专利名称：乳酸脱氢酶检测试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及ー种人体内酶含量的检测试剂盒，尤其涉及ー种乳酸脱氢酶测定试剂盒及其制备方法，本发明还涉及该乳酸脱氢酶測定试剂盒在检测人体内乳酸脱氢酶含量的使用方法，属于人体内乳酸脱氢酶含量的检测领域。
背景技术：
乳酸脱氢酶(LDH)是ー种糖酵解酶，存在于机体所有组织细胞的胞质内，其中以肾脏含量较高。乳酸脱氢酶是能催化乳酸脱氢生成丙酮酸的酶，几乎存在于所有组织中。当人体出现急性肝炎、急性心肌梗死、充血性心功能不全、肌营养不良、多发性肌炎、恶性肿瘤、肝癌、肺癌、急性白血病、淋巴肉瘤、恶性贫血、肝硬化、阻塞性黄疸、肠梗阻等疾病时，血液中的LDH活力会升高；当人体内分泌失调、过度劳累或睡眠不佳时会导致血清中LDH活力会降低，因此可以通过检测血清中LDH的活力来观察诊断疾病。 文献报道了一种用速率法測定血清中乳酸脱氢酶的方法(颜兴伟，韩书炉等；速率法測定血清中乳酸脱氢酶，上海医学检验杂志，1991)，该方法虽然比较简单，但是由于所用的辅酶I溶液需要临时配制，会给检测工作带来ー些不必要的麻烦，且每批新配制的试剂无法保证试剂的稳定，会对结果造成一定程度的影响，从而对其推广应用造成了ー些不良影响。
发明内容
本发明的目的之ー是提供ー种乳酸脱氢酶检测试剂盒；本发明的目的之ニ是提供ー种制备所述乳酸脱氢酶检测试剂盒的方法。本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的—种乳酸脱氢酶检测试剂盒，由彼此独立的试剂I和试剂II组成；其中，试剂I的组分包括生物缓冲剂，金属离子络合物，乳酸脱氢酶的反应底物，表面活性剤，乳酸脱氢酶酶活激活剂，防腐剂和水；试剂II的组分包括生物缓冲剂，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化态，表面活性剤，防腐剂和水。为了达到更好的检测效果，每I升试剂I中各组分的用量优选为生物缓冲剂l-100g，金属离子络合物0. 5-10g,乳酸脱氢酶的反应底物0. 05-5g,表面活性剂0. 55-22. 5g，乳酸脱氢酶酶活激活剂0. 01-0. 2g，防腐剂0. 25-lOg，余量为水；进ー步优选的，每I升试剂I中各组分的用量为生物缓冲剂5_50g，金属离子络合物0. 8-4g，乳酸脱氢酶的反应底物0. 2-lg，表面活性剂0. 25-22g，乳酸脱氢酶酶活激活剂 0. 05-0. lg，防腐剤 0. 75-5g ；最优选的，每I升试剂I中各组分的用量为生物缓冲剂23g，金属离子络合物2g，乳酸脱氢酶的反应底物0. 5g，表面活性剂5. 5g，乳酸脱氢酶酶活激活剂0. 075g,防腐剂2. 6g0每I升试剂II中各组分的用量优选为生物缓冲剂l-100g，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化态0. 5-15g，表面活性剂0. l_5ml，防腐剂0. l_10g，余量为水；进ー步优选的，每I升试剂II中各组分的用量为生物缓冲剂5_50g，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化态l-10g，表面活性剂0. 5-2ml，防腐剂0. 5-2g;最优选的，每I升试剂II中各组分的用量为生物缓冲剂20g，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化态5g,表面活性剂I. Oml,防腐剂lg。试剂I或试剂II中所述的生物缓冲剂是能够用于中和酸碱的各种生物缓冲剂，例如可以是三羟甲基甲胺基こ磺酸(TES)、2-(N-吗啡啉)こ磺酸(MES)、N-(2-羟こ基)哌嗪-N’ -2-こ烷磺酸(HEPES)、三羟甲基甲胺基丙磺酸(TAPS)、哌嗪-1，4- ニ羟基丙磺酸(POPSO)等各种常用生物缓冲液，为了达到更好的检测效果，试剂I中所述的生物缓冲剂优选为三羟甲基甲胺基こ磺酸，试剂II中所述的生物缓冲剂优选为2-(N-吗啡啉)こ磺酸。试剂I中所述的金属离子络合物能够络合检测样本中的ニ价金属离子，以减少ニ价金属离子造成的干扰；因此，能够络合ニ价金属离子的各种金属离子络合物均能够适用 于作为试剂I中的金属离子络合物，例如こニ胺四こ酸ニ钠，氨基三こ酸、ニ亚こ基三胺五こ酸及其盐等，本发明优选こニ胺四こ酸ニ钠(EDTA)作为试剂I中的金属离子络合物。试剂I中所述的乳酸脱氢酶的反应底物可以是L-乳酸锂、丙酮酸等，本发明优选L-乳酸锂作为试剂I中所述的乳酸脱氢酶的反应底物。试剂I或试剂II中所述的表面活性剂主要起到促进检测样本中各物质的溶解，达到減少样本浊度对测定结果的影响的目的；因此，现有的具有增溶性质的表面活性剂都可作为试剂I或试剂II中所述的表面活性剤，例如，曲拉通X-100、こ基苯基聚こニ醇等。为了达到更好的效果，试剂I中优选将曲拉通X-100和こ基苯基聚こニ醇组合在一起使用，其中，每I升试剂I中曲拉通X-100的用量为0. 05 2. 5m 1，优选为0. 15 2ml，最优选为0. 5ml ;每I升试剂I中こ基苯基聚こニ醇的用量为0. 5 20g，优选为I 10g，最优选为IOg0试剂II中所述的表面活性剂优选为曲拉通X-100。试剂I所述的乳酸脱氢酶酶活激活剂能够起到激活乳酸脱氢酶酶活性的作用，从而使检测反应能够顺利进行；因此，任何ー种能够激活乳酸脱氢酶酶活的激活剂均可作为试剂I中的乳酸脱氢酶酶活激活剂；优选的，本发明中所述的乳酸脱氢酶酶活激活剂为含有Mg2+的无机化合物，更优选为MgCl2. 6H20。试剂II中所述的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化态(MD+)用于在乳酸脱氢酶催化的反应过程中被还原为NADH。试剂I或试剂II中所述的防腐剂主要是为了防止细菌滋生导致的产品变质，所以任何一种能起到防止细菌滋生作用的防腐剂均能适用于本发明；优选的，本发明试剂I或试剂II中所述的防腐剂为咪唑烷基服。本发明检测试剂盒中所用到的每种组分均能通过商业途径从生物试剂公司或医药公司购买得到。本发明的另外ー个目的是提供ー种制备所述乳酸脱氢酶检测试剂盒的方法，包括(I)制备试剂I :将各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，定容至I升；(2)制备试剂II :将各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，定容至I升；(3)将试剂I和试剂II単独分装，密封，即得。
本发明的又一目的是提供所述乳酸脱氢酶检测试剂盒检测样品中乳酸脱氢酶含量的检测方法，包括以下步骤向待检测样本(校准管以校准品做样品，空白以蒸馏水为样品)中依次加入试剂I和试剂II混匀，其中，待检测样品用量为6uL，试剂I用量为180 320uL，试剂II用量为40 120uL ;37°C恒温60秒后，空白管调零，波长340nm，测定初始吸光度，然后在120秒内准确测定平均每分钟吸光度变化率AA/min。根据两点校准品浓度和对应吸光度变化率△ A/min，采用两点线性校准模式确定工作曲线，样本吸光度变化在标准工作曲线上相对应的浓度值即为测定浓度。本发明检测试剂盒采用双试剂模式有效地避免了非特异性反应的干扰，同时可以最大限度減少来自样本本身浊度的干扰，保证了测定结果的稳定可靠，具有稳定性好，精确度高，线性测试范围宽，重复性好，抗干扰性强等优点。此外，本发明检测试剂盒在检测过程中不需要对样本进行预稀释，方便临床使用，操作简单、快速，适用于全自动生化分析仪，具有较大的临床实用价值。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进ー步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例I乳酸脱氢酶检测试剂盒的制备I、试剂I的制备按所述用量取各组分
三羟甲基甲胺基乙磺酸(TES)23g
乙ニ胺四乙酸ニ钠(EDTA-2Ha)2g
L-乳酸锂0. 5g
曲拉通 X-1000,5ml
MgCl2. 6M200. 075g
乙基苯基聚乙ニ醇Wonidet P-40) Sg
咪唑烷基陈2. 6g将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至I升，密封保存，备用。2、试剂II的制备按所述用量取各组分2-( -吗啡啉)乙磺酸2 Og
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化态(NAD+)Sg
曲拉通 X-100I. Oml 味唑烷基脲Ig将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至I升，密封保存，备用。实施例2乳酸脱氢酶检测试剂盒的制备I、试剂I的制备按所述用量取各组分
三舞f基甲胺基乙磺酸(TES)ISg
乙ニ胺四乙酸ニ钠(EDTA-2Na)Ig
L-乳酸裡I, Sg
曲拉通X-100ImI
MgCh. 6H.00. 005g 乙基苯基聚乙ニ醇(NonWet P-40) IOg
咪唑烷基脲5g将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至I升，密封保存，备用。2、试剂II的制备按所述用量取各组分
2-(N-吗啡啉)乙磺酸35g
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化态(NAD+ )Sg
曲拉通X-1002 In I咪唑烷基脲4g将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至I升，密封保存，备用。实施例3乳酸脱氢酶检测试剂盒的制备I、试剂I的制备按所述用量取各组分三峯甲基甲驗基乙磺酸《TES)4 Og
乙ニ胺四乙酸ニ钠(EDTA-2Na)I. Sg
L-乳酸裡2g
曲拉通 X-1000. 8ml
MgCl2. 6H>00. 04g
乙基苯基聚乙ニ醇(Nonidet P-補)15g
咪11 坐烷基脲3g将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至I升，密封保存，备用。
2、试剂II的制备按所述用量取各组分
2- (N-吗啡啉)乙磺酸25g
烟酜胺腺嘌呤二核苷酸氧化态(NAD+)6g
曲拉通 X-1001.6ml
咪唑烷基脲5g将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至I升，密封保存，备用。实施例4乳酸脱氢酶检测试剂盒的制备I、试剂I的制备按所述用量取各组分
三羟甲基甲胺基乙磺酸(TES)Ig
乙ニ胺四乙酸ニ钠(BDTA-2Na)0. Sg
L-乳酸锂G. 05g
曲拉通)(-1000. OSnilMgCl2JH2O0. Olg
乙基苯基聚乙ニ醇(Nonidet P-40)0. Sg
咪唑烷基脲G. 25g将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至I升，密封保存，备用。2、试剂II的制备按所述用量取各组分2-( -吗啡啉〉乙磺酸Ig
烟醜胺腺嘌呤二核鲁酸氧化态(NAD+ )0. Sg
曲拉通 X-1000. Iml 味唑烷基脲0. Ig
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至I升，密封保存，备用。实施例5乳酸脱氢酶检测试剂盒的制备I、试剂I的制备按所述用量取各组分
三羟甲基甲驗基乙磺《4 (TES)IOOg
乙ニ驗四こ酸ニ钠(EDTA-2跑)IOg
L-乳酸锂Sg
衝拉通 X-1002. 5ml
MgCl2. 6H2O0. 2 g
乙基笨基聚乙ニ醇(Nonidet P-40)20g
咪唑烷基鳳I Og将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至I升，密封保存，备用。2、试剂II的制备按所述用量取各组分
2-(N-吗啡啉)乙磺酸IOOg
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化态(NAD+ )15g 曲拉通X-1005ml
咪唑烷基脲IOg将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至I升，密封保存，备用。实施例6乳酸脱氢酶检测试剂盒的制备I、试剂I的制备按所述用量取各组分三摩甲基甲黢基乙磺酸(TES)SOg
乙ニ胺四乙酸ニ钠(EDTA-2Na)4g
レ乳酸锂Ig
曲拉通X-1 002 ml
MgCl,. 61-1,00. I g
乙基苯基聚乙ニ醇(Nonidet P-40)IOg
咪唑烷基緣Sg将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至I升，密封保存，备用。
2、试剂II的制备按所述用量取各组分
2-0-吗绯啉)乙磺酸IOOg
烟酰胺腺嘌呤二核香酸氣化态(WAD+)ISg
曲拉通X-1005ml
咪唑烷基藤IOg将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至I升，密封保存，备用。实施例7乳酸脱氢酶检测试剂盒的制备I、试剂I的制备按所述用量取各组分
三羟甲基甲胺基乙磺酸(TES)Sg
乙ニ胺四乙酸ニ钠(EDTA-2Na)0. 8|
L-乳酸锂0. 2g
曲拉通)(-1000. 15ml
MgCl2. 6H200. 05 g
乙基笨基聚乙ニ醇(Nonidet P-40)Ig
咪唑烷基脲0. 75g将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至I升，密封保存，备用。2、试剂II的制备按所述用量取各组分
权利要求
1.一种乳酸脱氢酶检测试剂盒，其特征在于由彼此独立的试剂I和试剂II组成；其中，试剂I的组分包括生物缓冲剂，金属离子络合物，乳酸脱氢酶的反应底物，表面活性齐U，乳酸脱氢酶酶活激活剂，防腐剂和水；试剂II的组分包括生物缓冲剂，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化态，表面活性剂，防腐剂和水。
2.按照权利要求I所述的乳酸脱氢酶检测试剂盒，其特征在于每I升试剂I中各组分的用量为生物缓冲剂Ι-lOOg，金属离子络合物O. 5-10g，乳酸脱氢酶的反应底物O.05-5g，表面活性剂O. 55-22. 5g，乳酸脱氢酶酶活激活剂O. 01-0. 2g，防腐剂O. 25-10g,余量为水； 每I升试剂II中各组分的用量为生物缓冲剂l-100g，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化态O.5-15g，表面活性剂O. l_5ml，防腐剂O. l_10g，余量为水。
3.按照权利要求2所述的乳酸脱氢酶检测试剂盒，其特征在于每I升试剂I中各组分的用量为生物缓冲剂5-50g，金属离子络合物O. 8-4g，乳酸脱氢酶的反应底物O. 2-lg，表面活性剂O. 25-22g，乳酸脱氢酶酶活激活剂O. 05-0. Ig,防腐剂O. 75_5g ； 每I升试剂II中各组分的用量为生物缓冲剂5-50g，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化态l-10g，表面活性剂O. 5-2ml，防腐剂O. 5_2g。
4.按照权利要求3所述的乳酸脱氢酶检测试剂盒，其特征在于每I升试剂I中各组分的用量为生物缓冲剂23g，金属离子络合物2g，乳酸脱氢酶的反应底物O. 5g，表面活性剂5. 5g，乳酸脱氢酶酶活激活剂O. 075g,防腐剂2. 6g ； 每I升试剂II中各组分的用量为生物缓冲剂20g，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化态5g，表面活性剂I. 0ml，防腐剂lg。
5.按照权利要求1-4任何一项的乳酸脱氢酶检测试剂盒，其特征在于试剂I中所述的生物缓冲剂为三羟甲基甲胺基乙磺酸，试剂II中所述的生物缓冲剂为2-(N-吗啡啉)乙磺酸。
6.按照权利要求1-4任何一项的乳酸脱氢酶检测试剂盒，其特征在于所述的金属离子络合物是乙二胺四乙酸二钠；所述乳酸脱氢酶的反应底物是L-乳酸锂或丙酮酸。
7.按照权利要求1-4任何一项的乳酸脱氢酶检测试剂盒，其特征在于试剂I中所述的表面活性剂由曲拉通X-100和乙基苯基聚乙二醇组成；其中，每I升试剂I中曲拉通X-100的用量为O. 05-2. 5ml，优选为O. 15_2ml，最优选为O. 5ml ;每I升试剂I中乙基苯基聚乙二醇的用量为O. 5-20g，优选为l-10g，最优选为IOg ;试剂II中所述的表面活性剂为曲拉通X-100。
8.按照权利要求1-4任何一项的乳酸脱氢酶检测试剂盒，其特征在于试剂I中所述乳酸脱氢酶酶活激活剂为含有Mg2+的无机化合物，优选为MgCl2. 6H20。
9.按照权利要求1-4任何一项的乳酸脱氢酶检测试剂盒，其特征在于试剂I或试剂II中所述的防腐剂为咪唑烷基脲。
10.一种制备权利要求1-4任何一项所述乳酸脱氢酶检测试剂盒的方法，包括(I)制备试剂I :将各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，定容至I升；(2)制备试剂II :将各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，定容至I升；(3)将试剂I和试剂II单独分装，密封，即得。
全文摘要
本发明公开了乳酸脱氢酶检测试剂盒及其制备方法。本发明试剂盒由彼此独立的试剂Ⅰ和试剂Ⅱ组成；其中，试剂Ⅰ的组分包括生物缓冲剂，金属离子络合物，乳酸脱氢酶的反应底物，表面活性剂，乳酸脱氢酶酶活激活剂，防腐剂和水；试剂Ⅱ的组分包括生物缓冲剂，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化态，表面活性剂，防腐剂和水。本发明检测试剂盒采用双试剂模式有效避免了非特异性反应的干扰，同时可最大限度减少来自样本本身浊度的干扰，保证了测定结果的稳定可靠，具有稳定性好，精确度高，线性测试范围宽，重复性好，抗干扰性强等优点。此外，本发明检测试剂盒在检测过程中不需对样本进行预稀释，方便临床使用，操作简单、快速，适用于全自动生化分析仪。
文档编号C12Q1/32GK102766677SQ20121027038
公开日2012年11月7日 申请日期2012年7月31日 优先权日2012年7月31日
发明者华权高, 舒芹, 许可 申请人:武汉生之源生物科技有限公司