专利名称：一种提高红霉素发酵效价和促进红霉素a生成的方法
技术领域：
本发明属于生物医药发酵技术领域，特别是涉及一种提高红霉素发酵效价和促进红霉素A生成的方法。
背景技术：
红霉素(erythromycin)是一类十四元大环内酯类抗生素,包括红霉素A(EMA)、红霉素B (EMB)、红霉素C (EMC)、红霉素D (EMD)、红霉素E (EME)和红霉素F (EMF)。在临床上具有广泛用途的是红霉素A，它的抑菌活性最高，其抗菌谱与青霉素相似，对革兰氏阳性菌有较强的抗菌活性，如溶血性链球菌、肺炎双球菌、草绿色链球菌、白喉杆菌，对革兰氏阴性菌如脑膜炎球菌、淋球菌、流感杆菌、百日咳杆菌、布氏杆菌及军团菌等也有抗菌作用，临床上常用于对青霉素过敏的患者。 国内红霉素发酵水平普遍不高，距国际先进水平低2000 5000 u/ml，竞争力差。因此，为了提高竞争力，必须要降低生产成本，提高红霉素发酵效价和组分A的含量。
发明内容
本发明目的就在于提供一种可有效降低生产成本，提高发酵效价和促进红霉素A生成的方法。为实现上述发明目的所采取的技术方案为
一种提高红霉素发酵效价和促进红霉素A生成的方法，其特征是在以红色链霉菌为种子发酵生产红霉素的发酵罐发酵培养过程中，采用含有甜菜碱、食用油和微量元素的红霉素发酵基础配方并控制相应的生物量浓度、通气比、发酵罐压、发酵温度、搅拌速率、PH和发酵液中食用油浓度来发酵生产红霉素，同时在发酵过程中添加表面活性剂吐温20。上述红霉素发酵基础配方的组成为葡萄糖I 5 kg/m3,玉米粉8 24kg/m3,玉米蛋白粉3 20kg/m3,花生饼粉5 23kg/m3,碳酸I丐O. 2 I. 5kg/m3,磷酸二氢钾O. 3
I.5kg/m3,硫酸镁O. O lkg/m3,氯化猛O. 002 O. lkg/m3,氯化钠O. I I. 5kg/m3,氯化钾O. I I. 2 kg/m3,氯化锌 O. 02 O. 4 kg/m3,舌甘菜碱 O. I 2kg/m3,氯化钴 O. 002 O. Ikg/m3,钥酸铵 O. 002 O. lkg/m3，食用油 5 20 kg/m3。上述生物量浓度是指发酵罐中菌体浓度，其单位为g(菌体干重)/L，在红霉素发酵稳定期菌体浓度控制在25 35kg (菌体干重)/ m3o上述发酵温度是指在红霉素发酵过程中的温度，发酵温度为29 33°C。上述发酵罐压是指在发酵罐的压力，发酵罐压为O. 04 O. OSMPa0上述通气比是指在I分钟时间内通入发酵罐的单位体积的无菌空气流量，其大小为 O. 5 I. 2m3/ Cm3 · min)。上述pH是指在红霉素发酵罐发酵过程中的pH，其范围为6. 3 7. O。上述搅拌速率是指三级发酵罐搅拌桨的转动速率，其大小为120 350r/min。上述食用油浓度是指发酵罐中单位体积含食用油的质量，其大小为2 20 kg/m3。
上述表面活性剂吐温20的加入时机是指发酵罐放罐前25 35h加入经灭菌的生物表面活性剂吐温20，使三级发酵罐内的吐温浓度为O. I O. 3kg/m3。本发明具有以下技术优势
I)红霉素A含量得到明显提高
红霉素的生物合成包括两个方面大环内酯环的合成和大环内酯环的后修饰，红霉素的大环内酯环即6-脱氧红霉内酯的生物合成是由丙酸和甲基丙二酸在复合酶系-多酮合成酶的催化作用下，经缩合、酮还原、脱水和烯还原等多轮循环完成的。丙酸和甲基丙二酸均由初级代谢产物分解而来。6-脱氧红霉内酯在C-6羟化酶的作用下形成红霉内酯。红霉内酯在糖基转移酶的作用下，形成具有生物活性的红霉素D，再沿两条分支途径转化为红霉素A，其中途径I为红霉素D在eryV的作用下先羟基化，生成红霉素C，然后在eryG的作用下甲基化，生成红霉素A ;途径II为红霉素D在eryG的作用下，先甲基化，生成红霉素B，然后在eryK的作用下羟基化，生成红霉素A。有文献报道，由红霉素B转化成红霉素A的通量小，红霉素B容易积累，而由红霉素C转化成红霉素A的通量大。 因此，本发明通过在基础配方中加入甜菜碱，从而促进了红色链霉菌的甲基化作用，有利于使次生代谢流向红霉素A。据文献报道，红霉素糖苷配基的所有氧原子(除了羰基)，都来自分子氧。红霉素A中的C-6和C-12的叔醇基团中的氧也来自分子氧。红霉素B在溶氧低的情况下产生，且由红霉素B转化成红霉素A的通量小，红霉素B容易积累。因此，保持高溶氧对红霉素A有效组分十分重要。在发酵液中添加适当的表面活性剂，不仅可以改变发酵液的流体特性，而且可以改变细胞的通透性，从而有利于物质传递，改善通气效果。本发明通过在发酵后期加入表面活性剂吐温20后，最终促使发酵液中红霉素A的含量由79. 5%左右提高到84. 5%左右。2)降低了生产成本
目前红霉素发酵生产中的培养基主要采用淀粉和葡萄糖作为碳源，豆饼粉、玉米浆和硫酸铵作为氮源，此工艺生产成本相对较高。本发明选用廉价的玉米粉作为培养基的部分碳源，玉米蛋白粉和花生饼粉作为发酵培养基的氮源，代替原工艺中的部分淀粉和豆饼粉，食用油碳量比淀粉高出I倍、价格并不比淀粉高，食用油可替代部分淀粉作为碳源，从而降低了生产成本。3)显著提高了红霉素的发酵水平
红霉内酯的前体是丙酸和甲基丙二酸。本发明采用食用油为碳源，可通过脂肪酸β-氧化和TCA循环产生大量的丙酸单位，从而有利于红霉内酯的生成。油是一种疏水性物质，在培养基中的溶解度较低，不易发生碳代谢物的阻遏作用。金属离子对红霉素的生物合成具有很重要的作用。如，适量浓度的钥可促进微生物细胞增殖及提高某些酶的活性；适量浓度的锌离子可使3-磷酸甘油醛脱氢酶、苹果酸脱氢酶等锌酶具有较高的活性；适量浓度的锰离子可使丙酮酸羧化酶、丙酮酸激酶等锰酶具有较高的活性；镁离子是糖代谢过程中许多关键酶发挥催化作用的辅因子。因此，在发酵培养基中目的性的添加适量金属离子有助于提高红霉素发酵效价。本发明正是通过在发酵基础培养基中添加微量金属元素来促进相关酶促反应，使其向有利于红霉素合成的方向进行。
通过上述措施，最终可使红霉素发酵效价提高到10400u/ml左右，增加了约13%。4)提高罐的装料系数
油的表面张力低，以油作为底物不易产生气泡，可减少消泡剂的使用或者不适用消泡齐U，从而提闻te的装料系数。综上所述，本发明通过创造出有利于红色链霉菌分泌抗生素的环境，使其代谢向有利于合成红霉素的方向发展，最终降低了红霉素发酵生产成本，提高了红霉素发酵效价和促进了红霉素A合成。
具体实施例方式下面用实例予以说明本发明，应该理解的是，实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。对照实例红霉素原发酵工艺 红霉素生产菌种采用红色链霉菌。用2m3的发酵罐培养一级种子培养温度32°C，通气比O. 7 m3/ ( m3 · min)，罐压O. 04MPa，搅拌速率200r/min，一级种子培养基(kg/m3)配方为淀粉50，硫酸铵2. 0，氯化钠
O.9，蛋白胨2. 5，酵母粉4. 0，葡萄糖7. 0，碳酸钙I. 0，硫酸镁O. 5，磷酸氢二钾O. 5，玉米浆
3.0，有机硅消泡剂O. 02%,灭菌前调pH7. O。将一级种子全部倒入15m3的发酵罐中，进一步种子扩大培养，培养温度32°C，通气比O. 8 m3/ ( m3 · min),罐压O. 06MPa,搅拌速率200r/min, 二级种子培养基(kg/m3)配方为玉米粉25，磷酸氢二铵O. 5，氯化钠O. 8，氯化钾O. 9，玉米蛋白粉18，花生饼粉12，葡萄糖5. 0，碳酸钙I. 20，玉米浆6. 0，有机硅消泡剂O. 02%,灭菌前调ρΗ7· 2。三级发酵罐发酵，接种量14% (V/V)，发酵罐体积为120 m3，红霉素发酵基础配方为葡萄糖3 kg/m3,淀粉60kg/m3,豆饼粉17kg/m3,棉籽饼粉12kg/m3,碳酸韩lkg/m3,磷酸二氢钾O. 4kg/m3,硫酸镁O. 6kg/m3,氯化钠O. 8kg/m3,氯化钾O. 9 kg/m3,氯化胆碱O. 6kg/m3,有机硅消泡剂O. 02%。发酵过程中控制相应的生物量浓度在30 35g菌体干重、通气比1.0 m3/Cm3 ·π η)、发酵罐压 O. 04MPa、发酵温度 29 33°C、搅拌速率 180r/min、pH6. 3 7. 0，180h放罐。放罐效价8698u/ml，红霉素A含量为78. 3%。实施例I提高红霉素发酵产量和红霉素A含量的工艺 红霉素生产菌种采用红色链霉菌。用2m3的发酵罐培养一级种子培养温度32°C,通气比O. 5 O. 9 m3/( m3 *min),罐压O. 03 O. 06MPa,搅拌速率200r/min,—级种子培养基(kg/m3)配方为玉米粉40,硫酸铵I. 5，氯化钠O. 6，蛋白胨2. 5，酵母粉4. 0，葡萄糖5. 0，碳酸钙I. 0，硫酸镁O. 5，磷酸氢二钾O. 5，玉米浆3. 0，食用油5. 0，灭菌前调pH7. O。将一级种子全部倒入15m3的发酵罐中，进一步种子扩大培养，培养温度32°C，通气比O. 5 O. 9 m3/ ( m3 · min)，罐压O. 03 O. 06MPa,搅拌速率200r/min, 二级种子培养基(kg/m3)配方为玉米粉25，磷酸氢二铵O. 5，氯化钠O. 8，氯化钾O. 9，玉米蛋白粉18，花生饼粉12，葡萄糖5.0，碳酸钙I. 20，玉米浆5.0，食用油12.0，灭菌前调？!17.2。三级发酵罐发酵，接种量14% (V/V)，发酵罐体积为120 m3，红霉素发酵基础配方为葡萄糖3 kg/m3,玉米粉15kg/m3,玉米蛋白粉17kg/m3,花生饼粉12kg/m3,碳酸I丐O. 9kg/m3,磷酸二氢钾O. 3kg/m3,硫酸镁O. 5kg/m3,氯化猛O. 004kg/m3,氯化钠O. 8kg/m3,氯化钾O. 9kg/m3,氯化锌 O. 08 kg/m3,甜菜碱 O. 6kg/m3,氯化钴 O. 0034kg/m3,钥酸铵 O. 002kg/m3,食用油 15 kg/m3。发酵过程中控制相应的生物量浓度在25 35g菌体干重/L、通气比O. 5 I. 2 m3/Cm3 · min)、发酵罐压O. 04 O. 08MPa、发酵温度29 33°C、搅拌速率160r/min、ρΗ6· 3 7. O、发酵液中食用油浓度2 20 kg/m3,然后在放罐前25 35h加入经灭菌的生物表面活性剂吐温20，使三级发酵罐内的吐温浓度为O. 15kg/m3, 180h放罐。放罐效价10235u/ml，红霉素A含量为84. 3%。实施例2提高红霉素发酵产量和红霉素A含量的工艺 红霉素生产菌种采用红色链霉菌。用2m3的发酵罐培养一级种子培养温度32°C,通气比O. 5 O. 9 m3/( m3 *min),罐压O. 03 O. 06MPa,搅拌速率200r/min,—级种子培养基(kg/m3)配方为玉米粉40,硫酸铵I. 5，氯化钠O. 6，蛋白胨2. 5，酵母粉4. 0，葡萄糖5. 0，碳酸钙I. 0，硫酸镁O. 5，磷酸氢二钾O. 5，玉米浆3.0，食用油5. 0，灭菌前调pH7. O。将一级种子全部倒入15m3的发酵罐中，进一步种子扩大培养，培养温度32°C，通气比O. 5 O. 9 m3/ (m3 · min)，罐压O. 03 O. 06MPa,搅拌速率200r/min, 二级种子培养基(kg/m3)配方为玉米粉25，磷酸氢二铵O. 5，氯化钠O. 8，氯化钾O. 9，玉米蛋白粉18，花生饼粉12，葡萄糖5. 0，碳酸钙I. 20，玉米浆5. 0，食用油12. 0，灭菌前调pH7. 2。三级发酵罐发酵，接种量15% (V/V)，发酵罐体积为120 m3，三级发酵罐基础培养基配方为葡萄糖4 kg/m3,玉米粉18kg/m3,玉米蛋白粉15kg/m3,花生饼粉13kg/m3,碳酸隹丐
O.8kg/m3,磷酸二氢钾 O. 25kg/m3,氯化猛 O. 0031kg/m3,氯化钠 O. 93kg/m3,氯化钾 O. 83kg/m3,氯化锌 O. 054 kg/m3,甜菜碱 O. 65kg/m3,氯化钴 O. 0032kg/m3,钥酸铵 O. 0027kg/m3,食用油 13 kg/m3。 发酵过程中控制相应的生物量浓度在25 35g菌体干重/L、通气比O. 8 I. 2m3/Cm3 · min)、发酵罐压O. 04 O. 05MPa、发酵温度31 33°C、搅拌速率160r/min、ρΗ6· 3 6. 8、发酵液中食用油浓度2 16 kg/m3,然后在放罐前30 35h加入经灭菌的生物表面活性剂吐温20，使三级发酵罐内的吐温浓度为O. 2kg/m3, 185h放罐。放罐效价10537u/ml，
红霉素A含量为84. 8%。实施例3提高红霉素发酵产量和红霉素A含量的工艺 红霉素生产菌种采用红色链霉菌。用2m3的发酵罐培养一级种子培养温度32°C,通气比O. 5 O. 9 m3/ ( m3 *min)，罐压O. 03 O. 06MPa,搅拌速率200r/min,—级种子培养基(kg/m3)配方为玉米粉40,硫酸铵I. 5，氯化钠O. 6，蛋白胨2. 5，酵母粉4. 0，葡萄糖5. 0，碳酸钙I. 0，硫酸镁O. 5，磷酸氢二钾O. 5，玉米浆3.0，食用油5. 0，灭菌前调pH7. O。将一级种子全部倒入15m3的发酵罐中，进一步种子扩大培养，培养温度32°C，通气比O. 5 O. 9 m3/ ( m3 · min)，罐压O. 03 O. 06MPa,搅拌速率200r/min, 二级种子培养基(kg/m3)配方为玉米粉25，磷酸氢二铵O. 5，氯化钠O. 8，氯化钾O. 9，玉米蛋白粉11，花生饼粉16，葡萄糖2. 0，碳酸钙I. 20，玉米浆5. 0，食用油12. 0，灭菌前调pH7. 2。
三级红霉素发酵，接种量15%(V/V)，发酵罐体积为120 m3，三级发酵罐红霉素发酵培养基配方为葡萄糖4 kg/m3,玉米粉18kg/m3,玉米蛋白粉14kg/m3,花生饼粉19kg/m3,碳酸隹丐 O. 9kg/m3,磷酸二氢钾 O. 4kg/m3,氯化猛 O. 003kg/m3,氯化钠 O. 9lkg/m3,氯化钾 O. 72 kg/m3,氯化锌 O. 06 kg/m3,甜菜碱 O. 53kg/m3,氯化钴 O. 0036kg/m3,钥酸铵 O. 0024kg/m3,食用油15 kg/m3。 发酵过程中控制相应的生物量浓度在25 35g菌体干重/L、通气比O. 6 I. Im3/Cm3 · min)、发酵罐压O. 04 O. 05MPa、发酵温度31 33°C、搅拌速率170r/min、ρΗ6· 3 6. 8、发酵液中食用油浓度2 16 kg/m3，然后在放罐前30 35h加入经灭菌的生物表面活性剂吐温20，使三级发酵罐内的吐温浓度为O. 2kg/m3, 186h放罐。放罐效价10473u/ml，红霉素A含量为84. 9%。
权利要求
1.一种提高红霉素发酵效价和促进红霉素A生成的方法，其特征是在以红色链霉菌为种子发酵生产红霉素的发酵罐发酵培养过程中，采用含有甜菜碱、食用油和微量元素的红霉素发酵基础配方并控制相应的生物量浓度、通气比、发酵罐压、发酵温度、搅拌速率、PH和发酵液中食用油浓度来发酵生产红霉素，同时在发酵过程中添加表面活性剂吐温20。
2.按照权利要求I所述的提高红霉素发酵效价和促进红霉素A生成的方法，其特征在于上述红霉素发酵基础配方的组成为葡萄糖I 5 kg/m3,玉米粉8 24kg/m3,玉米蛋白粉3 20kg/m3,花生饼粉5 23kg/m3,碳酸隹丐0. 2 I. 5kg/m3,磷酸二氢钾0. 3 I. 5kg/m3,硫酸镁0. 0 lkg/m3,氯化猛0. 002 0. lkg/m3,氯化钠0. I I. 5kg/m3,氯化钾0. I I.2 kg/m3,氯化锌 0. 02 0. 4 kg/m3,甜菜碱 0. I 2kg/m3,氯化钴 0. 002 0. lkg/m3,钥酸铵 0. 002 0. lkg/m3，食用油 5 20 kg/m3。
3.按照权利要求I所述的提高红霉素发酵效价和促进红霉素A生成的方法，其特征是上述生物量浓度控制在25 35kg菌体干重/ m3。
4.按照权利要求I所述的提高红霉素发酵效价和促进红霉素A生成的方法，其特征是上述发酵温度控制在29 33°C。
5.按照权利要求I所述的提高红霉素发酵效价和促进红霉素A生成的方法，其特征是上述发酵罐压控制在0. 04 0. 08MPa。
6.按照权利要求I所述的提高红霉素发酵效价和促进红霉素A生成的方法，其特征是上述通气比控制在0. 5 I. 2m3/ Cm3 min)。
7.按照权利要求I所述的提高红霉素发酵效价和促进红霉素A生成的方法，其特征是上述pH控制在6. 3 7. O。
8.按照权利要求I所述的提高红霉素发酵效价和促进红霉素A生成的方法，其特征是上述搅拌速率控制在120 350r/min。
9.按照权利要求I所述的提高红霉素发酵效价和促进红霉素A生成的方法，其特征是上述发酵液中食用油浓度控制在2 20 kg/m3。
10.按照权利要求I所述的提高红霉素发酵效价和促进红霉素A生成的方法，其特征是上述表面活性剂吐温20在放罐前25 35h加入，其在发酵液中的浓度为0. I 0. 3kg/m3。
全文摘要
本发明涉及一种提高红霉素发酵效价和促进红霉素A生成的方法，该方法在以红色链霉菌为种子发酵生产红霉素的发酵罐发酵培养过程中，采用含有甜菜碱、食用油和微量元素的红霉素发酵基础配方并控制相应的生物量浓度、通气比、发酵罐压、发酵温度、搅拌速率、pH和发酵液中食用油浓度来发酵生产红霉素，同时在发酵过程中添加表面活性剂吐温20。本发明通过创造出有利于红色链霉菌分泌抗生素的环境，使其代谢向有利于合成红霉素的方向发展，最终降低了红霉素发酵生产成本，提高了红霉素发酵效价和促进了红霉素A合成。
文档编号C12R1/465GK102757991SQ201210246738
公开日2012年10月31日 申请日期2012年7月17日 优先权日2012年7月17日
发明者任勇, 奇乃, 杜以文, 王 义, 纳卓斌 申请人:宁夏泰瑞制药股份有限公司