮酯还原酶(AKR3E1)进行了异源表达，并应用于(S)-4-溴-3-羟基丁酸甲酯的生产中。然而目前应用于工业的还原酶类催化剂所占的比率尚不足总量的14%。如何针对特定的底物找到具有高催化活性和选择性的生物催化剂是该领域至关重要的问题。将生物信息学和基因重组技术相结合，快速高效地开发性能优异的新型生物催化剂，是发展生物不对称还原技术的有效途径。Yamamoto等(Appl. Microbiol. Biotechnol.，2003，61 133-139)利用该手段克隆了来自枯草芽孢杆菌中的重组还原酶FabG以及其他多种微生物中的FabG结构类似酶，用以催化4-氯乙酰乙酸乙酯的不对称还原。另外，其它一些来自枯草芽孢杆菌的还原酶的结构和性质也已有研究报道。如枯草芽孢杆菌还原酶^bE对多种醛类化合物有还原活性(Protein Science, 2009,18 :1792-1800)；还原对联苯甲酰有还原活性(J. Biotechnol. ,2002,96 :157-169)。但这三种来自枯草芽孢杆菌的还原酶是否可以用于催化其他羰基化合物的不对称还原，迄今尚无文献报道。目前已知芽孢杆菌(Bacillus sp. )ECUOO13，即CGMCC No. 2M9可催化多种芳基酮不对称还原生成光学活性手性仲醇(Bioresour. Technol.，2010，101 =1054-1059 ；发明专利CN101372677B)。但是以该野生菌株整细胞作为催化剂时，由于酶产量很低，导致总体催化活性不高，从而限制了生物催化剂的优势发挥。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对以野生芽孢杆菌(Baci 1 Ius sp. ) CGMCC No. 2549整细胞作为芳基酮不对称还原催化剂时酶产量较低使总体催化活性不高，不对称还原底物谱较窄的缺陷，而提供一种具有优异的不对称催化活性、底物适用性广、对环境友好的还原酶及其基因，以及含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，以及其重组酶和该重组酶的制备方法，以及该还原酶或其重组酶的应用。本发明通过下述技术方案以解决上述技术问题本发明的还原酶的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 4或SEQ ID No. 6所示。本发明以来源于芽孢杆菌(Bacillus sp. )ECU0013的辅酶依赖类型为NADPH型的该还原酶为例进行说明。本发明中，所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.) E⑶0013现保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No. 25490该菌株从土壤中筛选得到， 在发明专利(CN101372677B)中有详细说明。本发明还涉及一种还原酶基因，其为(1)其碱基序列如序列表中SEQ ID No. USEQ ID No. 3 或 SEQ ID No. 5 所示；或(2)其编码由序列表中 SEQ ID No. 2,SEQ ID No. 4 或 SEQ ID No. 6所示的氨基酸序列组成的蛋白质。本发明的还原酶基因可来源于芽孢杆菌(Bacillus sp. )CGMCC No. 2M9，具体制备方法可为根据Genbank中收录的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168的还原 _^bE、FabG和YueD的基因序列设计合成引物，然后以芽孢杆菌(Bacillus sp.) CGMCC No. 2549的基因组DNA为模板，利用聚合酶链式反应(PCR)进行基因扩增，获得三条完整的还原酶全长基因序列，分别为碱基序列如序列表中SEQ ID No. 1所示的基因，命名为BCR I，全长84;3bp。其中， 其编码序列(CDQ从第1个碱基起至第840个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为 TAA。该序列无内含子，其编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示。碱基序列如序列表中SEQ ID No. 3所示的基因，命名为BCR II，全长741bp。其中，其编码序列(CDQ从第1个碱基起至第738个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为 TAA。该序列无内含子，其编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 4所示。碱基序列如序列表中SEQ ID No. 5所示的基因，命名为BCR III，全长732bp。其中，其编码序列(CDQ从第1个碱基起至第7 个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为 TAG。该序列无内含子，其编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 6所示。如本领域技术人员所知，本发明的还原酶基因的碱基序列也可以是编码由序列表中SEQ ID No. 2,SEQ ID No. 4或SEQ ID No. 6所示的氨基酸序列组成的蛋白质的其他任何碱基序列。本发明另涉及包含本发明的还原酶基因的核苷酸序列的重组表达载体。其可通过本领域常规方法将本发明的还原酶基因的核苷酸序列连接于各种载体上构建而成。所述的载体可为本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，优选pET28a。 较佳的，可通过下述方法制得本发明的重组表达载体将通过PCR扩增所得的还原酶基因产物与载体PMD-18T连接，形成克隆载体pBCRI-18T、pBCRII-18T或pBCRIII-18T，之后将克隆载体和表达载体pET28a用限制性内切酶BamHI和BioI双酶切，形成互补的粘性末端，再经T4DNA连接酶连接，形成含有本发明的还原酶基因的重组表达质粒pET-BCRI、pET-BCRII 或pET-BCRIII。本发明进一步涉及包含本发明的还原酶基因或其重组表达载体的重组表达转化体。其可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主微生物中制得。所述的宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足重组表达载体可稳定的自行复制，且所携带的本发明的还原酶基因可被有效表达即可。本发明优选大肠杆菌，更优选大肠埃希氏菌 (E. coli)BL21(DE3)或大肠埃希氏菌(E. coli)DH5 α。将前述重组表达质粒pET-BCRI、 pET-BCRII或pET-BCRIII转化至大肠埃希氏菌(E. coli)BL21 (DE3)中，即可得本发明优选的基因工程菌株，即大肠埃希氏菌(E. coli)BL21(DE3)/pET-BCRI、大肠埃希氏菌(E. coli) BL21(DE3)/pET-BCRII 或大肠埃希氏菌(E. co 1 i)BL21 (DE3)/pET-BCRI11 本发明还进一步涉及一种重组还原酶的制备方法，其包括如下步骤培养本发明的重组表达转化体，获得重组还原酶。其中，所述的重组表达转化体同前述介绍，可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主微生物得到。其中，所述的培养重组表达转化体中所用的培养基可本领域任何可使转化体生长并产生本发明的还原酶的培养基，对于菌株，优选LB培养基蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L， NaCl 10g/L，pH 7. O。培养方法和培养条件没有特殊的限制，可以根据宿主类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择，只要使转化体能够生长并产生还原酶即可。其他培养转化体具体操作均可按本领域常规操作进行。对于菌株，优选下述方法将表达本发明的还原酶基因的重组大肠杆菌(优选本发明的大肠埃希氏菌(E. coli)BL21(DE3) 重组表达转化体)接种至含氨苄青霉素的LB培养基中培养，当培养液的光密度OD6tltl达到 0. 5-0. 7 (优选0. 6)时，在终浓度为0. 1-lmmol/L (优选0. 5mmol/L)的异丙基- β _D_硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的诱导下，即可高效表达本发明的重组还原酶。本发明再进一步涉及一种重组还原酶，其为(1)按上述方法制得的重组还原酶； 或(2)氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 2,SEQ ID No. 4或SEQ ID No. 6所示的重组还原酶。本发明的重组还原酶的辅酶依赖类型为NADPH型。本发明更进一步涉及本发明的还原酶或其重组酶作为催化剂在不对称还原前手性羰基化合物以制备光学活性手性醇中的应用。较佳的，所述的应用按下述方法进行在pH 6-8的磷酸盐缓冲液中，在葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和NADP+的存在下，在本发明的还原酶或重组还原酶的作用下，将前手性羰基化合物进行不对称还原反应，制得光学活性手性醇。上述应用中，所述的不对称还原反应的各条件可按本领域此类反应的常规条件进行选择，优选如下所述的前手性羰基化合物较佳的为芳基酮类化合物或酮酯类化合物。所述的芳基酮中的芳基较佳的为苯基或芳杂基，如含有1 2个选自N、S和0的杂原子的五元或六元芳杂基，优选吡啶基。本发明优选如式1、2、3或4所示的前手性羰基化合物
权利要求
1.一种还原酶，其特征在于其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 6所示。
2.如权利要求1所述的还原酶，其特征在于其来源于芽孢杆菌(Bacillussp.)CGMCC No. 2M9。
3.—种还原酶基因，其特征在于其为(1)其碱基序列如序列表中SEQ ID No. 5所示； 或(2)其编码由序列表中SEQ ID No. 6所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
4.一种重组表达载体，其特征在于其包含如权利要求3所述的还原酶基因的核苷酸序列。
5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于所述的重组表达载体的骨架为 pET28a。
6.一种重组表达转化体，其特征在于其包含如权利要求3所述的还原酶基因或如权利要求4或5所述的重组表达载体。
7.如权利要求6所述的重组表达转化体，其特征在于其为将如权利要求5所述的重组表达载体转化至宿主微生物中制得的基因工程菌株；所述的宿主微生物为大肠杆菌，较佳的为大肠埃希氏菌(E. coli)BL21(DE3)。
8.—种重组还原酶的制备方法，其特征在于其包括如下步骤培养如权利要求6或7 所述的重组表达转化体，获得重组还原酶。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于其包括如下步骤将如权利要求7所述的重组表达转化体接种至含氨苄青霉素的LB培养基中培养，当培养液的光密度OD6tltl达到 0. 5-0. 7，优选0. 6时，在终浓度为0. 1-lmmol/L,优选0. 5mmol/L的异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷的诱导下，即可得重组还原酶；所述的LB培养基包括蛋白胨10g/L，酵母膏5g/ L 禾口 NaCl 10g/L, pH 为 7. 0。
10.如权利要求1或2所述的还原酶作为催化剂在不对称还原前手性羰基化合物以制备光学活性手性醇中的应用。
11.如权利要求10所述的应用，其特征在于所述的应用按下述方法进行在PH6-8 的磷酸盐缓冲液中，在葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和NADP+的存在下，在如权利要求1或2所述的还原酶的作用下，将前手性羰基化合物进行不对称还原反应，制得光学活性手性醇。
12.如权利要求10或11所述的应用，其特征在于所述的前手性羰基化合物为芳基酮类化合物或酮酯类化合物；所述的芳基酮中的芳基较佳的为苯基或芳杂基，所述的芳杂基较佳的为含有1 2个选自N、S和0的杂原子的五元或六元芳杂基，更佳的为吡啶基；所述的前手性羰基化合物最优选如式1、2、3或4所示的前手性羰基化合物式1 式2 式3 式4其中，R1为-H、-Cl或-Br，R1取代的位置为苯基的对位； R2 为-CH3> -CH2CU-CH2Br 或-CF3 ； R3为2-吡啶基、3-吡啶基或4-吡啶基； R4 为-CH3> -CH2CU-CH2Br 或-CF3 ；R5 为 _CH3、O-Cl-C6H5-或 _(CH2)2C6H5。
13.如权利要求12所述的应用，其特征在于所述的前手性羰基化合物在反应液中的浓度为ι 15mmol/L ；所述的还原酶或重组还原酶的用量为1 10U/L ；葡萄糖脱氢酶的用量为10 100U/L ；所述的葡萄糖的用量为5 50g/L ；所述的NADP+的用量为0. 5 1. Ommol/L ；所述的磷酸盐缓冲液的浓度为0. 05 0. lmol/L ；所述的不对称还原反应的温度为20 35°C ；所述的不对称还原反应的时间以反应完全为准。
全文摘要
本发明公开了一类还原酶及其基因，以及含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，以及其重组酶和该重组酶的制备方法，以及该还原酶或其重组酶作为催化剂在不对称还原前手性羰基化合物以制备光学活性手性醇中的应用。本发明的还原酶或其重组酶可来源于芽孢杆菌(Bacillus sp.)CGMCC No.2549，可作为催化剂应用于不对称还原前手性羰基化合物以制备多种光学活性手性醇，其催化效率高、立体选择性强，且适用的反应条件温和、对环境友好。与野生型芽孢杆菌(Bacillus sp.)CGMCC No.2549的整细胞相比，本发明的还原酶催化效果更佳，底物适用性更广，具有很好的工业应用开发前景。
文档编号C12R1/19GK102559623SQ20121005084
公开日2012年7月11日 申请日期2010年10月29日 优先权日2010年10月29日
发明者倪燕, 张 杰, 李春秀, 潘江, 王丽娟, 许建和 申请人:华东理工大学