专利名称：一种β-1,3-1,4-葡聚糖酶及其编码基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种P -I, 3-1，4-葡聚糖酶及其编码基因，属于酶基因工程和酶工程领域。
背景技术：
中国是世界第一大啤酒生产国，2011年啤酒产量达到4900万千升，年需求啤酒大麦350万吨，并以每年10%的速度递增。由于我国啤酒大麦质量不高，每年平均进口啤酒大麦100万吨，约占世界啤酒大麦总贸易量的30%左右，耗外汇3. 5亿美元。啤酒大麦绝大部分靠进口的局面，使我国啤酒行业的效益直接受到国际大麦行情的制约，影响到我国啤酒工业的持续发展。因此，啤酒大麦的国产化战略受到高度重视。发展我国啤酒大麦的生产，一方面需要依靠农业科技的进步，走品种改良引进、高产优质栽培之路，另一方面，就是要变革制麦工艺、酿造工艺，实现低等国产大麦的充分利用，调动农民种植积极性。糖化过程中添加能够水解大麦￠-葡聚糖的￠-1, 3-1，4-葡聚糖酶，大大降低了糖化过程中的能耗、提高麦汁得率、改善成品啤酒的品质，使得啤酒厂能够以国产麦芽部分或全部替代进口大麦。我国年产啤酒大麦约为200万吨，目前仅有30%用于酿造工业，如果该三功能酶制剂得到普遍推广，预计可以实现70 %的分流，其社会意义十分重大。目前国内也有部分酶制剂公司生产￠-1, 3-1，4-葡聚糖酶，但其水平远不及国外酶制剂公司，且酶制剂的生产菌种及工艺都是商业机密，国内研发速率缓慢，所以国内市场在很大程度上依然依赖进口。随着中国啤酒工业的大幅度发展，开发活力高、价格低的国产酶制剂十分必要。工业化产品可以填补国产高效廉价0 -I, 3-1，4-葡聚糖酶的空白，为我国酿造用酶制剂的发展做出了新表率，对于将该酶种大量应用在啤酒酿造工业上有重大的意义。目前诺维信公司生产的复合酶价格在198-380元/公斤左右，由于价格太高，啤酒厂根本无法采用。如果价格能够下降到啤酒厂能够接受的水平，即100元/公斤左右，则国内啤酒厂可以大幅度推广使用该产品。根据测算，国内啤酒企业的需求量在1500吨左右，随着国产大麦麦芽使用量的进一步增大，该酶用量还会进一步提高，市场潜力在I. 5亿元/年。同时，该酶制剂还是良好的饲料添加用酶。目前￠-1,3-1，4-葡聚糖酶制剂大多使用真菌发酵生产，细菌来源的较少。筛选能够产生大量￠-1, 3-1，4-葡聚糖酶的细菌也具有积极意义。但野生菌产量较多，是因为其胞外蛋白酶系较为丰富，抑制了 P -I, 3-1，4-葡聚糖酶的合成，将此酶基因单独表达，并进行基因以及酶学性质方面的研究，为P -I, 3-1，4-葡聚糖酶的规模化生产及推广具有深远的技术指导意义。
发明内容
本发明要解决的一技术问题是提供一种水解大麦P -葡聚糖的P -I, 3-1，4-葡聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示。本发明要解决的另一个技术问题是提供一种编码的P -I, 3-1，4-葡聚糖酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。此外，本发明还提供了一种生产的P -I, 3-1，4-葡聚糖酶的方法，具体包括如下步骤首先采用化学全合成或PCR方法获得SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列；克隆获得的核苷酸序列到pET28a(+)表达载体；然后将获得的表达载体转化E. coli BL21获得表达的^ -I, 3-1，4-葡聚糖酶的基因工程菌；最后通过优化发酵工艺，将获得的基因工程菌在LB培养基中37°C液体培养过夜，后接入TB发酵液体培养基37°C培养2h后用4mg/L IPTG及终浓为lOmmol/L乳糖诱导，降温至25°C培养，24h时离心收集上清酶液。包含本发明0 -I, 3-1，4-葡聚糖酶基因的表达载体属于本发明要求保护的范围。包含本发明提供的表达载体的细胞系或基因工程菌也为本发明要求保护的范围。^ -I, 3-1，4-葡聚糖酶酶活的测定采用改良AZO方法，测定原理及步骤为。 带蓝色基团的大麦￠-葡聚糖，在￠-葡聚糖酶的作用下，由于￠-葡聚糖大分子中的P -I, 3-1，4键的断裂，将蓝色基团释放到反应体系中，加入特定的沉淀液后，经过离心，清液在590nm处具有吸光值，且吸光值的大小直接与酶活力的高低成正比。测定步骤0. ImL经适当稀释的酶液，加入经40°C预热的蓝色葡聚糖底物(使用前和0. 2mol/L的pH5. 5的醋酸缓冲液等体积混合)，在40°C反应IOmin,每个反应样品中加A 3. OmL沉淀液,摇勻后10，000r/min离心5min, , Icm的比色杯测定清液在590nm处的吸光值，以0. ImL的去离子水代替酶样品做空白对照。沉淀液的配制20g乙酸钠及2g乙酸锌，加入70mL的去离子水溶解后浓盐酸调pH5. 0,定容至IOOmL,与400mL的乙二醇甲醚混合均勻。本发明提供的P-I, 3-1，4-葡聚糖酶的最适温度40 °C,最适pH5. 5.在40°C、PH5. 5下与大麦P -葡聚糖反应，能够降解底物，实验结果显示该重组P -I, 3-1，4-葡聚糖酶能够很好的降解大麦P -葡聚糖，具有很好的应用前景。生物材料保藏本发明要解决使用的一种特拉基芽孢杆菌，能分泌P -I, 3-1，4-葡聚糖酶，于2012年3月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 5935。
图I重组菌构建琼脂糖凝胶电泳图M :DNAmarker，I :bgl PCR 产物，2 :pET28a(+)BamH I /Xho I ,3 BGL-pET28a (+)BamH I /Xho I，4 pET28a(+)图2重组菌发酵产P -I, 3-1，4-葡聚糖酶SDS-PAGE图I :空载对照，2 :诱导12h发酵液上清，3 :诱导24h发酵液上清，4 :诱导36h发酵液上清，M protein marker,图中总箭头所示为目标蛋白。
具体实施例方式实施例lCGMCCNo. 5935Bacillus tequilensis CGX5-1 的筛选从马蜂巢穴的残片中取一定样品加入到30mL无菌生理盐水，玻璃珠打散制成悬浊液，80°C处理lOmin。将悬浊液梯度稀释，涂布于添加2%刚果红的MRS平板，37°C培养箱中培养24h。挑取使刚果红变色圈明显的的单菌落。反复进行平板划线分离，重复三次得到纯化的单菌落，供下一步鉴定用。鉴定主要通过1)菌落特征观察用肉眼直接观察，挑选菌落直径在1-1. 5mm之间，圆形，表面光滑稍有褶皱，乳白色等符合芽孢杆菌菌落特征的菌株。2)个体形态观察用光学显微镜革兰氏染色观察。挑选革兰氏阳性、有芽孢的菌株。将满足鉴定条件的菌株挑出甘油管保藏。以2%接种量取_70°C甘油贮存液接种于LB培养基中，37°C 200rpm摇瓶培养15h。以2%接种量取37°C 200rpm摇瓶培养物，转接至发酵培养基中37°C 200rpm摇瓶培养36小时。取发酵液离心5min (8000rpm，4°C)得到上清液。将上清液用双蒸水稀释合适倍数，取0. ImL稀释液，加入经40°C预热的蓝色葡聚糖底物(使用前和0. 2M的pH5. 5的醋酸缓冲液等体积混合)，在40°C反应IOmin,每个反应样品中加入3. OmL反应终止液,摇匀后 8000rpm离心5min, Icm的比色杯测定清夜在590nm处的吸光值，以0. ImL的双蒸水代替酶液做空白对照。通过测定发酵液中￠-1, 3-1，4-葡聚糖酶的活力，筛选到一株具有较强产^ -I, 3-1，4-葡聚糖酶能力的菌株，通过16SrDNA序列分析可知该菌株为特基拉芽孢杆菌实施例2 ^ -I, 3-1，4-葡聚糖酶分离克隆程序。CGMCCNo. 5935 Bacillus tequilensis CGX5-1 菌株在液体培养基(蛋白胨 10g/L，氯化钠10g/L，酵母提取物10g/L)中培养12天，IOOOOrpm离心收集菌体，无菌水洗涤，使用基因组提取试剂盒提取总DNA。根据NCBI 中 Bacillus amyIoliquefaciens LL3 (NC_017190. I)中 bglS 设计引物如下，bglS 上游引物(bglS-) :5，-CGCGGATCCATGAAACGAGTGTTGCTAATTCTT-3,下游引物(bglS-r) 5, -CGCTCGAGTTATTTTTTTGTATAGCGCACCCA-3,，下划线部分为限制性内切酶 BamHI和Xho I酶切位点。利用上述引物，以Bacillus tequilensis CGX5-1总DNA为模版，PCR扩增3-1，3-1，4-葡聚糖酶基因。反应条件为94°C预变性5min后进入一下循环94°C变性50s，63°C退火45s，72°C延伸60s，30个循环；72°C延伸lOmin。扩增得到737bp的PCR片段，切胶回收。回收片断与PMD18-T simple载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布含50mg/L氨苄青霉素的LB平板。37 °C培养过夜，挑取单菌落，接入LB液体培养基，8h后提取质粒。将此质粒进行序列测定，结果表明此基因全长720个核苷酸，编码239个氨基酸,和Bacillus amyloliquefaciens LL3的bglS基因有73个核苷酸的差异,编码氨基酸有十七个不同。此基因是第一个报道的来自于Bacillus tequilensis的P-I, 3-1，4_葡聚糖酶。实施例3 ^ -I, 3-1，4-葡聚糖酶基因在大肠杆菌表达载体上的构建程序。用于构建大肠杆菌表达载体的质粒是pET28a (+)。将pET28a (+)质粒和
3-1，3-1，4-葡聚糖酶基因进行BamH I和Xho I双酶切，酶切产物切胶回收后，再用T4连接酶16°C连接过夜，连接产物转化E. coli JM109感受态细胞，经37°C培养过夜，挑选转化子50mg/L氨苄青霉素LB进行液体培养，然后抽提质粒，得到富集的BGL_pET28a (+)质粒，构建过程电泳图见图I。实施例4大肠杆菌宿主转化和筛选重组菌的程序。将质粒BGL_pET28a(+)热击转化E. coli BL21 (DE3)宿主菌，在氨苄青霉素(50mg/U-LB平板上经37°C培养过夜，挑选转化子(重组菌BGL-pET28a(+)/E. coli BL21(DE3))在LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L)中37°C液体培养过夜，后接入TB 发酵液体培养基(甘油5g/L，蛋白胨12g/L，酵母膏24g/L，K2HP0412. 54g/L，KH2P042. 31g/L) 37°C培养3h后用4mg/L IPTG (异丙基硫代P D半乳糖苷)及终浓为10mmol/L乳糖诱导，降温至25°C培养，24h时离心收集上清，上清酶活为1994u/mL。电泳图见图2，表观分子量 27kDa。
权利要求
1.一种￠-1, 3-1，4-葡聚糖酶，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.编码权利要求I所述P-I, 3-1，4-葡聚糖酶的基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQIDNO. 2 所示。
3.表达权利要求I所述P-I, 3-1，4-葡聚糖酶的基因工程菌或细胞系。
4.含有权利要求2所述￠-1,3-1，4-葡聚糖酶基因的表达载体或克隆载体。
5.生产权利要求I所述P-I, 3-1，4-葡聚糖酶的方法，其特征在于包括如下步骤 1)采用化学全合成或PCR方法获得SEQID NO. 2所示核苷酸序列； 2)克隆SEQID NO. 2所示核苷酸序列到pET28a(+)表达载体； 3)将步骤2)获得的表达载体转化E.coli BL21(DE3)获得表达P _1，3_1，4-葡聚糖酶的基因工程菌； 4)将步骤3)获得的基因工程菌在LB培养基中37°C液体培养过夜，后接入TB发酵液体培养基37°C培养2h后用4mg/L IPTG及终浓为10mmol/L乳糖诱导，降温至25°C培养，24h时离心获得上清酶液。
全文摘要
本发明提供了一种β-1,3-1,4-葡聚糖酶及其编码基因和表达系统。该β-1,3-1,4-葡聚糖酶能够有效降解大麦β-葡聚糖，可用于啤酒酿造工业和饲料工业。
文档编号C12N15/56GK102719415SQ201210196700
公开日2012年10月10日 申请日期2012年6月15日 优先权日2012年6月15日
发明者刘春凤, 刘晓玲, 李崎, 李永仙, 王金晶, 郑飞云 申请人:江南大学