专利名称：克隆甘薯褪绿矮化病毒spcsv全基因组的引物对及方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种克隆甘薯褪绿矮化病毒SPCSV全基因组的引物对及方法。
背景技术：
甘薯裡绿矮化病毒(S^eetpotato chlorotic stunt virus，SPCSV)属于长线形病毒科iClosteroviridae')毛形病毒属iCrinivirus)成员。SPCSV可与马铃暮Y病毒属
狀)的甘薯羽状斑驳病毒协生共侵染甘薯引起甘薯病毒病害SPVD (sweet potatovirus disease, SPVD)。SPVD是甘薯上的毁灭性病害，通常可使甘薯减产50% 98%，甚至绝收。我国自2010年首次发现SPCSV以来，目前在全国多个甘薯种植区陆续检测到该病毒 病的存在，严重威胁我国的甘薯产业。分离克隆该病毒基因组的全长序列，进一步研究病毒基因组的结构和功能，有助于探索更有效的抗病毒基因工程途径，对于SPVD的防治具有重要意义。SPCSV的基因组为双组分单链正义RNA，基因组大小为17.6 kb左右，其基因组是已知的植物病毒中第二大的单链正义RNA病毒。分离克隆植物病毒全基因组的常规方法是首先提纯病毒，然后利用纯化病毒的RNA或感染病毒的植物叶片的总RNA进行克隆。由于SPCSV常常与多种病毒混合侵染甘薯，分离纯化极为困难，而且该病毒在甘薯体内含量很低，利用常规的克隆方法很难获得SPCSV基因组全长序列。因此，截止目前，国际上仅获得了两个SPCSV分离物的全基因组序列，国内尚未见有报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供了一组能使扩增片段相互重叠且覆盖SPCSV基因组两条RNA近全长序列的引物对；还提供了一种简便、有效的克隆甘薯褪绿矮化病毒全基因组的方法。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是
一种用于克隆甘薯褪绿矮化病毒SPCSV全基因组的引物对，包括五对引物，其核苷酸序列依次为
RNA1-1-5’5’ -GAAATACTTCCAGCTATCCAAATTTGGTG-3’
RNA1-2989-3’5’ -ATACGTCTCTCTCCAACGACAAC-3’ ；
RNA1-2420-5’ 5’ -AGAGAACAACTTCATTTCTACTCAATTGT-3’
RNA1-5596-3’ 5’ -GATAAATAAGTTTACCTGTATTGTCGGTC-3’ ；
RNA1-4410-5， 5’ -GAGCATCAACTGTGGACGGCGAACCAAGC-3’
RNA1-8637-3’ 5’ -AACCTAGTTATTTAAATACTAGGTTTTCC-3’ ；
RNA2-53-5’5’ -CATTGGTTGTCGTCATGACTCGCAT-3’
RNA2-5599-3’ 5’ -CCAACTTACCAGATTTCGAGAACTGTAC-3’ ；
RNA2-4440-5’ 5’ -ATGCGTCTCGTCGTGACGTCCAGACTG-3’RNA2-8223-3’ 5’ -GGCCTAGTTATTTAAATACTAGGTTTTCC-3’ 。一种克隆甘薯褪绿矮化病毒SPCSV全基因组的方法，包括如下步骤
(1)按照上述五组引物核苷酸序列分别合成出对应的引物；
(2)将感染SPCSV的甘薯植株种植于防虫温室内，并以其饲养烟粉虱，收集以该感染SPCSV的甘薯植株饲养至少3天的烟粉虱用液氮速冻后，置于_70°C下保存备用；
(3)取上步所得烟粉虱至少10头，放入加有预冷RNA提取液的离心管中，提取烟粉虱的总RNA作为PCR模板，进行反转录；
(4)以上步所得反转录产物作为模板，分别利用上述步骤(I)所得的引物进行PCR扩增，预期扩增片段大小分别为2. 9kb、3. 2kb、4. 2kb、5. 6kb和3. 8kb ；
(5)用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，然后将PCR产物进行纯化，分别与pMD19-T载体连接，再将连接产物转化大肠杆菌TG1，经蓝白斑筛选和PCR鉴定后获得阳性克隆；核苷酸序列测定由TaKaRa公司完成，测序完成后，对5个片段进行拼接，即获得SPCSV基因组全长序列。在所述步骤(3)中，反转录的反应体系为3.75 ML RNA模板，2W 5XRT buffer,
0.5ML浓度为10 Mmol/L的下游引物，3 ML浓度为2. 5 mmol/L的dNTPs，0. 25 ML浓度为40U/W的RNase抑制剂和0.5 ML浓度为5U/W的AMV反转录酶；所述下游引物为RNA1-2989-3’、RNA1_5596_3’、RNAl-8637_3’、RNA2_5599_3’ 或 RNA2-8223-3’ ；反转录的反应程序为42°C反转录60min，99°C 5min，5°C 5min，反应后得到反转录产物。在所述步骤(4)中，PCR的反应体系为50耵，包括5 ML10XPCR buffer，4ML浓度为 2. 5 mmol/L 的 dNTPs，浓度为 10 Mmol/L 的引物各 I ML，0. 5ML 浓度为 5U/ML 的 ZJ Taq酶，5耵反转录产物作模板，余量为ddH20 ;所述引物为RNA1-1-5’和RNA1-2989-3’，或为RNA1-2420-5’ 和 RNA1-5596-3’，或为 RNA1-4410-5’ 和 RNA1-8637-3’，或为 RNA2-53-5’ 和RNA2-5599-3’，或为 RNA2-4440-5’ 和 RNA2-8223-3’ ；PCR 反应程序为94°C预变性 5 min ；94°C变性30s, 54°C退火30s,根据目的条带大小，按照lkb/min计算延伸时间，72 °C延伸3 6 min,完成35个循环，最后72°C延伸lOmin。本发明具有积极有益的效果
I.本发明设计的5对引物扩增片段相互重叠，覆盖了 SPCSV基因组两条RNA近全长序列。2.由于SPCSV常常与多种病毒混合侵染甘薯，分离纯化极为困难，而且SPCSV在甘薯体内含量很低，因此，利用纯化病毒或提取感病甘薯叶片总RNA的常规方法很难获得该病毒基因组的全长序列。本项发明提供了一种利用带毒烟粉虱克隆甘薯褪绿矮化病毒全基因组的方法，方法简便、有效，省时、省力，为研究SPCSV提供了一个切实有效的途径。
图I为利用引物RNA1-1-5’和RNA1-2989-3’从带毒烟粉虱中扩增出的大片段的电泳 图2为利用引物RNA1-2420-5’和RNA1-5596-3’从带毒烟粉虱中扩增出的大片段的电泳 图3为利用引物RNA2-53-5’和RNA2-5599-3’从带毒烟粉虱中扩增出的大片段的电泳 图 4 为利用引物 RNA1-4410-5’ 和 RNA1-8637-3’ 及 RNA2-4440-5’ 和 RNA2-8223-3’ 从带毒烟粉虱中扩增出的大片段的电泳图。
具体实施例方式以下结合具体实施例进一步阐述本发明。下述实施例中所涉及的试验方法或分析方法，如无特别说明，均为常规方法，所用试剂如无特别说明，均为市售。实施例I :一种从烟粉虱中克隆甘薯褪绿矮化病毒SPCSV全长基因组的方法
(I)材料与方法
①供试毒源和烟粉虱将感染SPCSV (2010年7月，采自江苏徐州，采集人张振臣)的 甘薯植株种植于防虫温室内用于饲养烟粉虱，收集饲养3d以上的烟粉虱用液氮速冻后，置于-70°C保存备用。②试剂及试剂盒UNIQ-10柱式总RNA抽提试剂盒为上海生工生物工程公司产品；UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒购自北京百泰克生物技术公司；RNase抑制剂、AMV反转录酶、DNA聚合酶、pMD19-T载体购自TaKaRa公司，其它常用试剂为国产分析纯。③引物设计根据GenBank中已登录的SPCSV全基因组(FJ807784和FJ807785)的核苷酸序列设计5对引物(如SEQ ID NO. I SEQ ID NO. 10所示)
RNA1-1-5’ 5’ -GAAATACTTCCAGCTATCCAAATTTGGTG-3’ ，
RNA1-2989-3’ 5’ -ATACGTCTCTCTCCAACGACAAC-3’ ;
RNA1-2420-5’ 5’ -AGAGAACAACTTCATTTCTACTCAATTGT-3’ ，
RNA1-5596-3’ 5’ -GATAAATAAGTTTACCTGTATTGTCGGTC-3’ ;
RNA1-4410-5’ 5’ -GAGCATCAACTGTGGACGGCGAACCAAGC-3’ ，
RNA1-8637-3’ 5’ -AACCTAGTTATTTAAATACTAGGTTTTCC-3’ ;
RNA2-53-5’ 5’ -CATTGGTTGTCGTCATGACTCGCAT-3’ ，
RNA2-5599-3’ 5’ -CCAACTTACCAGATTTCGAGAACTGTAC-3’ ;
RNA2-4440-5’ 5’ -ATGCGTCTCGTCGTGACGTCCAGACTG-3’ ，
RNA2-8223-3’ 5’ -GGCCTAGTTATTTAAATACTAGGTTTTCC-3’。设计的5对引物扩增片段相互重叠，覆盖了 SPCSV基因组两条RNA近全长序列，预期扩增片段大小分别为2. 9kb、3. 2kb、4. 2kb、5. 6kb和3. 8kb。引物由上海生工生物工程公司合成。④RT-PCR :取_70°C保存的烟粉虱10头以上，放入加有30ML预冷的RNA提取液(20mmol/L 碳酸铵，pH9. 0，2%SDS, 2 mmol/L EDTA, 200 y g/ ml 皂土)的 I. 5ml 离心管中，用DEPC处理过的研磨棒充分研磨，再用170ML的抽提液冲洗研磨棒，然后按照UNIQ-10柱式总RNA抽提试剂盒说明书，提取烟粉虱体内总RNA。利用RT-PCR试剂盒进行反转录和PCR。反转录体系为10W，包括3. 75 ML RNA模板，2W 5XRT buffer，0. 5ML浓度为10 Mmol/L 的下游引物(RNA1-2989-3，、RNA1-5596-3’、RNA1-8637-3’、RNA2-5599-3’ 或RNA2-8223-3’)，3 ML浓度为 2. 5 mmol/L 的 dNTPs，0.25 ML浓度为 40U/W 的 RNase 抑制剂和0. 5 ML浓度为5U/W的AMV反转录酶。反转录的反应程序为42°C反转录60 min, 99°C5 min, 5V 5 min,反应后得到反转录产物。
PCR 的反应体系为 50W，包括5 MLlOXPCR buffer，4ML 浓度为 2. 5 mmol/L 的 dNTPs，浓度为 10 Mmol/L 的引物(RNA1-1-5，和 RNA1-2989-3’ ；RNAl-2420_5’和 RNA1-5596-3’ ;RNA1-4410_5，和 RNA1-8637-3’ ；RNA2-53_5’ 和 RNA2-5599-3’ ；RNA2-4440-5’ 和 RNA2-8223-3’)各 I ML，0. 5ML 浓度为 5U/ML 的 ZJ Taq 酶，5 反转录产物作模板，余量为ddH20。PCR扩增反应条件94°C预变性5 min，94°C变性30 s，54°C退火30 S，根据目的条带大小，按照lkb/min计算延伸时间，72°C延伸3_6 min,完成35个循环,最后72°C延伸10min。用0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，检测时上样量为20W，100V稳压电泳50min, EB染色，经UVP凝胶成像系统观察和照相。⑤RT-PCR扩增产物的克隆和序列测定将RT-PCR产物进行纯化，分别与pMD19_T载体连接，连接产物转化大肠杆菌TGl，经蓝白斑筛选和PCR鉴定后获得阳性克隆。核苷酸序列测定由TaKaRa公司完成，利用DNAMAN和BLAST软件对所测序列进行比较分析。(2)结果与分析
①RT-PCR扩增SPCSV基因组序列以提取的烟粉虱总RNA为模板，分别利用上述的5对引物进行RT-PCR扩增。结果表明，从带毒烟粉虱中均能较容易地扩增出与预期大小一致的特异性条带(见附图I至图4)。②RT-PCR扩增产物的克隆和序列测定将RT-PCR产物进行纯化，分别与pMD19-T载体连接，连接产物转化大肠杆菌TGl，经蓝白斑筛选和PCR鉴定后获得阳性克隆。核苷酸序列测定由TaKaRa公司完成，利用DNAMAN和BLAST软件对所测序列进行比较分析。结果表明，所克隆的片段与已发表(Cuellar, W. J.，Cruzado, R. K. , Fuentes, S. , Untiveros, M., Soto, M. and Kreuze, J. F. Sequence characterization of a Peruvian isolate ofSweet potato chlorotic stunt virus: Further variability and a model for p22acquisition Virus Res. 157 (I), 111-115 (2011))的东非株系的核苷酸序列一致性为82%，与已发表(FJ807784和FJ807785)的西非株系的核苷酸序列一致性分别为99%。③SPCSV基因组近全长序列的拼接利用DNAMAN软件对获得的各个片段进行拼接，对照测序峰图纠正错误碱基，获得SPCSV基因组全长序列。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.一种克隆甘薯褪绿矮化病毒SPCSV全基因组的引物对，包括五对引物，其核苷酸序列依次为 RNA1-1-5’5’ -GAAATACTTCCAGCTATCCAAATTTGGTG-3’ RNA1-2989-3’5’ -ATACGTCTCTCTCCAACGACAAC-3’ ； RNA1-2420-5’ 5’ -AGAGAACAACTTCATTTCTACTCAATTGT-3’ RNA1-5596-3’ 5’ -GATAAATAAGTTTACCTGTATTGTCGGTC-3’ ； RNA1-4410-5， 5’ -GAGCATCAACTGTGGACGGCGAACCAAGC-3’ RNA1-8637-3’ 5’ -AACCTAGTTATTTAAATACTAGGTTTTCC-3’ ； RNA2-53-5’5’ -CATTGGTTGTCGTCATGACTCGCAT-3’ RNA2-5599-3’ 5’ -CCAACTTACCAGATTTCGAGAACTGTAC-3’ ； RNA2-4440-5’ 5’ -ATGCGTCTCGTCGTGACGTCCAGACTG-3’ RNA2-8223-3’ 5’ -GGCCTAGTTATTTAAATACTAGGTTTTCC-3’ 。
2.一种克隆甘薯褪绿矮化病毒SPCSV全基因组的方法，包括如下步骤 (1)按照权利要求I所述的引物核苷酸序列合成出五对引物； (2)将感染SPCSV的甘薯植株种植于防虫温室内，并以其饲养烟粉虱，收集以该感染SPCSV的甘薯植株饲养至少3d的烟粉虱用液氮速冻后，置于_70°C下保存备用； (3)取上步所得烟粉虱至少10头，放入加有预冷RNA提取液的离心管中，提取烟粉虱的总RNA作为PCR模板，进行反转录； (4)以上步所得反转录产物作为模板，分别利用所述步骤(I)所得的引物进行PCR扩增，预期扩增片段大小分别为2. 9kb、3. 2kb、4. 2kb、5. 6kb和3. 8kb ； (5)用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，然后将PCR产物进行纯化，分别与pMD19-T载体连接，再将连接产物转化大肠杆菌TG1，经蓝白斑筛选和PCR鉴定后获得阳性克隆；核苷酸序列测定由TaKaRa公司完成，测序完成后，对5个片段进行拼接，即获得SPCSV基因组近全长序列。
3.根据权利要求2所述的克隆甘薯褪绿矮化病毒SPCSV全基因组的方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，反转录的反应体系为3.75 ML RNA模板，2W 5XRT buffer，0. 5ML浓度为10 Mmol/L的下游引物，3 ML浓度为2. 5 mmol/L的dNTPs，0. 25 ML浓度为40U/W的RNase抑制剂和0. 5 ML浓度为5U/W的AMV反转录酶；所述下游引物为RNA1-2989-3’、RNA1-5596-3’、RNAl-8637_3’、RNA2_5599_3’ 或 RNA2-8223-3’ ；反转录的反应程序为42°C反转录60min,99°C 5min, 5°C 5min,反应后得到反转录产物。
4.根据权利要求I所述的克隆甘薯褪绿矮化病毒SPCSV全基因组的方法，其特征在于，在所述步骤(4)中，PCR的反应体系为50耵，包括5 ML10XPCR buffer，4ML浓度为2.5 mmol/L 的 dNTPs，浓度为 10 Mmol/L 的引物各 I ML，0. 5ML 浓度为 5U/ML 的 ZJ Taq酶，5耵反转录产物作模板，余量为ddH20 ;所述引物为RNA1-1-5’和RNA1-2989-3’，或为RNA1-2420-5’ 和 RNA1-5596-3’，或为 RNA1-4410-5’ 和 RNA1-8637-3’，或为 RNA2-53-5’ 和RNA2-5599-3’，或为 RNA2-4440-5’ 和 RNA2-8223-3’ ；PCR 反应程序为94°C预变性 5 min ；94°C变性30s, 54°C退火30s,根据目的条带大小，按照lkb/min计算延伸时间，72 °C延伸3 6 min,完成35个循环，最后72°C延伸lOmin。
全文摘要
本发明涉及涉及一种克隆甘薯褪绿矮化病毒SPCSV全基因组的引物对及方法。该引物有五对，依次具有如SEQIDNO.1～SEQIDNO.10所示的核苷酸序列；以感染SPCSV的甘薯植株饲养烟粉虱，收集感染SPCSV的烟粉虱，提取其总RNA作为PCR模板，进行反转录，再以反转录产物作为模板，分别利用上述引物进行PCR扩增，对所得片段进行拼接，即获得SPCSV基因组全长序列。本发明所设计引物扩增片段相互重叠，覆盖了SPCSV基因组两条RNA近全长序列；本发明利用带毒烟粉虱克隆甘薯褪绿矮化病毒全基因组的方法，方法简便、有效，省时、省力，为研究SPCSV提供了一个有用工具。
文档编号C12N15/11GK102747071SQ201210174438
公开日2012年10月24日 申请日期2012年5月31日 优先权日2012年5月31日
发明者乔奇, 张德胜, 张振臣, 王永江, 王爽, 田雨婷, 秦艳红 申请人:河南省农业科学院