专利名称：一种卤醇脱卤酶的生产方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种利用基因工程菌发酵生产卤醇脱卤酶的方法。
背景技术：
有机卤化合物已成为当今社会的重要环境污染物之一，这主要是由于工业排废以及人工合成卤化物在化工合成以及农业上的广泛应 用造成的。在自然界中，大部分异生质卤化物自降解能力很差，同时许多化合物被疑是致癌或高诱变物质。因此，应用微生物降解有机卤化物已引起人们广泛的关注。从1968年Castro首次发现以2，3- 二溴丙醇作为唯一的碳源而生存的黄杆菌菌株至今，人们相继筛选到多种可以降解邻卤醇的微生物，其中包括从淡水沉淀物中分离的放射形土壤杆菌菌株ADl和节杆菌菌株AD2以及从土壤中获得的棒状杆菌菌株N-1074等。它们降解有机卤化物的途径虽然存在明显差异，但是卤醇脱卤酶作为关键酶之一，催化碳卤键的断裂存在于所有的代谢途径中。由于卤醇脱卤酶具有很高的选择特异性(enantioselectivity),因此在合成光学纯卤醇、环氧化物及二醇等重要手性药物中间体方面也具有很重要的应用价值。野生型卤醇脱卤酶存在活性低和选择性较差的缺陷，使其应用受到限制。通过基因工程和分子定向进化技术，改造天然的卤醇脱卤酶，并在大肠杆菌表达系统中高效表达，可以提高卤醇脱卤酶的酶活性、底物选择性和产量。在专利申请号为200810186576. 6的专利中，安琪酵母有限公司通过以上方法开发的卤醇脱卤酶的酶活性已经提高到450U/ml。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中的卤醇脱卤酶活性不高等问题，提供一种酶活性和产量更高、生产成本更低的齒醇脱齒酶生产方法。为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案
一种卤醇脱卤酶的生产方法，包括以下步骤
(1)、构建基因工程菌，配制摇瓶种子培养基和发酵培养基；所述基因工程菌为表达了卤醇脱卤酶的重组大肠杆菌；
(2)、使基因工程菌斜面活化2(Γ25小时，再将活化后的基因工程菌接种至装有摇瓶种子培养基的摇瓶中，在37°C的条件下振荡培养8 15小时，得到种子液；
(3)、将经步骤(2)振荡培养后的种子液接入发酵培养基中进行发酵，按体积比，接种时种子液/发酵培养基=1°/Γ10% ;发酵培养的温度控制在25 37°C，发酵液的pH值控制在6. 5^7. O ;当发酵液中的细胞光密度> 20时，向发酵液中添加诱导剂，且诱导剂在发酵液中的加入质量占发酵液总量的O. 01°Γθ. 2% ;然后继续发酵1(Γ15小时；
所述发酵培养基的组成包括酵母粉扩15g/L、甘油4. 5^7. 5g/L、NaCl 8 llg/L、NaNO3I 2g/L，KH2PO4 2 3g/L，K2HPO4 12 13g/L，微量元素 2 5mg/L ；
(4)、步骤(3)完成后，采用常规方法从步骤(3)所得发酵液的培养物中取得卤醇脱卤酶，经后续处理，完成整个生产过程。根据本发明，所述发酵培养基中的微量元素包括CoCl2 · 6H20、MnCl2 · 4H20、CuCl2 · 4H20和生物素 。在本发明的一个优选实施方式中，所述发酵培养基的组成包括酵母粉12g/L、甘油6g/L、NaCl 10g/L、NaNO3 I. 44g/L、KH2PO4 2. 4g/L，Κ2ΗΡ0412· 5g/L，微量元素 2 3mg/L。优选地，所述诱导剂为异丙基_β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)。优选地，步骤(3)的发酵过程中，添加诱导剂前控制发酵液的pH值在6. 5飞.6之间，添加诱导剂后控制发酵液的PH值在6. 8飞.9之间(可用氨水调节)。优选地，步骤(3)的发酵过程中，添加诱导剂前的发酵温度控制在37°C ;添加诱导剂后的发酵温度控制在28°C。发酵过程的诱导剂添加前的一个阶段是菌体生长阶段，温度控制在37°C，发酵液PH值控制在6. 5飞.6之间，有利于菌体繁殖生长；而发酵过程的诱导剂添加后的一个阶段是诱导表达阶段，发酵温度控制在28°C，发酵液pH值在6. 8飞.9之间，更有利于卤醇脱卤酶的诱导生成。所以，最佳的诱导时间应在菌体的对数生长后期。优选地，步骤(3)的发酵过程中，发酵液中的溶氧控制在209Γ25%。优选地，所述摇瓶种子培养基的组成包括蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L和卡那霉素50ug/mL，且pH值为7. O。若未经特殊说明，本发明中所述的细胞光密度皆指的是0D_值。0D_是追踪液体培养物中微生物生长的标准方法。OD是optical density (光密度)的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度，是检测方法里的专有名词。光通过被检测物，前后的能量差异即是被检测物吸收掉的能量，特定波长下，同一种被检测物的浓度与被吸收的能量成定量关系。0D_指的就是某种溶液在600nm波长处的吸光值。吸光值正比于溶液中的吸光物质的浓度，相应地与样品的透过率成反比。由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点
本发明利用基因工程菌发酵生产卤醇脱卤酶，通过优化发酵培养基和发酵工艺条件，能够显著地提高卤醇脱卤酶的产量，提高酶活性(可达到近900U/ml)。
具体实施例方式下面结合具体的实施例对本发明做进一步详细的说明，但不限于这些实施例。本发明中的基因工程菌一重组大肠杆菌的构建按照常规分子生物操作完成见《分子克隆》(科学出版社，第二版，2002年)。本实验使用的发酵罐为上海保兴生物设备工程有限公司生产的BIOTECH-1OL发酵罐。本发明生产卤醇脱卤酶的一个具体实施方式
是
(I )、构建基因工程菌，配制摇瓶种子培养基和发酵培养基。(2)、使基因工程菌斜面活化24小时，再将活化后的基因工程菌接种至摇瓶种子培养基装液量为50mL的300 mL摇瓶中，在37°C的条件下以220 r/min的转速振荡培养10小时，再按接种液/摇瓶种子培养基的体积比为25%的接种量将上述振荡培养液接入二级摇瓶中，同样条件下再振荡培养10小时，得到种子液；分两次摇瓶培养只是为扩大菌株的培养量，这是常规操作。
(3)、将经步骤(2)振荡培养后的种子液接入发酵培养基中进行发酵，按体积比，接种时种子液/发酵培养基=1°/Γ5% ;发酵培养的温度控制在25 37°C，发酵液的pH值控制在
6.5^7. O ;当发酵液中的细胞光密度> 20时，向发酵液中添加诱导剂IPTG，且诱导剂在发酵液中的加入质量占发酵液总量的O. 01°Γθ. 2% ;然后继续发酵12小时； (4)、步骤(3)完成后，采用常规方法从步骤(3)所得发酵液的培养物中取得卤醇脱卤酶，经后续处理，完成整个生产过程。上述用到的摇瓶种子培养基的组成包括蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L和卡那霉素50ug/mL,且pH值为7. O。其制备过程如下称取IOg蛋白胨、5g酵母粉、IOgNaCl，溶解在700ml去离子水中，调节pH至7. 0，用去离子水定容至1000ml，121°C下保持20分钟，待溶液冷却到60°C左右加入卡那霉至卡那霉素的最终浓度为50ug/ml。上述用到的发酵培养基的组成包括酵母粉扩15g/L、甘油4. 5 7. 5g/L、NaCl8 llg/L、NaN03 I 2g/L，KH2PO4 2 3g/L，K2HPO4 12 13g/L，微量元素 2 5mg/L ;所述微量元素包括CoCl2 · 6H20、MnCl2 · 4H20、CuCl2 · 4H20和生物素。其中，甘油主要为菌株的生长提供碳源，其他常见的碳源还有乳糖、蔗糖和葡萄糖等；酵母粉主要为菌株的生长提供氮源，一般常见的氮源还有牛肉膏、蛋白胨等有机氮源，以及NaN03、NH4NO3^ (NH4)2SO4和尿素等无机氮源，通常无机氮源和有机氮源会配合使用以提高菌体产酶能力。实施例I
在其它条件相同的情况下，本实施例用三种常见碳源分别代替甘油作为发酵培养基中碳源，以对比不同碳源对于所生产的卤醇脱卤酶的酶活性的影响(见表I)。结果表明，以乳糖、蔗糖和葡萄糖为碳源，添加量为O. 6% (v/v)时酶活性较低，添加量增加为5. 0%时酶活性增加不明显甚至下降。表I碳源对菌体生长及产酶的影响
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实施例2
选择甘油作为发酵培养基的碳源，在其它条件相同的情况下，以包括酵母粉在内的三种有机氮源和四种无机氮源分别作为发酵培养基的氮源，添加量以氮元素摩尔数相等为依据，以对比不同氮源对于所生产的卤醇脱卤酶的酶活性的影响(见表2)。从表2中可看出，当酵母粉为氮源时，酶活性高达545. 7U/mL，而生物量仅为I. 78g/L ;以蛋白胨和牛肉膏做氮源时，虽然单位酶活性高于无机氮源，但菌体生长过快，大量营养物质消耗在生物量的增加上；而采用无机氮源虽然菌体产酶能力较高，但由于菌体量较少导致总酶量不高。表2氮源对菌体生长及产酶的影响
权利要求
1.一种卤醇脱卤酶的生产方法，其特征在于所述生产方法包括以下步骤 (1)、构建基因工程菌，配制摇瓶种子培养基和发酵培养基；所述基因工程菌为表达了卤醇脱卤酶的重组大肠杆菌； (2)、使基因工程菌斜面活化2(Γ25小时，再将活化后的基因工程菌接种至装有摇瓶种子培养基的摇瓶中，在37°C的条件下振荡培养8 15小时，得到种子液； (3)、将经步骤(2)振荡培养后的种子液接入发酵培养基中进行发酵，按体积比，接种时种子液/发酵培养基=1°/Γ10% ;发酵培养的温度控制在25 37°C，发酵液的pH值控制在6.5^7. O ;当发酵液中的细胞光密度> 20时，向发酵液中添加诱导剂，且诱导剂在发酵液中的加入质量占发酵液总量的O. 01°Γθ. 2% ;然后继续发酵1(Γ15小时； 所述发酵培养基的组成包括酵母粉扩15g/L、甘油4. 5^7. 5g/L、NaCl 8 llg/L、NaNO3I 2g/L，KH2PO4 2 3g/L，K2HPO4 12 13g/L，微量元素 2 5mg/L ； (4)、从经过步骤(3)的发酵液的培养物中取得所述卤醇脱卤酶。
2.根据权利要求I所述的卤醇脱卤酶的生产方法，其特征在于所述发酵培养基中的微量元素包括 CoCl2 · 6H20、MnCl2 · 4H20、CuCl2 · 4H20 和生物素。
3.根据权利要求I或2所述的卤醇脱卤酶的生产方法，其特征在于所述发酵培养基的组成包括酵母粉 12g/L、甘油 6g/L、NaCl 10g/L、NaNO3 I. 44g/L、KH2PO4 2. 4g/L，K2HPO412. 5g/L，微量元素 2 3mg/L。
4.根据权利要求I所述的卤醇脱卤酶的生产方法，其特征在于所述诱导剂为异丙基-β -D-硫代批喃半乳糖苷。
5.根据权利要求I所述的卤醇脱卤酶的生产方法，其特征在于步骤(3)的发酵过程中，添加诱导剂前控制发酵液的PH值在6. 5^6. 6之间，添加诱导剂后控制发酵液的pH值在6.8 6. 9之间。
6.根据权利要求I所述的卤醇脱卤酶的生产方法，其特征在于步骤(3)的发酵过程中，添加诱导剂前的发酵温度控制在37°C ;添加诱导剂后的发酵温度控制在28°C。
7.根据权利要求I所述的卤醇脱卤酶的生产方法，其特征在于步骤(3)的发酵过程中，发酵液中的溶氧控制在20% 25%。
8.根据权利要求I所述的卤醇脱卤酶的生产方法，其特征在于所述摇瓶种子培养基的组成包括蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L和卡那霉素50ug/mL，且pH值为7. O。
全文摘要
本发明涉及一种卤醇脱卤酶的生产方法，是利用微生物发酵生产卤醇脱卤酶，通过优化发酵工艺和发酵培养基，提高卤醇脱卤酶的产量和活性。本发明利用的基因工程菌为表达了卤醇脱卤酶的重组大肠杆菌，发酵培养基的组成包括酵母粉9~15g/L、甘油4.5~7.5g/L、NaCl8~11g/L、NaNO31~2g/L，KH2PO42~3g/L，K2HPO412~13g/L，微量元素2~5mg/L；所述微量元素包括CoCl2·6H2O、MnCl2·4H2O、CuCl2·4H2O和生物素等。本发明能够显著地提高卤醇脱卤酶的产量，酶活性可提高至900U/ml。
文档编号C12R1/19GK102634502SQ20121007233
公开日2012年8月15日 申请日期2012年3月19日 优先权日2012年3月19日
发明者张秀兰, 李斌, 谢磊, 郑飞剑 申请人:苏州汉酶生物技术有限公司