嗜肺军团菌检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明为一种嗜肺军团菌的快速检测试剂盒，它采用一对军团菌特异引物扩增16S?rRNA基因上的区域，在该扩增片段内针对嗜肺军团菌特异序列设计一对杂交探针，锚定探针3’端标记FAM荧光基团；猝灭探针5'端标记BHQ1，3’端磷酸化；通过实时荧光PCR熔解曲线分析来检测样本中的嗜肺军团菌。该检测试剂盒主要包括DNA提取液、荧光PCR反应液、阴性对照及阳性对照。其检测方法包括DNA提取、荧光PCR反应检测、熔解曲线分析3步。该检测试剂盒操作简便快速，结果直观，且灵敏度高，特异性好，稳定性好，可以广泛应用于临床及环境水样本中嗜肺军团菌的快速鉴定。
【专利说明】嗜肺军团菌检测试剂盒【技术领域】
[0001]本发明属于医学领域，具体是一种实时荧光PCR熔解曲线检测嗜肺军团菌的试剂盒。
【背景技术】
[0002]军团菌是一种兼性胞内寄生菌，是引起人类军团菌病的重要病原体。近年来，军团菌病在世界各地时有爆发流行，我国已将其列入14种新发传染病之一。据国外报道，院内不明原因肺炎感染有10%是由军团菌引起。目前已知军团菌虽有52个种，70多个血清型。但临床上80%以上军团菌感染是由嗜肺军团菌引起。因此，嗜肺军团菌的鉴定对于军团菌病诊断具有重大价值。
[0003]目前军团菌的检测鉴定方法主要有分离培养、血清抗体检测、尿抗原检测、分子检测技术等。但以上的检测方法均存在不足，如直接分离培养，所需时间长达3~10天，且阳性率低；尿抗原检测仅对嗜肺军团菌I型具有特异性；分子技术也存在各自的缺点，如传统的聚合酶链反应(PCR)检测操作繁琐、耗时长、易污染；基于荧光共振能量转移原理的杂交探针标记技术价格昂贵、操作复杂；DNA测序是最为准确的军团菌种鉴定方法，但耗时较长，分析困难，不能适应临床上的快速要求，其他分子检测方法均存在各种不足。基于这些检测方法建立的试剂盒，均也存在以上的各种不足。近年来，随着分子生物学技术的发展，实时荧光定量PCR具有快速、准确、灵敏、特异等优点，自发明以来在微生物检测研究中得到广泛应用。
【发明内容】
[0004]该检测嗜肺军团菌的试剂盒具有简便、快速、敏感性和特异性高，且成本低廉、可直接用于临床标本及环境水样本检测。
[0005]本发明是这样实现的:一种嗜肺军团菌核测试剂盒，基于荧光共振能量转移原理，选取一种猝灭荧光基团，采用由上游引物、下游引物组成的一对引物及由锚定探针、猝灭探针组成的一对标记探针，建立新型的实时荧光PCR熔解曲线法对嗜肺军团菌进行检测；
[0006]所述上游引物为5’ -AGGGTTGATAGGTTAAGAGC-3，，
`[0007]所述下游引物为5’ -CCAACAGCTAGTTGACATCG-3’，
[0008]所述锚定探针为5’ -CCCATACTCGAGTCAACC (FAM) -3，，
[0009]所述猝灭探针为5’ - (BHQl) TATTATCTGACCGTCCCAG (ph) -3，。
[0010]嗜肺军团菌检测试剂盒，是基于实时荧光PCR方法建立的试剂盒，其组分为DNA提取液、荧光PCR缓冲液、阴性对照及阳性对照，其中，DNA提取液的成分包括5%CheleX-100溶液、IOmM三羟甲基氨甲烷盐酸盐、0.1mM乙二胺四乙酸二钠、0.1%叠氮钠、200 μ g/ml蛋白酶K，荧光PCR缓冲液包括上游引物0.1~0.3 μ Μ、下游引物I~3 μ Μ、锚定探针0.3~
0.5 μ Μ、猝灭探针0.1~0.3 μ Μ、三羟甲基氨甲烷盐酸20mM、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸
0.3~0.6mM、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷0.3~0.6mM、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸0.3~0.6mM、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸0.3~禮、氯化镁3~6mM、热启动酶I~5U，阴性对照0.5ml,为IXlO4个菌/ml的大肠杆菌培养物，阳性对照0.5ml，为I X IO4个菌/ml的嗜肺军团菌培养物。(此处中的mM为毫摩尔每升；μ M为微摩尔每升，下同)
[0011]嗜肺军团菌检测试剂盒，检测结果判定时，熔解曲线分析程序为95°C Imin和40 0C 2min，以1°C /5s的速度，从40°C升温至85°C ;嗜肺军团菌的Tm值均为57°C，其它非嗜肺军团菌及非军团菌均无57°C的Tm值。
[0012]本发明提供一种检测嗜肺军团菌的试剂盒，其特征在于所描述的时荧光PCR熔解曲线法根据嗜肺军团菌16srRNA基因保守序列设计引物和探针，选取一种猝灭荧光基团代替原有的杂交探针荧光标记物，建立新型的嗜肺军团菌检测试剂盒。该检测嗜肺军团菌的试剂盒具有简便、快速、敏感性和特异性高，且成本低廉、可直接用于临床标本及环境水样本检测。
[0013]本发明描述的嗜肺军团菌新检测试剂盒，其主要特点如下:[0014](I)高特异性:本发明通过对16株嗜肺军团菌(包括15个血清型)、35株非嗜肺军团菌及12株其它非军团菌进行基因分型检测，该试剂盒能准确的鉴定出嗜肺军团菌，说明该检测试剂盒特异性很高；
[0015](2)高敏感性和稳定性:本发明建立的熔解曲线分析法检测嗜肺军团菌试剂盒，其最低检测限度达到IOOfg/μ 1，且结果稳定可靠；
[0016](3)检测试剂盒操作简便快速；
[0017](4)检测范围广:作为一种嗜肺军团菌快速检测试剂盒，本发明可以广泛应用于临床及环境水样本中嗜肺军团菌的快速鉴定。
【具体实施方式】
[0018]本发明的实时荧光PCR熔解曲线法快速检测嗜肺军团菌试剂盒是一个整体。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
[0019]1.本发明所需主要试剂的准备
[0020](I)引物探针合成
[0021]通过对嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌及其它非军团菌的16srRNA序列比对分析，寻找嗜肺军团菌高度保守且具有很好同源性的的序列，根据杂交探针荧光PCR设计的原则，设计一对嗜肺军团菌特异探针，锚定探针3’端标记FAM，猝灭探针5’端标记猝灭基团BHQl，3’端磷酸化。比此序列长一些或短一些，但包含了该序列的核心部分即能鉴别嗜肺军团菌的特异碱基序列，另外，荧光基团也并不限于此，可以是有相同作用的替代荧光基团和猝灭基团。
[0022]委托商业序列合成公司合成一下引物和探针序列:
[0023]
【权利要求】
1.一种嗜肺军团菌核测试剂盒，其特征在于:基于荧光共振能量转移原理，选取一种猝灭荧光基团，采用由上游引物、下游引物组成的一对引物及由锚定探针、猝灭探针组成的一对标记探针，建立新型的实时荧光PCR熔解曲线法对嗜肺军团菌进行检测；
2.如权利要求1所述的嗜肺军团菌检测试剂盒，其特征在是基于实时荧光PCR方法建立的试剂盒，其组分为DNA提取液、荧光PCR缓冲液、阴性对照及阳性对照，其中，DNA提取液的成分包括5%Chelex-100溶液、IOmM三羟甲基氨甲烷盐酸盐、0.1mM乙二胺四乙酸二钠、0.1%叠氮钠、200μ g/ml蛋白酶K，荧光PCR缓冲液包括上游引物0.1~0.3 μ M、下游引物I~3 μ M、锚定探针0.3~0.5 μ Μ、猝灭探针0.1~0.3 μ Μ、三羟甲基氨甲烷盐酸20mM、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸0.3~0.6mM、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷0.3~0.6mM、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸0.3~0.6mM、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸0.3~禮、氯化镁3~6mM、热启动酶I~5U，阴性对照0.5ml,为IX IO4个菌/ml的大肠杆菌培养物，阳性对照0.5ml，为I X IO4个菌/ml的嗜肺军团菌培养物。
3.如权利要求1所述的嗜肺 军团菌检测试剂盒，其特征在于检测结果判定时，熔解曲线分析程序为95°C Imin和40 °C 2min,以1°C /5s的速度，从40°C升温至85°C ;嗜肺军团菌的Tm值均为57°C，其它非嗜肺军团菌及非军团菌均无57°C的Tm值。
【文档编号】C12R1/01GK103509853SQ201210346619
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2012年9月18日 优先权日:2012年9月18日
【发明者】赵利伟, 胡朝晖, 朱庆义, 戈立秀 申请人:南京金域医学检验所有限公司