一种检测线粒体a3243g杂合突变率的标准品、试剂盒及其检测方法
一种检测线粒体a3243g杂合突变率的标准品、试剂盒及其检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测线粒体A3243G杂合突变率的标准品、试剂盒及其检测方法。本发明所述检测线粒体A3243G杂合突变率的标准品，包括：（1）含有3243位点为野生型A的线粒体DNA片段的载体；（2）含有3243位点为突变型G的线粒体DNA片段的载体。本发明提供的质粒分子标准品、检测方法及用于检测数据校正的回归方程能够很方便、精确地检测线粒体DNA中的A3243G杂合突变率，具有高效、灵敏的优点，而且对于突变率低于5%的杂合突变也可以精确、定量地检出，这是现有的其他突变检测手段所不具备的独特优点。本发明也为科研和生产实践上其他的杂合突变定量检测提供了很好的借鉴意义。
【专利说明】一种检测线粒体A3243G杂合突变率的标准品、试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医学工程领域，具体涉及一种检测线粒体A3243G杂合突变率的标准品、试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002]A3243G突变是线粒体基因组DNA(mito-chondrial DNA, mtDNA)上最常见的致病突变，其常以杂合形式存在，即在一个细胞中既存在野生型的mtDNA，也存在突变型的mtDNA。A3243G突变是早发性糖尿病及神经性耳聋等疾病的致病因素之一，A3243G突变率与其引起临床症状的轻重程度相关。因此，对于A3243G突变的准确定量检测具有非常重要的意义。mtDNA3243位点处于16S rRNA与tRNALeu(UUR)基因交界处，对mtDNA3243位点A/G突变的研究发现A碱基位于tR NALeu (UUR) 二级结构的双氢尿嗜陡环上，在进化中高度保守。该位点的突变可能会使tRNALw(UUR)正常的立体结构发生改变，从而影响到多肽链合成中亮氨酸的掺入。
[0003]目前常用的突变检测方法主要有PCR-RFLP、PCR-SSCP, PCR-测序等，但是这些方法的检测灵敏度较低，并且对于突变率〈5%的杂合突变一般无法检出。由于应用上的需求，目前急需开发一种新的用于定量检测杂合突变的方法及检测用试剂盒。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是针对目前缺少定量检测线粒体A3243G杂合突变率的检测标准品以及现有的对于A3243G突变的检测方法不够灵敏的现状，提供一种灵敏度更高的A3243G突变检测方法和在定量检测中使用的标准品及其试剂盒。
[0005]本发明解决上述技术问题的技术方案之一为:一种检测线粒体A3243G杂合突变率的标准品，包括:
[0006](I)含有3243位点为野生型A的线粒体DNA片段的载体；和
[0007](2)含有3243位点为突变型G的线粒体DNA片段的载体。
[0008]本发明中，所述的3243位点是指人线粒体基因组DNA的第3243位核苷酸。在正常人的线粒体基因组DNA中，mt3243位点为A，病人mtDNA中常常会突变为G。
[0009]本发明中，所述的含3243位点的线粒体DNA片段是指包括了 3243位点的线粒体基因组DNA片段。优选的，所述的3243位点为野生型A的线粒体DNA片段长度为50-1OOObp，更优选53bp ；3243位点为突变型G的线粒体DNA片段长度为50_1000bp，更优选53bp。最优选的，所述的3243位点为野生型A的线粒体DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，3243位点为突变型G的线粒体DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0010]本发明中，所述的载体可以是任何常规载体，如质粒、粘粒(pHZ132)、噬菌体或病毒载体(反转录病毒载体，腺病毒载体)等。优选的，所述的载体是质粒。更优选的，所述的载体是T-载体。更佳的是能够在大肠杆菌中增殖的克隆载体，如pUC19，pUC18，pUC118，pUC119，pUC19，pBlueScriptll SK或pGEM系列载体。最优选的，所述的载体是pGEM_T载体。
[0011]本发明中，优选的，所述的含3243位点为野生型A的线粒体DNA片段的载体和含3243位点为突变型G的线粒体DNA片段的载体组成混合物。优选的，所述的混合物中含有3243位点为突变型G的线粒体DNA片段的载体的含量占载体总量的O-100%中的任一浓度，含有3243位点为野生型A的线粒体DNA片段的载体的含量为余量，所述的混合物之间形成一系列载体浓度比例梯度。更优选的，所述的混合物中含有3243位点为突变型G的线粒体DNA片段的载体的含量分别占载体总量2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%，含有3243位点为野生型A的线粒体DNA片段的载体的含量为余量。
[0012]进一步优选的，所述的混合物中还包括溶解载体的介质，所述的介质是任何可以溶解载体的溶剂，较佳的包括水、TE、PBS或者生理盐水。更优选的，所述的混合物中，所述的载体在介质中的浓度为各种可用的浓度，可以是Ing/ μ L-1OOng/ μ L,优选50ng/ μ L。
[0013]本发明解决上述技术问题的技术方案之二为:一种检测线粒体A3243G杂合突变率的试剂盒，包括所述的检测线粒体A3243G杂合突变率的标准品。
[0014]其中，所述的标准品如上所述。
[0015]优选的，所述试剂盒中还包括扩增含3243位点的线粒体DNA片段的扩增引物和用于检测含3243位点的线粒体DNA片段的焦磷酸测序引物中的一种或两种。所述的扩增引物是长度为25±15nt的寡核苷酸链，其与线粒体基因组DNA片段完全相同或互补，所述的扩增引物只要是能够扩增含3243位点的线粒体DNA片段即可。较佳的，所述的扩增引物的核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示。所述的焦磷酸测序引物与线粒体基因组DNA片段序列完全相同，只需位于3243位点上游即可，优选SEQ ID N0.5所示的引物。
[0016]优选的，所述试剂盒中还包括DNA提取试剂和/或TE缓冲液。
[0017]优选的，所述试剂盒中还包括说明书。该说明书记载了该试剂盒的使用方法，即定量检测线粒体A3243G杂合突变率的方法，该方法包括以下步骤:
[0018]I)以上述不同百分比的标准品为模板，采用扩增引物扩增含3243位点的线粒体DNA片段；
[0019]2)对步骤I)所得的PCR产物进行焦磷酸测序；
[0020]3)根据步骤2)中焦磷酸测序的结果拟定用于数据校正的回归方程；
[0021]4)从待检样本中提取DNA;
[0022]5)以步骤4)所得的DNA为模板，采用扩增引物扩增含3243位点的线粒体DNA片段；
[0023]6)对步骤5)所得的PCR产物进行焦磷酸测序；
[0024]7)对步骤6)所得的测序结果应用步骤3)所得的回归方程进行数据校正，即得待检样本的线粒体A3243G杂合突变率。
[0025]本发明中，所述的焦磷酸测序是本领域常规的焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术，该技术无须进行电泳，DNA片段也无须进行荧光标记，操作极为简便。焦磷酸测序技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)。PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息，在峰值图上显示的峰值高度可以检测出混合DNA模板中等位基因的频率。但是本发明发现，焦磷酸测序的结果和实际值会有一定的偏差，这种偏差和测序方法的最佳测定范围有关，在杂合度为50%左右，检测值和实际值基本相同，但是在杂合度越低或者越高的区域，检测值和实际值的偏差越大；这种偏差和测序仪的运行环境和运行参数的设置也有关，在不同的测序仪上，这些偏差的程度有些微的区别。这些偏差的存在对于实际检测的样本而言，在结果分析和应用上都会产生不良影响，有必要克服这些偏差，得到和实际值接近的检测结果。因此，本发明人对焦磷酸测序的检测值采用本发明的标准品进行了数据校正，获得了校正所采用的数据分析回归方程，从而使样本的检测值经过校正之后更接近于实际值，有利于结果的进一步精确分析和应用。
[0026]本发明解决上述技术问题的技术方案之三为:一种所述的检测线粒体A3243G杂合突变率的标准品的制备方法，包括如下步骤:
[0027]I)分别从确认为A3243G突变的样本中和非突变的正常样本中提取DNA ；
[0028]2)采用扩增引物对步骤I)所得的DNA分别进行PCR扩增，扩增产物中包括了线粒体DNA的3243位点；
[0029]3)将步骤2)所得PCR产物分别装入载体中并进行测序验证，从而得到野生型载体和突变型载体；
[0030]4)按照野生型和突变型载体的不同比例来制备各浓度系列的标准品。
[0031]其中，步骤I)从样本中提取DNA的方法是常规方法。比如从病人的外周血样本中提取DNA，采用基因组DNA提取方法即可提取完整的线粒体DNA。
[0032]步骤2)所述的扩增引物是长度为25±15nt的寡核苷酸链，其与线粒体基因组DNA片段完全相同或互补，所述的扩增引物只要是能够扩增含3243位点的线粒体DNA片段即可。较佳的，所述扩增引物的核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示。步骤2)所述PCR扩增的程序为常规，只要能够特异性扩增得到相应的片段即可，较佳的为:① 94°C，5min ;d)94°C，20s ；?55oC,20s ；?72°C,20s ;步骤②至④的循环数为 40 ；⑤ 72。。，IOmin。
[0033]步骤3)所述的将PCR产物装入载体的方法是本领域的常规方法，一般用限制性内切酶分别酶切PCR产物和载体，然后用连接酶连接即可。所述的载体是本领域可以采用的各种用于装载外源核酸片段的载体，如质粒、粘粒(PHZ132)、噬菌体或病毒载体(反转录病毒载体，腺病毒载体)等。优选的，所述的载体是质粒。更优选的，所述的载体是T-载体。更佳的是能够在大肠杆菌中增殖的克隆载体，如口此19、？此18，？此118，？此119，？此19，pBlueScript II SK或pGEM系列载体。最优选的，所述的载体是pGEM_T载体，测序的方法也是本领域的常规方法，可以采用PCR扩增引物中的任一条进行测序。
[0034]步骤4)将两种载体混合成各个浓度系列的标准品，较佳的包括将两种载体分别定量至一定的浓度，然后按比例混合即可。较佳的如将两种载体分别定量至IO-1OOng/μ L，然后按比例混合，制备各浓度标准品。所述的浓度是指3243位点为G的突变型载体占全部载体(3243位点为G的突变型和3243位点为A的野生型载体的总和)总量的百分比浓度。
[0035]本发明解决上述技术问题的技术方案之四为:一种定量检测线粒体A3243G杂合突变率的方法，包括如下步骤:
[0036]I)以上述不同百分比的标准品为模板，采用扩增引物扩增含3243位点的线粒体DNA片段；
[0037]2)对步骤I)所得的PCR产物进行焦磷酸测序；
[0038]3)根据步骤2)中焦磷酸测序的结果拟定用于数据校正的回归方程；
[0039]4)从待检样本中提取DNA;
[0040]5)以步骤4)所得的DNA为模板，采用引物PCR扩增含3243位点的线粒体DNA片段；
[0041]6)对步骤5)所得的PCR产物进行焦磷酸测序；
[0042]7)测序结果应用步骤3)所得的回归方程进行数据校正，即得待检样本的线粒体A3243G杂合突变率。
[0043]其中，步骤4)所述从待检样本中提取DNA的方法是常规方法。比如从病人的外周血样本中提取DNA，采用基因组提取方法即可提取完整的线粒体DNA。
[0044]步骤I)或5)所述扩增的方法同常规。所述的扩增引物是长度为25±15nt的寡核苷酸链，其与线粒体基因组DNA片段完全相同或互补，所述的扩增引物只要是能够扩增含3243位点的线粒体DNA片段即可。较佳的，所述的扩增引物的核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示。所述PCR扩增的条件为常规，只要能够特异性扩增得到扩增片段即可，较佳的为:①94°C，5min ;d)94°C，20s ；?55oC,20s ；?72°C,20s ;步骤②至④的循环数为40 72°C，lOmin。
[0045]步骤2)或6)所述焦磷酸测序的方法也是本领域的常规方法，可以采用如SEQ IDN0.5所示的焦磷酸测序引物进行测序。
[0046]步骤7)所述数据校正是对待测样本的焦磷酸测序结果采用所述的回归方程进行数值校正，从而得出最终的计算结果；该校正方程优选为Y=-0.0000737578382X3+0.01054497865X2+0.71548332X-0.63357639446。
[0047]本发明的有益效果:本发明提供的线粒体A3243G杂合突变率的检测方法灵敏度高，定量准确，更可以检测出其他常规检测方法无法检测的突变率低于5%的杂合突变，具有极大的应用价值和理论意义，也为科研和生产实践中其他的突变检测提供了很好的启
/Jn ο【专利附图】
【附图说明】[0048]以下结合【专利附图】
【附图说明】本发明的特征和有益效果。[0049]图1为0%标准品的焦磷酸测序结果图；[0050]图2为2%标准品的焦磷酸测序结果图；[0051]图3为5%标准品的焦磷酸测序结果图；[0052]图4为10%标准品的焦磷酸测序结果图；[0053]图5为20%标准品的焦磷酸测序结果图；[0054]图6为30%标准品的焦磷酸测序结果图；[0055]图7为40%标准品的焦磷酸测序结果图；[0056]图8为50%标准品的焦磷酸测序结果图；[0057]图9为60%标准品的焦磷酸测序结果图；
[0058]图10为70%标准品的焦磷酸测序结果图
[0059]图11为80%标准品的焦磷酸测序结果图
[0060]图12为90%标准品的焦磷酸测序结果图
[0061]图13为95%标准品的焦磷酸测序结果图
[0062]图14为100%标准品的焦磷酸测序结果图；
[0063]图15为利用软件校正后的结果和回归方程；
[0064]图16为阴性检测样本F932-4的焦磷酸测序结果图；
[0065]图17为阳性检测样本F1096-8的焦磷酸测序结果图；
[0066]图18为弱阳性检测样本F625-5的焦磷酸测序结果图。 【具体实施方式】
[0067]下面结合实施例对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件进行。
[0068]实施例1标准品的制备
[0069]1、分别从确认为A3243G突变的病人和非突变的正常人外周血中提取DNA，采用QIAGEN公司的外周血DNA提取试剂盒进行提取。
[0070]2、采用扩增引物进行PCR扩增，扩增产物中包括了 A3243G突变所在的位点；
[0071]引物序列分别为:
[0072]MT3243-F (序列表中 SEQ ID N0.3):
[0073]5， -AGAACAGGGTTTGTTAAGATGGC-3，；
[0074]MT3243-R (序列表中 SEQ ID N0.4):
[0075]5’ -GTTTTAAGTTTTATGCGATTACCG-3’
[0076]弓丨物MT3243-R的5’采用了生物素标记。
[0077]PCR的扩增程序为:
[0078]①94°C，5min ;@94°C，20s ;@55°C，20s ;@72°C，20s ;步骤②至④的循环数为40 ；? 72°C, IOmin0
[0079]3、将PCR产物分别装入pGEM-T载体中，由于PCR产物末端均带有一个突出的A，而pGEM-T载体带有一个突出的T，因此PCR产物无需经过酶切即可直接与pGEM-T载体进行粘性末端连接。
[0080]4、采用常规测序方法验证装入载体中的3243位点序列，分别取野生型和突变型的载体作为0%和100%的标准品；
[0081]I)扩增正常人的外周血样本获得的PCR产物全序列为序列表中SEQ IDN0.1所示。含有该序列的载体命名为MT3243-0。
[0082]2)扩增突变病人的外周血样本获得的PCR产物全序列为序列表中SEQID N0.2所示。含有该序列的载体命名为MT3243-100。
[0083]5、将上述两种载体纯化后分别用TE进行稀释，并定量到50ng/ μ L。
[0084]6、按照一定的比例混合MT3243-0和MT3243-100两种载体，分别制备2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%的标准品；配制各浓度标准品所使用的MT3243-0和MT3243-100载体用量如下表所示:
[0085]
【权利要求】
1.一种检测线粒体A3243G杂合突变率的标准品，其特征在于，包括:(1)含有3243位点为野生型A的线粒体DNA片段的载体；和(2)含有3243位点为突变型G的线粒体DNA片段的载体。
2.如权利要求1所述的标准品，其特征在于，所述的3243位点为野生型A的线粒体DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述的3243位点为突变型G的线粒体DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
3.如权利要求1所述的标准品，其特征在于，所述的载体是质粒。
4.如权利要求1所述的标准品，其特征在于，所述的含有3243位点为野生型A的线粒体DNA片段的载体和含有3243位点为突变型G的线粒体DNA片段的载体组成混合物；所述的混合物中含有3243位点为突变型G的线粒体DNA片段的载体的含量占载体总量的O-100%中的任一浓度，含有3243位点为野生型A的线粒体DNA片段的载体的含量为余量，所述的混合物之间形成一系列载体浓度比例梯度。
5.如权利要求4所述的标准品，其特征在于，所述的混合物中还包括溶解载体的介质。
6.一种检测线粒体A3243G杂合突变率的试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求f 5任一项所述的检测线粒体A3243G杂合突变率的标准品。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括扩增含3243位点的线粒体DNA片段的扩增引物、含3243位点的线粒体DNA片段的焦磷酸测序引物、DNA提取试剂、TE缓冲液和说明书中的任何一种或多种。
8.—种如权利要求1所述的检测线粒体A3243G杂合突变率的标准品的制备方法，其特征在于，包括如下步骤:O分别从确认为A3243G突变的样本中和非突变的正常样本中提取DNA ；2)采用扩增引物对步骤I)所得的DNA分别进行PCR扩增，扩增产物中包括了线粒体DNA的3243位点；3)将步骤2)所得的PCR产物分别装入载体中并进行测序验证，从而得到野生型载体和突变型载体；4)按照野生型和突变型载体的不同比例来制备各浓度系列的标准品。
9.一种定量检测线粒体A3243G杂合突变率的方法，其特征在于，包括如下步骤:1)以权利要求4-5任一项所述的标准品为模板，采用扩增引物扩增含3243位点的线粒体DNA片段；2)对步骤I)所得的PCR产物进行焦磷酸测序；3)根据步骤2)中焦磷酸测序的结果拟定用于数据校正的回归方程；4)从待检样本中提取DNA;5)以步骤4)所得的DNA为模板，采用扩增引物扩增含3243位点的线粒体DNA片段；6)对步骤5)所得的PCR产物进行焦磷酸测序；7)测序结果应用步骤3)所得的回归方程进行数据校正，即得待检样本的线粒体A3243G杂合突变率。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤I)或5)所述扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示；所述PCR扩增的程序为:①94°C，5min ;②94°C，20s ;@55°C，20s ;@72°C，20s ;步骤②至④的循环数为40 ;?72°C，IOmin ;所述的回归方程为Y=0.000073757382X3+0.01054497865X2+0.71548332X-0.63357639446。
【文档编号】C12Q1/68GK103451268SQ201210178055
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2012年5月31日 优先权日:2012年5月31日
【发明者】曾溢滔, 颜景斌, 曾凡一, 方彧聃 申请人:上海市儿童医院, 上海凡翼生物科技有限公司
【专利摘要】本发明公开了一种检测线粒体A3243G杂合突变率的标准品、试剂盒及其检测方法。本发明所述检测线粒体A3243G杂合突变率的标准品，包括：（1）含有3243位点为野生型A的线粒体DNA片段的载体；（2）含有3243位点为突变型G的线粒体DNA片段的载体。本发明提供的质粒分子标准品、检测方法及用于检测数据校正的回归方程能够很方便、精确地检测线粒体DNA中的A3243G杂合突变率，具有高效、灵敏的优点，而且对于突变率低于5%的杂合突变也可以精确、定量地检出，这是现有的其他突变检测手段所不具备的独特优点。本发明也为科研和生产实践上其他的杂合突变定量检测提供了很好的借鉴意义。
【专利说明】一种检测线粒体A3243G杂合突变率的标准品、试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医学工程领域，具体涉及一种检测线粒体A3243G杂合突变率的标准品、试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002]A3243G突变是线粒体基因组DNA(mito-chondrial DNA, mtDNA)上最常见的致病突变，其常以杂合形式存在，即在一个细胞中既存在野生型的mtDNA，也存在突变型的mtDNA。A3243G突变是早发性糖尿病及神经性耳聋等疾病的致病因素之一，A3243G突变率与其引起临床症状的轻重程度相关。因此，对于A3243G突变的准确定量检测具有非常重要的意义。mtDNA3243位点处于16S rRNA与tRNALeu(UUR)基因交界处，对mtDNA3243位点A/G突变的研究发现A碱基位于tR NALeu (UUR) 二级结构的双氢尿嗜陡环上，在进化中高度保守。该位点的突变可能会使tRNALw(UUR)正常的立体结构发生改变，从而影响到多肽链合成中亮氨酸的掺入。
[0003]目前常用的突变检测方法主要有PCR-RFLP、PCR-SSCP, PCR-测序等，但是这些方法的检测灵敏度较低，并且对于突变率〈5%的杂合突变一般无法检出。由于应用上的需求，目前急需开发一种新的用于定量检测杂合突变的方法及检测用试剂盒。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是针对目前缺少定量检测线粒体A3243G杂合突变率的检测标准品以及现有的对于A3243G突变的检测方法不够灵敏的现状，提供一种灵敏度更高的A3243G突变检测方法和在定量检测中使用的标准品及其试剂盒。
[0005]本发明解决上述技术问题的技术方案之一为:一种检测线粒体A3243G杂合突变率的标准品，包括:
[0006](I)含有3243位点为野生型A的线粒体DNA片段的载体；和
[0007](2)含有3243位点为突变型G的线粒体DNA片段的载体。
[0008]本发明中，所述的3243位点是指人线粒体基因组DNA的第3243位核苷酸。在正常人的线粒体基因组DNA中，mt3243位点为A，病人mtDNA中常常会突变为G。
[0009]本发明中，所述的含3243位点的线粒体DNA片段是指包括了 3243位点的线粒体基因组DNA片段。优选的，所述的3243位点为野生型A的线粒体DNA片段长度为50-1OOObp，更优选53bp ；3243位点为突变型G的线粒体DNA片段长度为50_1000bp，更优选53bp。最优选的，所述的3243位点为野生型A的线粒体DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，3243位点为突变型G的线粒体DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0010]本发明中，所述的载体可以是任何常规载体，如质粒、粘粒(pHZ132)、噬菌体或病毒载体(反转录病毒载体，腺病毒载体)等。优选的，所述的载体是质粒。更优选的，所述的载体是T-载体。更佳的是能够在大肠杆菌中增殖的克隆载体，如pUC19，pUC18，pUC118，pUC119，pUC19，pBlueScriptll SK或pGEM系列载体。最优选的，所述的载体是pGEM_T载体。
[0011]本发明中，优选的，所述的含3243位点为野生型A的线粒体DNA片段的载体和含3243位点为突变型G的线粒体DNA片段的载体组成混合物。优选的，所述的混合物中含有3243位点为突变型G的线粒体DNA片段的载体的含量占载体总量的O-100%中的任一浓度，含有3243位点为野生型A的线粒体DNA片段的载体的含量为余量，所述的混合物之间形成一系列载体浓度比例梯度。更优选的，所述的混合物中含有3243位点为突变型G的线粒体DNA片段的载体的含量分别占载体总量2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%，含有3243位点为野生型A的线粒体DNA片段的载体的含量为余量。
[0012]进一步优选的，所述的混合物中还包括溶解载体的介质，所述的介质是任何可以溶解载体的溶剂，较佳的包括水、TE、PBS或者生理盐水。更优选的，所述的混合物中，所述的载体在介质中的浓度为各种可用的浓度，可以是Ing/ μ L-1OOng/ μ L,优选50ng/ μ L。
[0013]本发明解决上述技术问题的技术方案之二为:一种检测线粒体A3243G杂合突变率的试剂盒，包括所述的检测线粒体A3243G杂合突变率的标准品。
[0014]其中，所述的标准品如上所述。
[0015]优选的，所述试剂盒中还包括扩增含3243位点的线粒体DNA片段的扩增引物和用于检测含3243位点的线粒体DNA片段的焦磷酸测序引物中的一种或两种。所述的扩增引物是长度为25±15nt的寡核苷酸链，其与线粒体基因组DNA片段完全相同或互补，所述的扩增引物只要是能够扩增含3243位点的线粒体DNA片段即可。较佳的，所述的扩增引物的核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示。所述的焦磷酸测序引物与线粒体基因组DNA片段序列完全相同，只需位于3243位点上游即可，优选SEQ ID N0.5所示的引物。
[0016]优选的，所述试剂盒中还包括DNA提取试剂和/或TE缓冲液。
[0017]优选的，所述试剂盒中还包括说明书。该说明书记载了该试剂盒的使用方法，即定量检测线粒体A3243G杂合突变率的方法，该方法包括以下步骤:
[0018]I)以上述不同百分比的标准品为模板，采用扩增引物扩增含3243位点的线粒体DNA片段；
[0019]2)对步骤I)所得的PCR产物进行焦磷酸测序；
[0020]3)根据步骤2)中焦磷酸测序的结果拟定用于数据校正的回归方程；
[0021]4)从待检样本中提取DNA;
[0022]5)以步骤4)所得的DNA为模板，采用扩增引物扩增含3243位点的线粒体DNA片段；
[0023]6)对步骤5)所得的PCR产物进行焦磷酸测序；
[0024]7)对步骤6)所得的测序结果应用步骤3)所得的回归方程进行数据校正，即得待检样本的线粒体A3243G杂合突变率。
[0025]本发明中，所述的焦磷酸测序是本领域常规的焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术，该技术无须进行电泳，DNA片段也无须进行荧光标记，操作极为简便。焦磷酸测序技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)。PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息，在峰值图上显示的峰值高度可以检测出混合DNA模板中等位基因的频率。但是本发明发现，焦磷酸测序的结果和实际值会有一定的偏差，这种偏差和测序方法的最佳测定范围有关，在杂合度为50%左右，检测值和实际值基本相同，但是在杂合度越低或者越高的区域，检测值和实际值的偏差越大；这种偏差和测序仪的运行环境和运行参数的设置也有关，在不同的测序仪上，这些偏差的程度有些微的区别。这些偏差的存在对于实际检测的样本而言，在结果分析和应用上都会产生不良影响，有必要克服这些偏差，得到和实际值接近的检测结果。因此，本发明人对焦磷酸测序的检测值采用本发明的标准品进行了数据校正，获得了校正所采用的数据分析回归方程，从而使样本的检测值经过校正之后更接近于实际值，有利于结果的进一步精确分析和应用。
[0026]本发明解决上述技术问题的技术方案之三为:一种所述的检测线粒体A3243G杂合突变率的标准品的制备方法，包括如下步骤:
[0027]I)分别从确认为A3243G突变的样本中和非突变的正常样本中提取DNA ；
[0028]2)采用扩增引物对步骤I)所得的DNA分别进行PCR扩增，扩增产物中包括了线粒体DNA的3243位点；
[0029]3)将步骤2)所得PCR产物分别装入载体中并进行测序验证，从而得到野生型载体和突变型载体；
[0030]4)按照野生型和突变型载体的不同比例来制备各浓度系列的标准品。
[0031]其中，步骤I)从样本中提取DNA的方法是常规方法。比如从病人的外周血样本中提取DNA，采用基因组DNA提取方法即可提取完整的线粒体DNA。
[0032]步骤2)所述的扩增引物是长度为25±15nt的寡核苷酸链，其与线粒体基因组DNA片段完全相同或互补，所述的扩增引物只要是能够扩增含3243位点的线粒体DNA片段即可。较佳的，所述扩增引物的核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示。步骤2)所述PCR扩增的程序为常规，只要能够特异性扩增得到相应的片段即可，较佳的为:① 94°C，5min ;d)94°C，20s ；?55oC,20s ；?72°C,20s ;步骤②至④的循环数为 40 ；⑤ 72。。，IOmin。
[0033]步骤3)所述的将PCR产物装入载体的方法是本领域的常规方法，一般用限制性内切酶分别酶切PCR产物和载体，然后用连接酶连接即可。所述的载体是本领域可以采用的各种用于装载外源核酸片段的载体，如质粒、粘粒(PHZ132)、噬菌体或病毒载体(反转录病毒载体，腺病毒载体)等。优选的，所述的载体是质粒。更优选的，所述的载体是T-载体。更佳的是能够在大肠杆菌中增殖的克隆载体，如口此19、？此18，？此118，？此119，？此19，pBlueScript II SK或pGEM系列载体。最优选的，所述的载体是pGEM_T载体，测序的方法也是本领域的常规方法，可以采用PCR扩增引物中的任一条进行测序。
[0034]步骤4)将两种载体混合成各个浓度系列的标准品，较佳的包括将两种载体分别定量至一定的浓度，然后按比例混合即可。较佳的如将两种载体分别定量至IO-1OOng/μ L，然后按比例混合，制备各浓度标准品。所述的浓度是指3243位点为G的突变型载体占全部载体(3243位点为G的突变型和3243位点为A的野生型载体的总和)总量的百分比浓度。
[0035]本发明解决上述技术问题的技术方案之四为:一种定量检测线粒体A3243G杂合突变率的方法，包括如下步骤:
[0036]I)以上述不同百分比的标准品为模板，采用扩增引物扩增含3243位点的线粒体DNA片段；
[0037]2)对步骤I)所得的PCR产物进行焦磷酸测序；
[0038]3)根据步骤2)中焦磷酸测序的结果拟定用于数据校正的回归方程；
[0039]4)从待检样本中提取DNA;
[0040]5)以步骤4)所得的DNA为模板，采用引物PCR扩增含3243位点的线粒体DNA片段；
[0041]6)对步骤5)所得的PCR产物进行焦磷酸测序；
[0042]7)测序结果应用步骤3)所得的回归方程进行数据校正，即得待检样本的线粒体A3243G杂合突变率。
[0043]其中，步骤4)所述从待检样本中提取DNA的方法是常规方法。比如从病人的外周血样本中提取DNA，采用基因组提取方法即可提取完整的线粒体DNA。
[0044]步骤I)或5)所述扩增的方法同常规。所述的扩增引物是长度为25±15nt的寡核苷酸链，其与线粒体基因组DNA片段完全相同或互补，所述的扩增引物只要是能够扩增含3243位点的线粒体DNA片段即可。较佳的，所述的扩增引物的核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示。所述PCR扩增的条件为常规，只要能够特异性扩增得到扩增片段即可，较佳的为:①94°C，5min ;d)94°C，20s ；?55oC,20s ；?72°C,20s ;步骤②至④的循环数为40 72°C，lOmin。
[0045]步骤2)或6)所述焦磷酸测序的方法也是本领域的常规方法，可以采用如SEQ IDN0.5所示的焦磷酸测序引物进行测序。
[0046]步骤7)所述数据校正是对待测样本的焦磷酸测序结果采用所述的回归方程进行数值校正，从而得出最终的计算结果；该校正方程优选为Y=-0.0000737578382X3+0.01054497865X2+0.71548332X-0.63357639446。
[0047]本发明的有益效果:本发明提供的线粒体A3243G杂合突变率的检测方法灵敏度高，定量准确，更可以检测出其他常规检测方法无法检测的突变率低于5%的杂合突变，具有极大的应用价值和理论意义，也为科研和生产实践中其他的突变检测提供了很好的启
/Jn ο【专利附图】
【附图说明】[0048]以下结合【专利附图】
【附图说明】本发明的特征和有益效果。[0049]图1为0%标准品的焦磷酸测序结果图；[0050]图2为2%标准品的焦磷酸测序结果图；[0051]图3为5%标准品的焦磷酸测序结果图；[0052]图4为10%标准品的焦磷酸测序结果图；[0053]图5为20%标准品的焦磷酸测序结果图；[0054]图6为30%标准品的焦磷酸测序结果图；[0055]图7为40%标准品的焦磷酸测序结果图；[0056]图8为50%标准品的焦磷酸测序结果图；[0057]图9为60%标准品的焦磷酸测序结果图；
[0058]图10为70%标准品的焦磷酸测序结果图
[0059]图11为80%标准品的焦磷酸测序结果图
[0060]图12为90%标准品的焦磷酸测序结果图
[0061]图13为95%标准品的焦磷酸测序结果图
[0062]图14为100%标准品的焦磷酸测序结果图；
[0063]图15为利用软件校正后的结果和回归方程；
[0064]图16为阴性检测样本F932-4的焦磷酸测序结果图；
[0065]图17为阳性检测样本F1096-8的焦磷酸测序结果图；
[0066]图18为弱阳性检测样本F625-5的焦磷酸测序结果图。 【具体实施方式】
[0067]下面结合实施例对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件进行。
[0068]实施例1标准品的制备
[0069]1、分别从确认为A3243G突变的病人和非突变的正常人外周血中提取DNA，采用QIAGEN公司的外周血DNA提取试剂盒进行提取。
[0070]2、采用扩增引物进行PCR扩增，扩增产物中包括了 A3243G突变所在的位点；
[0071]引物序列分别为:
[0072]MT3243-F (序列表中 SEQ ID N0.3):
[0073]5， -AGAACAGGGTTTGTTAAGATGGC-3，；
[0074]MT3243-R (序列表中 SEQ ID N0.4):
[0075]5’ -GTTTTAAGTTTTATGCGATTACCG-3’
[0076]弓丨物MT3243-R的5’采用了生物素标记。
[0077]PCR的扩增程序为:
[0078]①94°C，5min ;@94°C，20s ;@55°C，20s ;@72°C，20s ;步骤②至④的循环数为40 ；? 72°C, IOmin0
[0079]3、将PCR产物分别装入pGEM-T载体中，由于PCR产物末端均带有一个突出的A，而pGEM-T载体带有一个突出的T，因此PCR产物无需经过酶切即可直接与pGEM-T载体进行粘性末端连接。
[0080]4、采用常规测序方法验证装入载体中的3243位点序列，分别取野生型和突变型的载体作为0%和100%的标准品；
[0081]I)扩增正常人的外周血样本获得的PCR产物全序列为序列表中SEQ IDN0.1所示。含有该序列的载体命名为MT3243-0。
[0082]2)扩增突变病人的外周血样本获得的PCR产物全序列为序列表中SEQID N0.2所示。含有该序列的载体命名为MT3243-100。
[0083]5、将上述两种载体纯化后分别用TE进行稀释，并定量到50ng/ μ L。
[0084]6、按照一定的比例混合MT3243-0和MT3243-100两种载体，分别制备2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%的标准品；配制各浓度标准品所使用的MT3243-0和MT3243-100载体用量如下表所示:
[0085]
【权利要求】
1.一种检测线粒体A3243G杂合突变率的标准品，其特征在于，包括:(1)含有3243位点为野生型A的线粒体DNA片段的载体；和(2)含有3243位点为突变型G的线粒体DNA片段的载体。
2.如权利要求1所述的标准品，其特征在于，所述的3243位点为野生型A的线粒体DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述的3243位点为突变型G的线粒体DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
3.如权利要求1所述的标准品，其特征在于，所述的载体是质粒。
4.如权利要求1所述的标准品，其特征在于，所述的含有3243位点为野生型A的线粒体DNA片段的载体和含有3243位点为突变型G的线粒体DNA片段的载体组成混合物；所述的混合物中含有3243位点为突变型G的线粒体DNA片段的载体的含量占载体总量的O-100%中的任一浓度，含有3243位点为野生型A的线粒体DNA片段的载体的含量为余量，所述的混合物之间形成一系列载体浓度比例梯度。
5.如权利要求4所述的标准品，其特征在于，所述的混合物中还包括溶解载体的介质。
6.一种检测线粒体A3243G杂合突变率的试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求f 5任一项所述的检测线粒体A3243G杂合突变率的标准品。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括扩增含3243位点的线粒体DNA片段的扩增引物、含3243位点的线粒体DNA片段的焦磷酸测序引物、DNA提取试剂、TE缓冲液和说明书中的任何一种或多种。
8.—种如权利要求1所述的检测线粒体A3243G杂合突变率的标准品的制备方法，其特征在于，包括如下步骤:O分别从确认为A3243G突变的样本中和非突变的正常样本中提取DNA ；2)采用扩增引物对步骤I)所得的DNA分别进行PCR扩增，扩增产物中包括了线粒体DNA的3243位点；3)将步骤2)所得的PCR产物分别装入载体中并进行测序验证，从而得到野生型载体和突变型载体；4)按照野生型和突变型载体的不同比例来制备各浓度系列的标准品。
9.一种定量检测线粒体A3243G杂合突变率的方法，其特征在于，包括如下步骤:1)以权利要求4-5任一项所述的标准品为模板，采用扩增引物扩增含3243位点的线粒体DNA片段；2)对步骤I)所得的PCR产物进行焦磷酸测序；3)根据步骤2)中焦磷酸测序的结果拟定用于数据校正的回归方程；4)从待检样本中提取DNA;5)以步骤4)所得的DNA为模板，采用扩增引物扩增含3243位点的线粒体DNA片段；6)对步骤5)所得的PCR产物进行焦磷酸测序；7)测序结果应用步骤3)所得的回归方程进行数据校正，即得待检样本的线粒体A3243G杂合突变率。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤I)或5)所述扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示；所述PCR扩增的程序为:①94°C，5min ;②94°C，20s ;@55°C，20s ;@72°C，20s ;步骤②至④的循环数为40 ;?72°C，IOmin ;所述的回归方程为Y=0.000073757382X3+0.01054497865X2+0.71548332X-0.63357639446。
【文档编号】C12Q1/68GK103451268SQ201210178055
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2012年5月31日 优先权日:2012年5月31日
【发明者】曾溢滔, 颜景斌, 曾凡一, 方彧聃 申请人:上海市儿童医院, 上海凡翼生物科技有限公司
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