专利名称：风疹病毒检测诊断试剂盒及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种荧光检测试剂盒及其用途，具体说，是涉及一种检测风疹病毒荧光定性定量PCR检测试剂盒，属于医学、生物技术领域。
背景技术：
风疫病毒(Rubella virus, RV)是RNA病毒,属于披膜病毒科(togavirus)是限于人类的病毒。电镜下多呈不规则球形，直径50 70nm的核心，风疹病毒的抗原结构相当稳定，现知只有一个血清型。风疹病毒易发生垂直感染，孕妇妊娠早期初次感染风疹病毒后，病毒可通过胎盘屏障进入胎儿，常可造成流产或死胎，还可导致胎儿发生先天性风疹综合征，引起胎儿畸形。病毒在体外的生活力弱，对紫外线、乙醚、氯化铯、去氧胆酸等均敏感。pH<3. O可将其灭活。风疹病毒不耐热，56°C下30分钟或37°C下I. 5小时均可将其杀死，4°C 保存不稳定，最好保存在-60 _70°C可保持活力3个月，干燥冰冻下可保存9个月。风疹病毒基因组为单股正链RNA，长度为9757个核苷酸，G+C含量较高(69. 5%)。病毒基因组包含40sRNA，含帽状结构，具有真核细胞典型的mRNA功能；24sRNA连接于40sRNA3’末端，负责编码一个分子量110X103的多肽链，此肽链为RV结构蛋白前体。风疹病毒有4种结构蛋白，分别是胞膜糖蛋白El (分子量58X 103)、E2a (分子量47 X 103)、E2b(分子量42X IO3)和核壳蛋白C (分子量33X 103)。El、E2a、E2b结构相似，均为糖蛋白，位于病毒颗粒的包膜上。其中E2a、E2b由同一基因编码，多肽组成相同，两者分子量的差异因糖基侧链不同而致。C蛋白不含糖基侧链，与RNA相连，包绕病毒基因共同组成核衣壳。El的多肽部分由412 481个氨基酸残基组成，富含脯氨酸和半胱氨酸。作为抗原，El较E2具有较好的免疫原性，能刺激产生针对各决定簇的单克隆抗体，相应单抗能抑制RV的凝血功能，并表现出中和活性。此外，RV感染可产生特异性免疫球蛋白IgG、IgA、IgM,它们均具有致病意义和诊断价值。目前风疹病毒的临床检测常用病毒分离法、血清诊断技术(包括血凝试验、酶免疫技术、放射免疫技术和突光免疫技木等)和分子生物学检测技术。病毒分尚是一种很准确的方法，但培养周期长，操作复杂，生物影响因素多，不宜被一般实验室采用。免疫学方法是一种常用的方法，它不需要对血清样本进行预处理，临床应用操作简便，适用于RV感染的实验室诊断和大规模现场调查，但该方法易受抗体产生时间的限制，可由于采血时间不当而引起假阴性反应；并且一些其它病毒如EB病毒等感染还可引起假阳性反应。核酸杂交法也可用于诊断RV感染且优于免疫学方法，不会造成假阳性反应。目前PCR技术广泛应用于生物科学的各个领域，其中RT-PCR具有快速、灵敏度高和特异性强的特点，适用于RV感染的初步和早期诊断，也可用于大样本的初筛工作。近年来发展起来的突光定量PCR(Fluoroenetic Quantitative PCR, FQ-PCR)技术以其灵敏度高、速度快、特异性强等优点，己在病原体的定性检测(Mcgolddrik A，Lowing JPj Ibata G，et al. A Novel Approach to the Detection of ClassicalSwine Fever Virus by RT-PCR with a Fluorogenic Probe (TaqMan) [J]. J Virol.Methods, 1998，72:125-135)、定量检测(Desire N, Dehee A, Schneider V, etal. , Quantification if Human Immunodeficiency Virus Type I Proviral Load bya TaqMan Real-Time PCR Assay [J] · J. Clin. MicroblOl, 2001，39:1301-1310)、肿瘤基因检测(Gelmini S et al. Clin Chem. 1997, 43(5) :752-758),免疫分析(Lang R etal. J Tmmunol Methods. 1997, 203(2) : 181-192)、基因表达水平分析(Hirayama Y etal. Blood, 1998,92(1) :46-52)的研究等多个领域得到应用。对感染者体内风疹病毒的直接检测和定量研究，不仅对于了解患病程度，预测、评价治疗效果有十分重要意义，同时也使对病原体感染发病机制的研究进入量化阶段，点面而且对新药的研究与试用等极为重要。国内外在相关的这些方面研究很多，虽然也研制开发出许多检测试剂盒，但风疹病毒的荧光定量PCR试剂盒的仍属少数、因此，开发更多有效、快速、准确的风疹病毒荧光PCR诊断试剂盒成为当下热点
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种一种检测风疹病毒荧光定性定量PCR检测试剂盒及其用途。为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下一种风疹病毒(Rubella virus, RV)检测试剂盒，包括包括RNA提取液、RT-PCR反应液、混合酶、RV阳性标准模板、阳性对照和阴性对照；其中所述RT-PCR反应液含有PCR缓冲液，0. I 10 μ M浓度的引物P1、P2，0. I 10 μ M浓度的荧光探针RVFP，0. I ImM的dNTPs溶液和I IOmM的MgCl2 ；所述的PCR反应液中引物(PI、P2)和探针(RVFP)为风疹病毒E2a或E2b基因片段，所述的引物Pl序列为5’ -ATCTGCGGGCTGTCCACCA-3’，引物P2序列为5’ -AGCAAGTCGCACGTCCCAT-3’，RV荧光标记探针RVFP序列为5’ -AAGACGGCTGGACTTGTCGT-3’ ；或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延长的序列；或者与上述序列同源性大于85%的序列；或者上述序列的碱基互补序列；或者使用上述所有序列中的任意一种或两种以上的组合。作为一种优选方案，所述的荧光探针标记的发光基团为FAM、JOE、Fluorescein,TET>Cy3>Cy5>R0X>Rhodamine>Rhodamine RecURhodamine 6G>Orengon Green 488>OrengonGreen 500>Orengon Green 514、Texas Red、HEX、TAMRA、Inosine、FITC或Acridine orange中的任意一种；荧光淬灭基团为TAMRA、BHoi、BH02、BHQ3、DABCYL或DABSYL中的任意一种。作为一种优选方案，所述的混合酶由I IOOU的逆转录酶Superscriptlll和INIOU的Taq DNA聚合酶配制而成。作为一种优选方案，所述的RV标准阳性模板为含有风疹病毒E2a基因片段SEQ IDNO. I 与 PGEM-T Easy 载体构成的 PGEM T181-1 重组质粒 SEQ ID NO. 2，SEQ ID NO. I 序列为5’ -ATCTGCGGGCTGTCCACCACCGCCCAGTACCCGCCTACCCGGTTTGGCTG CGCCATGCGGTGGGGCCTCCCCCCCTGGGAACTGGTCGTTCTTACCGCCCGCCC CGAAGACGGCTGGACTTGTCGTGGCGTGCCCGCCCATCCAGGTACCCGCTGCCC CGAACTGGTGAGCCCCATGGGACGTGCGACTTGCT-3’ 。作为一种优选方案，该质粒转化大肠杆菌DH5 Q增殖后用超纯质粒提取试剂盒提取纯化，用紫外分光光度计测A260定量并稀释至I X IO7拷贝数/ μ I，-20°C保存，使用前10倍稀释至I X IO6拷贝数/μ I、I X IO5拷贝数/μ I、I X IO4拷贝数/μ I。作为一种优选方案，所述的阳性对照为RV阳性培养物(灭活)；阴性对照为无模板荧光定量反应液。 作为一种优选方案，所述的RNA提取液为提取效率>80%、RNA完整性好、稳定性好且操作简便的核酸提取液。根据本发明提供的试剂盒，采用风疹病毒检测试剂盒，按以下步骤进行
(a)采RNA提取液从待测标本中提取RNA ；(b)将RV标准阳性模板进行10 20倍梯度稀释；(c)分别取第(a)步中的RNA和第(b)步中的RV阳性标准品，加入到含有混合酶的RT-PCR反应体系中，与标准阴性质控品一起用荧光定量PCR检测仪进行RT-PCR检测；(d)通过比较待测样本和标准品的循环域值而对待测样品的起始拷贝数进行定量，在荧光定量PCR仪自带软件生成的标准曲线上找出待测样品对应的拷贝数浓度。作为一种优选方案，所述的待检样本为含漱液或消化道抽提液。在本发明提供检测风疹病毒的荧光定量PCR试剂盒中，有一条两端标记有荧光基团和两条淬灭基团的特异性荧光探针，在探针完整(两条探针可互相保证探针完整)时，两基团在空间结构上距离相互靠近，5’端荧光报告基团产生的荧光共振能量转移(FRET)而被3’端淬灭基团淬灭，故体系中没有荧光信号的变化，在PCR退火和伸延过程中，探针与模板特异性结合，随引物的延伸，Taq DNA聚合酶利用其5’ -3’外切酶活性对探针进行切割，释放出报告基团，破坏了两基团之间的FRET，从面脱离了 3’端荧光淬灭基团的屏蔽，报告基团所释放的荧光可以被内置在定量检测仪内的荧光计检测，荧光量的增加与PCR产物的积累量呈比例关系。对风疹病毒的定量可通过与标准品的循环域值(Ct，ThiOShold Cycle)相比较得出。Ct值与起始模板数呈一定比例关系，Ct值越小，起始模板数越多，相反，Ct值越大，起始模板数越少。利用阳性梯度标准模板的Ct值制成标准曲线，再根据待测样本的Ct值可准确测出该样本的起始拷贝数。在本发明提供风疹病毒的荧光定量PCR试剂盒中，针对风疹病毒中的特殊性，对不同的靶序列进行反应体系(引物和探针浓度、Mg2+浓度、退火温度等)的优化，并将FQ-PCR技术与定量检测系统相结合，将其用于风疹病毒的定量检测，通过优化方案，反复实验，建立了定量检测风疹病毒(RV)的方法，并研制出风疹病毒定量检测试剂盒，该试剂盒的灵敏度可在每个反应体系中检测IO1个病毒粒子。与现有技术相比，本发明具有如下的技术特点(I)特异性更强，灵敏度更高，使用了两条条可与模板互补配对的荧光探针，提高了特异性，且所设计的引物和探针与RV特异性结合，与其它病原体无明显的同源性，特异性极高。另外，可由自动化仪器收集荧光信号，避免了肉眼判断的主观性，结果可靠，又进一步提高了灵敏度，即使仅存在单拷贝的目的片段也可得刭有效的检测。(2)全封闭反应，无须PCR后处理，避免污染，保证了结果的可靠可重复；在线性实时监测荧光，结果客观又直观。
(3)检测速度快，整个检测过程共仅需2 3小时；可同时进行大批量的样本检测，有利于规模化、自动化。本发明所述方法的成功开发对于疫苗的研发中抗原表位这一有效组分的检测有着重要的意义，同时该方法也为RV疾病的防治、早期筛查、诊断工作提供了准确、简便、有效的监测手段，具有广泛的应用范围和社会需求。总之，本发明积极适应了现代生物、预防保健、临床诊断等领域的工作需要和人性化服务的需要，本发明为研究开发该风疹病毒检测试剂盒，对改进和提高现有的该风疹病毒检测试剂盒具有重要价值。因此其应用前景十分广阔。
具体实施例方式以下结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，下述实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。比例和百分比基于重量，除非特别说明。实施例I风疹病毒荧光定量PCR检测试剂盒的制备(I) RNA 提取液，dNTPs (25mM)，逆转录酶Superscript III (200U/ μ I), RNA 酶抑制剂(40U/ μ I)，TaqDNA 聚合酶(5U/ μ I)，MgCl2(IOOmM) (2)荧光 PCR 5 X buffer 组成50mM Tris-HCl (PH8. 3)，250mM KCl，lmg/ml 明胶。(3)混合酶组咸I. 5U/ul 逆转录酶 Superscript III, I. 5U/ul Taq DNA 聚合酶，5U/u I RNA 酶抑制剂。(4)荧光定量PCR反应液PCR 5Xbuffer 6 μ 1，PI、P2 各 O. 3 μ I (25 μ Μ)，荧光探针 FP O. 2 μ I (25 μ Μ)，MgCl2O. 9 μ I (IOOmM)，dNTPs O. 24 μ I (25mM)，DEPC 处理水 15. 86 μ I。实施例2 :用荧光定量PCR试剂盒检测风疹病毒(I)取离心处理过的含漱水或咽拭子抽提液500 μ 1，加入Iml RNA提取液，再加入200 μ I氯仿，振荡15s，室温孵化lOmin。4°C 12000g离心lOmin，RNA位于上层。将上层更换至新的1.5ml的EP管，加入500 μ I异丙醇，_20°C下孵化lOmin，再室温下12000g离心IOmin0弃上清，加入Iml 75%的乙醇洗RNA沉淀，振荡混匀，4°C 12000g离心5min。弃上清，37°C干燥5min，从而得到病毒RNA。(2)将标准阳性模板10倍稀释至I X IO6拷贝数/ μ I、I X IO5拷贝数/ μ I、I X IO4拷贝数/ μ Io(3)取荧光定量PCR反应液24 μ 1，分别加2 μ I混合酶，再加入第I步提取的RNA和第2步稀释好的阳性标准模板各4 μ 1，另外一管加(f)标准阴性质控液，在荧光定量PCR检测仪(ABI 7500)上平行做PCR检测。循环条件为先在37°C反应30分钟，然后94°C保温5分钟，再按94°C IOs — 60°C 45s循环40次，60°C采集FAM荧光通道的信号。(4)循环结束后，运行ABI 7500PCR检测仪自带软件，读取待测样品拷贝数。(5)结果为阳性标准模板IXlO6拷贝数/μι、IXlO5拷贝数/μι、IXlO4拷贝数/μ 1，其Ct值分别为20. 27、23. 52、26. 90。检测的样品Ct值为29. 87，换算为每毫升检测样本中含有7. 48 X IO4拷贝个病原体。实施例3试剂盒线性范围、线性、特异性、灵敏性、准确性、精密性、重复性的检测(I)特异性特异性评价组装的风疹病毒检测试剂盒用于检测风疹病毒以及其它病毒，结果表明该试剂盒的特异性很高。 表I检测风疹病毒抗原含量方法特异性试验450nm吸光度结果
权利要求
1.一种风疹病毒(Rubella virus, RV)检测试剂盒，其特征在于它包括RNA提取液、RT-PCR反应液、混合酶、RV阳性标准模板、阳性对照和阴性对照；其中所述的RT-PCR反应液中引物(PI、P2)和探针(RVFP)为风疹病毒E2基因片段，其中引物Pl序列为5’ -ATCTGCGGGCTGTCCACCA-3’，引物 P2 序列为5’ -AGCAAGTCGCACGTCCCAT-3’，RV 荧光标记探针 RVFP 序列为5’ -AAGACGGCTGGACTTGTCGT-3’ ； 或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延长的序列； 或者与上述序列同源性大于85%的序列； 或者上述序列的碱基互补序列； 或者使用上述所有序列中的任意ー种或两种以上的组合。
2.根据权利要求I所述风疹病毒诊断试剂盒，其特征在于所述的荧光探针标记的发光基团为 FAM、JOE、Fluoresce in、TET、Cy3、Cy 5、ROX、Rhodamine、Rhodamine RecURhodamine6G、Orengon Green 488、OrengonGreen 500、Orengon Green 514、Texas Red、HEX、TAMRA、Inosine、FITC 或 Acridine orange 中的任意一种；突光萍灭基团为 TAMRA、BHoi、BHO2>BHQ3、DABCYL 或 DABSYL 中的任意ー种。
3.根据权利要求2所述风疹病毒诊断试剂盒，其特征在于所述的混合酶由I IOOU的逆转录酶Superscriptlll和IN IOU的Taq DNA聚合酶配制而成。
4.根据权利要求3所述风疹病毒诊断试剂盒，其特征在于所述的RV标准阳性模板为含有风疹病毒E2a基因片段SEQ ID NO. I与PGEM-T Easy载体构成的PGEMT181-1重组质粒 SEQ ID NO. 2，SEQ ID NO. I 序列为5’ -ATCTGCGGGCTGTCCACCACCGCCCAGTACCCGCCTACCCGGTTTGGCTGCGCCATGCGGTGGGGCCTCCCCCCCTGGGAACTGGTCGTTCTTACCGCCCGCCCCGAAGACGGCTGGACTTGTCGTGGCGTGCCCGCCCATCCAGGTACCCGCTGCCCCGAACTGGTGAGCCCCATGGGACGTGCGACTTGCT-3’ 。
5.根据权利要求4所述风疹病毒诊断试剂盒，其特征在于所述风疹病毒诊断试剂盒通过质粒转化大肠杆菌DH5 Q増殖后用超纯质粒提取试剂盒提取纯化，用紫外分光光度计测A260定量并稀释至IX IO7拷贝数/μ 1，-20°C保存，使用前10倍稀释至IX IO6拷贝数/μ I、I X IO5 拷贝数/μ I、I X IO4 拷贝数/μ I。
6.根据权利要求5所述风疹病毒诊断试剂盒，其特征在于所述的阳性对照为RV阳性培养物(灭活)；阴性对照为无模板荧光定量反应液。
7.根据权利要求6所述风疹病毒诊断试剂盒，其特征在于所述的RNA提取液为提取效率>80%、RNA完整性好、稳定性好且操作简便的核酸提取液。
8.根据权利要求I 7任一所述的风疹病毒诊断试剂盒的用途，其特征在于，所述风疹病毒诊断试剂盒定性或定量检测风疹病毒的应用通过以下步骤进行 (a)采RNA提取液从待测标本中提取RNA； (b)将RV标准阳性模板进行10 20倍梯度稀释； (c)分别取第(a)步中的RNA和第(b)步中的RV阳性标准品，加入到含有混合酶的RT-PCR反应体系中，与标准阴性质控品一起用荧光定量PCR检测仪进行RT-PCR检测； (d)通过比较待测样本和标准品的循环域值而对待测样品的起始拷贝数进行定量，在荧光定量PCR仪自带软件生成的标准曲线上找出待测样品对应的拷贝数浓度。
9.根据权利要求8所述的风疹病毒诊断试剂盒的用途，其特征在于所述的待检样本为含漱液或消 化道抽提液。
全文摘要
本发明公开了一种风疹病毒(Rubella virus,RV)检测试剂盒及其用途，具体地说，该试剂盒采用荧光PCR技术提供包括RNA提取液、RT-PCR反应液、混合酶、RV阳性标准模板、阳性对照和阴性对照，其中所述的RT-PCR反应液中引物(P1、P2)和探针(RVFP1、RVP2)为风疹病毒E2基因片段，其中引物P1序列为5’-ATCTGCGGGCTGTCCACCA-3’，引物P2序列为5’-AGCAAGTCGCACGTCCCAT-3’，RV荧光标记探针RVFP序列为5’-AAGACGGCTGGACTTGTCGT-3’。采用本发明提供的试剂盒，可快速、准确有效地的对风疹病毒感染患者进行病毒RNA检测，从而为风疹病毒感染诊断和预防提供了一种新的途径，因此具有十分广阔的应用前景。
文档编号C12Q1/68GK102851393SQ20121027058
公开日2013年1月2日 申请日期2012年7月31日 优先权日2012年7月31日
发明者刘昊智 申请人:刘昊智