专利名称：一种角质酶的分离纯化方法
技术领域：
本发明涉及一种以疏水色谱和阴离子交换为主要手段角质酶的分离纯化方法，属于生物技术分离纯化领域。
背景技术：
角质酶(Cutinase，EC3. I. I. 74)是一种能破坏角质多聚物分子的酯键使其水解为单体和小分子寡聚体的胞外诱导水解酶，它主要存在于植物病原菌中，是病原菌侵入植物时用以突破植物表皮第一道屏障角质所需要的酶。角质酶属于a/β水解酶家族，可降解不溶性甘油三酯、可溶性酯和角质等聚酯，它作为一种多功能水解酶，在食品及化工等诸多领域都具有广泛的应用。角质酶既可水解不溶性多聚体角质的酯键，也可以作用于其他长链、短链脂肪酸酯、乳化的甘油三酯等。除了水解反应外，角质酶还能参与酸与醇的酯化。作为一种能裂解酶，角质酶主要应用在以下几个方面
I、在生物催化方面的应用在工业产品及工艺中，角质酶具有独特的应用优势。从可溶性合成酯类到不溶性长链甘油的多种酯，角质酶对其均有水解作用，角质酶可在较低水分活度下进行脂肪和油的专酯化或醇类的(立体)选择性酯化；可进行丁酸和2-丁醇、甲基_、乙基_、丙基丙酸酯等物质之间的酯化、专酯化反应，也可参与合成聚合物表面活性剂及含有一个或多个手性中心的药物。2、在农业化学品工业中的应用大量性质不同的化合物，例如除草剂、杀虫剂和植物生物物质等，沉积或吸附在植物表面，它们对植物的作用很大程度取决其通过角质层的能力。根据这一特点，人们研究了含有角质酶的制剂，开发用于农用化学品的增效剂及辅剂、植物防御反应的诱导物、除草剂及植物生长的抑制剂等。3、在护理用品行业的应用由于角质酶具有脂肪酶的性能，已被用作洗衣店的解脂肪酶或洗碟的清洁剂，用于去除脂肪。角质酶及其采用酶工程获得的变体已经开发用于生产清洁剂或去污剂，联合利华等公司拥有其相关专利。4、在食品工业和农产品深加工中的应用角质酶在乳制品工业中牛奶脂肪的水解，以及油化学工业中具有应用潜力；可用于低附加值的农副产品加工废物转化成有价值的脂肪酸等物质。5、在塑料废物的生物降解和废水处理方面的应用每年全球大约产生140，000，OOOt的合成塑料，这些合成塑料大都性质稳定，对环境造成的污染已经成为环境保护所面临的一大问题。聚己内酯(polylcaprolactone,PCL)是其中一种合成聚酯，有研究发现它可被一些植物病原真菌降解。Murphy等人研究证实植物病原真菌茄病镰刀菌降解聚己内酯过程中发挥作用的正是角质酶，因此，在PCL生物降解方面，人们对角质酶的用途有了新的认识。此外,Teles等人应用角质酶对皮革工业的固体废物进行了脱脂研究。6、在纺织工业中的应用纺织工业传统的对棉织物进行前处理是采用强碱高温处理工艺，它存在许多不足之处，传统工艺，流程复杂冗长，设备庞大、纤维损伤大；棉织物前处理水耗和能耗大等。用酶对棉织物进行前处理是国内外公认的21世纪的环保型染整技术，对纺织专用酶制剂的需求必将逐渐增大，推广应用前景广阔。棉花的角质层直接影响棉花的可纺性，2002年首次报道假单胞菌所产角质酶用于棉纤维角质层生物煮练的研究，研究表明它可有效提高原棉表层的润湿性。在生物煮练过程中，角质酶与果胶裂解酶具有较好的协同效应，亦可用于去除织物表面的聚酯类污点，提高织物的质量。纺织工业是我国的传统产业和支柱产业，在国内生产总值和外贸出口总值中占有重要比例。纺织工业废水主要来自染整工段,包括退浆、煮炼、漂白、丝光、染色、印花和整理等，污染物主要是棉毛等纺织纤维上的污物、盐类、油类和脂类，以及投加的各种上浆料、染料、助剂、酸、碱等，废水量大，是严重的污染源之一。为了使棉纤维获得优良的润湿性和白度，需要在前处理过程中去除角质层、果胶质和蛋白质等各种伴生物。传统的煮炼工艺用烧碱、肥皂、表面活性剂等的水溶剂，在120°C、pH值10 13的条件下对棉纤维进行煮炼。煮炼废水量大，呈强碱性，BOD和COD均高达每升数千毫克。 使用生物煮练技术，最大的好处是提高染色的均匀性及减轻环境污染。随着社会对纺织品和环境的环保问题日益重视，对纺织品的高档化和高附加值加工的追求，酶用于纺织中，易于生物降解，不会污染环境与纺织品，另一方面生物酶能赋予被加工的纺织品许多独特的效果，独有的高催化效率和高度的专一性，使生物酶的应用具有光明的前景。2004年6月中旬在奥地利格拉茨召开的第三届国际纺织技术交流会(INTB)上Bucheri^PKinuGrancaric等专家对棉纤维生物煮练中的酶制剂分别做了相关研究报告。在生物煮炼方面，有报道角质酶用于纺织工业中棉纤维角质层生物煮练，可提高原棉的润湿性，与果胶裂解酶具有较好的协同效应，能更好地去除角质层、果胶层，保证织物的良好纺织性能，与其他纺织酶制剂复合使用可实现纺织的绿色加工。国内外的研究主要集中在发酵条件的优化以及基因工程菌的筛选，而对于角质酶分离纯化的报道较少。中国专利CN100537758C介绍了一种角质酶的分离纯化方法，其以疏水色谱为主要手段分离纯化野生菌所产角质酶，该方法只适用于嗜热子囊菌Thermobif idafusca发酵液的分离纯化。
发明内容
本发明提供一种角质酶的分离纯化方法，采用疏水色谱和阴离子交换为主要手段，有效的分离角质酶发酵液，适用于镰刀菌属Fusarium、炭疽菌属Colletotrichum、链核盘菌属Monilinia、曲霉属Aspergillus、黑星菌属Venturia、链格孢菌属Alternaria、葡萄孢菌属Botrytis、壳二孢属Ascochyt发酵来源的发酵液,扩大了分离纯化的范围，为之后的蛋白质测序、性质应用分析和基因工程菌构建奠定基础。本发明主要的工艺步骤为(I)将角质酶发酵液离心去除菌体后，向粗酶液中加入经研磨烘干后的固体硫酸铵，使硫酸铵达到90% -95%饱和度，冷冻离心，收集沉淀，将沉淀用适量Tris-HCl缓冲液溶解后，倒入经煮沸处理的透析袋中，在相同缓冲溶液中透析，透析后离心，收集上清液；
(2)向透析后的酶液加入研磨后的固体硫酸铵至20%-60%饱和度，尽快上样于经30%硫酸铵饱和的Tris-HCl缓冲液预平衡的Phenyl-Sepharose疏水柱中，先用30%硫酸铵饱和度的Tris-HCl缓冲液平衡至A28tl值不变后，再用30%硫酸铵饱和的Tris-HCl缓冲液与不含硫酸铵的Tris-HCl缓冲液线性洗 脱150min，最后用Tris-HCl缓冲液洗脱，流速为2. 5mL/min, Phenyl-Sepharose疏水层析后,测定280nm吸收峰处集中管中酶液的活性，对活性较高的收集液进行SDS-PAGE，确认蛋白纯度，若SDS-PAGE结果显示多条蛋白带，则收集酶活性较高的酶液，进行DEAE-Sepharose弱阴离子交换柱层析；(3)步骤(2)中酶活较高的收集液经浓缩后在Tris-HCl缓冲液中充分透析后，加入同种缓冲液平衡的DEAE-Sepharose层析柱中，酶蛋白经缓冲液洗脱至A28tl不变后，用Tris-HCl缓冲液和含有O. 2-1. OmoI/L NaCl的同一洗脱液线性梯度洗脱，流速为2. 5mL/min,收集活性峰。本发明相对于现有报道工艺，具有以下创新点(I)本发明方法适用范围突破了以往的仅限于单一发酵来源的发酵液，适用于镰刀菌属 Fusarium、炭疽菌属 Colletotrichum、链核盘菌属 Monilinia、曲霉属 Aspergillus、黑星菌属Venturia、链格孢菌属Alternaria、葡萄孢菌属Botrytis、壳二孢属Ascochyt菌株发酵液；(2)工艺简单，灵活性高。本发明分离纯化工艺根据不同发酵液在硫酸铵沉淀和疏水色谱的分离情况来决定是否采用之后的弱阴离子柱层析分离。
具体实施例方式实例I(I)将由镰刀属Fusarium oxysporium发酵获得的角质酶发酵液离心去除菌体后，向粗酶液中加入经研磨烘干后的固体硫酸铵，使硫酸铵达到90%饱和度，冷冻离心，收集沉淀，将沉淀用适量Tris-HCl (pH值为8. O, 20mM)缓冲液溶解后，倒入经煮沸处理的透析袋中，在相同缓冲溶液中透析4小时，透析后离心，收集上清液；(2)向透析后的酶液加入经研磨烘干后的固体硫酸铵至30%饱和度，上样于30%硫酸铵饱和的Tris-HCl缓冲液(pH值为8. O, IOmM)预平衡的Phenyl-Sepharose疏水柱中，先用30%硫酸铵饱和度的Tris-HCl缓冲液(pH值为8. O, IOmM)平衡至A28tl值不变后，再用30%硫酸铵饱和的Tris-HCl缓冲液(pH值为8. 0，IOmM)与不含硫酸铵的同一缓冲液线性洗脱150min，最后用Tris-HCl缓冲液(pH值为8. O, IOmM)洗脱，流速为2. 5mL/min,Phenyl-Sepharose疏水层析后,测定280nm吸收峰处集中管中酶液的活性,对活性较高的收集液进行SDS-PAGE，确认蛋白纯度，SDS-PAGE结果显示多条蛋白带，收集酶活性较高的酶液，进行DEAE-Sepharose弱阴离子交换柱层析；(3)将上一步酶活较高的收集液经浓缩后在Tris-HCl缓冲液(pH值为8. 0，IOmM)中充分透析后，加入同种缓冲液平衡的DEAE-Sepharose层析柱中，酶蛋白经缓冲液洗脱至A280不变后，用Tris-HCl缓冲液(pH值为8. 0，IOmM)和含有O. 2mol/L NaCl的同一洗脱液线性梯度洗脱，流速为2. 5mL/min，收集活性峰。实施例2(I)将炭疽菌属Colletotrichum gloeosporioides发酵而来的角质酶发酵液离心出去菌体后，向粗酶液中加入经研磨烘干后的固体硫酸铵，使硫酸铵达到95%饱和度，冷冻离心，收集沉淀，将沉淀用适量Tris-HCl缓冲液(pH值为8. 0,40mM)溶解后，倒入经煮沸处理的透析袋中，在相同缓冲溶液中透析4小时，透析后离心，收集上清液；(2)向透析后的酶液加入经研磨烘干后的固体硫酸铵至20% -60%饱和度，上样于30%硫酸铵饱和的Tris-HCl缓冲液(pH值为8. O, 20mM)预平衡的Phenyl-S^harose疏水柱中，先用30%硫酸铵饱和度的Tris-HCl缓冲液(pH值为8. 0,20mM)平衡至A28tl值不变后，再用30%硫酸铵饱和的Tris-HCl缓冲液(pH值为8. 0，20mM)与不含硫酸铵的同一缓冲液线性洗脱150min，最后用Tris-HCl缓冲液(pH值为8. 0,20mM)洗脱，流速为2. 5mL/min,Phenyl-Sepharose疏水层析后,测定280nm吸收峰处集中管中酶液的活性,对活性较高的收集液进行SDS-PAGE，确认蛋白纯度。实施例3(I)将链核盘菌属Monilinia fructicola角质酶发酵液离心出去菌体后，向粗酶 液中加入经研磨烘干后的固体硫酸铵，使硫酸铵达到92%饱和度，冷冻离心，收集沉淀，将沉淀用适量Tris-HCl缓冲液(pH值为7. 0,20mM)溶解后，倒入经煮沸处理的透析袋中，在相同缓冲溶液中透析2小时，透析后离心，收集上清液；(2)向透析后的酶液加入经研磨烘干后的固体硫酸铵至50%饱和度，上样于30%硫酸铵饱和的Tris-HCl缓冲液(pH值为7. 0,20mM)预平衡的Phenyl-S印harose疏水柱中，先用30%硫酸铵饱和度的Tris-HCl缓冲液平衡至A28tl值不变后，再用30%硫酸铵饱和的Tris-HCl缓冲液(pH值为7. 0,20mM)与不含硫酸铵的同一缓冲液线性洗脱150min，最后用Tris-HCl缓冲液洗脱,流速为2. 5mL/min, Phenyl-Sepharose疏水层析后,测定280nm吸收峰处集中管中酶液的活性，对活性较高的收集液进行SDS-PAGE，确认蛋白纯度。实施例4(I)将曲霉属Aspergillus oryzae角质酶发酵液离心出去菌体后，向粗酶液中加入经研磨烘干后的固体硫酸铵，使硫酸铵达到94%饱和度，冷冻离心，收集沉淀，将沉淀用适量Tris-HCl缓冲液(pH值为7.0，20mM)溶解后，倒入经煮沸处理的透析袋中，在相同缓冲溶液中透析一段时间，透析后离心，收集上清液；(2)向透析后的酶液加入经研磨烘干后的固体硫酸铵至20% -60%饱和度，上样于30%硫酸铵饱和的Tris-HCl缓冲液(pH值为7. 0,8mM)预平衡的Phenyl-S^harose疏水柱中，先用30%硫酸铵饱和度的Tris-HCl缓冲液平衡至A28tl值不变后，再用30%硫酸铵饱和的Tris-HCl缓冲液(pH值为7. 0,8mM)与不含硫酸铵的同一缓冲液线性洗脱150min，最后用Tris-HCl缓冲液(pH值为7. 0,8mM)洗脱，流速为2. 5mL/min ；(3)上一步酶活较高的收集液经浓缩后在Tris-HCl缓冲液(pH值为 . 0，8mM)中充分透析后，加入同种缓冲液平衡的DEAE-Sepharose层析柱中，酶蛋白经缓冲液洗脱至A280不变后，用Tris-HCl缓冲液和含有O. 5mol/L NaCl的同一洗脱液线性梯度洗脱，流速为2. 5mL/min,收集活性峰。实施例5(I)将Ascochyta rabiei角质酶发酵液离心出去菌体后，向粗酶液中加入经研磨烘干后的固体硫酸铵，使硫酸铵达到95%饱和度，冷冻离心，收集沉淀，将沉淀用适量Tris-HCl缓冲液(pH值为7. 0,20mM)溶解后，倒入经煮沸处理的透析袋中，在相同缓冲溶液中透析5小时，透析后离心，收集上清液；(2)向透析后的酶液加入经研磨烘干后的固体硫酸铵至30%饱和度，上样于30%硫酸铵饱和的Tris-HCl缓冲液(pH值为7. 0,8mM)预平衡的Phenyl-Sepharose疏水柱中，先用30%硫酸铵饱和度的Tris-HCl缓冲液(pH值为7. 0,8mM)平衡至A28tl值不变后，再用30%硫酸铵饱和的Tris-HCl缓冲液(pH值为7. 0,8mM)与不含硫酸铵的同一缓冲液线性洗脱150min，最后用Tris-HCl缓冲液(pH值为7. 0,8mM)洗脱，流速为2. 5mL/min ；(3)上一步酶活较高的收集液经浓缩后在Tris-HCl缓冲液(pH值为7. 0，12mM)中充分透析后，加入同种缓冲液平衡的DEAE-Sepharose层析柱中，酶蛋白经缓冲液洗脱至 A280不变后，用Tris-HCl缓冲液(pH值为7. 0,8mM)和含有O. 4mol/L NaCl的同一洗脱液线性梯度洗脱，流速为2. 5mL/min，收集活性峰。
权利要求
1.一种角质酶的分离纯化方法，其特征在干 (1)将角质酶发酵液离心去除菌体后，向粗酶液中缓慢加入经研磨烘干后固体硫酸铵，使硫酸铵达到一定浓度，冷冻离心，收集沉淀，将沉淀用适量TriS-HCl缓冲液溶解后，倒入经煮沸处理后的透析袋中，相同缓冲溶液中透析，透析后离心，收集上清液。
(2)向步骤(I)透析后的酶液加入经研磨烘干后的固体硫酸铵至一定饱和度，上样于经30%硫酸铵饱和的Tris-HCl缓冲液预平衡的Phenyl-S^harose疏水柱，上样结束后先用30%硫酸铵饱和度的Tris-HCl缓冲液平衡至A280值不变后，再用30%硫酸铵饱和的Tris-HCl缓冲液与不含硫酸铵的Tris-HCl缓冲液线性洗脱150min，最后用Tris-HCl缓冲液洗脱，流速为2. 5mL/min，測定280nm吸收峰处集中管中酶液的活性，对活性较高的收集液进行SDS-PAGE，确认蛋白纯度，若SDS-PAGE结果显示多条蛋白帯，则收集酶活性较高的酶液，进行DEAE-Sepharose弱阴离子交换柱层析。
(3)将步骤(2)酶活较高的收集液浓缩后在Tris-HCl缓冲液中充分透析，加入同种缓冲液平衡的DEAE-S印harose层析柱中，酶蛋白经缓冲液洗脱至A280不变后，用Tris-HCl缓冲液和含有NaCl的同一洗脱液线性梯度洗脱，流速为2. 5mL/min,收集活性峰，即为所制备的电泳纯角质酶溶液。
2.根据权利要求I所述的角质酶分离纯化方法，其特征在于角质酶发酵液的来源可以为铼刀菌属Fusarium、炭疽菌属Colletotrichum、链核盘菌属Monilinia、曲霉属Aspergillus、黑星菌属Venturia、链格孢菌属Alternaria、葡萄孢菌属Botrytis、壳ニ孢属Ascochyt的真菌发酵。
3.根据权利要求I所述的角质酶分离纯化方法，其特征在于3个步骤所实施的温度均要求在0-4°C。
4.根据权利要求I所述的角质酶分离纯化方法，其特征在于3个步骤中所述的Tris-HCl缓冲液的pH值范围为7. 0-9.0，其中步骤(I)中Tris-HCl缓冲液的浓度为20-40mM，步骤⑵和(3)中Tris-HCl缓冲液的浓度为8_20mM。
5.根据权利要求I所述的角质酶分离纯化方法，其特征在于步骤(I)中硫酸铵的浓度为90% -95% ;透析时间为2-10小时。
6.根据权利要求I所述的角质酶分离纯化方法，其特征在于步骤(2)中向透析后的酶液加入经研磨后烘干的固体硫酸铵至一定饱和度指的饱和度为20% -60%。
7.根据权利要求I所述的角质酶分离纯化方法，其特征在于步骤(3)中NaCl的浓度为 O. 2-1. OmoI/Lο
全文摘要
本发明提供一种镰刀菌属Fusarium、炭疽菌属Colletotrichum、链核盘菌属Monilinia、曲霉属Aspergillus、黑星菌属Venturia、链格孢菌属Alternaria、葡萄孢菌属Botrytis、壳二孢属Ascochyt来源的角质酶发酵液的分离纯化方法，其特点在于选用硫酸铵沉淀和疏水色谱进行分离纯化后，可根据角质酶纯度选用弱阴离子交换进行进一步的分离纯化，得到了电泳纯的角质酶溶液，可根据后续需求进行进一步的加工。本发明适用范围广，方法简单，酶纯度高，是一种高效、简洁的酶分离纯化方法。
文档编号C12R1/645GK102839163SQ20121036150
公开日2012年12月26日 申请日期2012年9月26日 优先权日2012年9月26日
发明者王秀英 申请人:四川金稞生物科技有限公司