一种割罐法发酵生产韦兰胶的方法
【专利摘要】本发明涉及一种利用产碱杆菌发酵生产韦兰胶并采用丙酮进行后提取的方法，步骤如下：S1.菌种保藏斜面的制备：将产碱杆菌ATCC31555接种到培养基斜面上，于30℃恒温培养2-4天备用；S2.用接种环于上述斜面上挑一环菌体至一级种子液体培养基中，30℃培养24小时，得到一级液体种子；S3.将一级种子按10％接种量接于二级种子液体培养基中，28-38℃培养12-24个小时，得到二级液体种子；S3.上述种子用于接种至灭菌后的5L发酵罐中发酵；S4.发酵20-36个小时后，将5L小罐中发酵液排出1-3.5L，再补加1-3.5L液体发酵培养基，如此重复2-3次，发酵结束；S5.发酵液的后提取。该方法缩短发酵周期，提高生产效率和得率。
【专利说明】一种割罐法发酵生产韦兰胶的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用产碱杆菌发酵产韦兰胶的方法，特别涉及一种割罐法发酵生产韦兰胶，并用丙酮提取的方法。
【背景技术】 [0002]微生物代谢胶也叫生物合成胶，许多微生物在生长代谢过程中，在不同的外部条件下都能产生一定量的各种多糖。微生物多糖安全无毒，有独特的理化性质，且与植物和动物多糖相比，微生物多糖的生产受地理环境、气候、自然灾害等因素的影响较小，产量及质量都很稳定。韦兰胶是一种新型微生物多糖。韦兰胶的结构骨架由D-葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、D-葡萄糖和L-鼠李糖单元组成。韦兰胶中含有2.8% -7.5%乙酰基，11.6% -14.9%的葡萄糖醛酸，甘露糖、葡萄糖和鼠李糖的摩尔比例为1: 2: 2。
[0003]韦兰胶是美国Kelco公司80年代继黄原胶、结冷胶之后开发的最有市场前景的微生物多糖之一，迄今为止美国的Kelco公司是韦兰胶全球唯一的生产、供应商。韦兰胶具有优良的触变性、悬浮性、水溶性等流变性能，且具有卓越的稳定性，市场前景广阔。它主要作为增稠剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂、润滑剂、成膜剂和粘合剂应用于工农业的各个方面，尤其在食品、混凝土、石油、石墨等工业中有广泛的应用前景。
[0004]目前国外仅有一些关于其结构和应用性的专利报道。在国内的研究还停留在实验室阶段。无法形成工业化生产。主要是因为用于发酵的菌种对原料的要求较高且产率太低，导致发酵液中的韦兰胶浓度较低，另外发酵液中的副产物太多。这些因素进一步造成提取的成本居高不下.另一方面国内韦兰胶成品质量较差。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于克服上述已有技术的不足之处，提供一种高效可行并可降低韦兰胶生产成本，减小投资，益于生产应用的割罐法发酵生产韦兰胶的方法，并采用丙酮沉淀的方法提取，有效去除了发酵液中的杂质和色素。
[0006]为实现上述目的本发明所采用的技术方案如下:
[0007]一种割罐法发酵生产韦兰胶的方法，其特征在于:依次步骤如下:
[0008]S1.菌种保藏斜面的制备:将产碱杆菌(Alcaligenes sp.) ATCC31555接种到培养基斜面上，于30°C恒温培养2-4天待用；斜面培养基组成包括，单位IL:蔗糖15g，酵母粉3g,蛋白胨5g,牛肉膏5g,琼脂15g,用蒸懼水定容至1L, pH值7.0 ;其中所用菌种:鞘氨醇单胞菌(Alcaligenes sp.)ATCC31555 ；
[0009]S2.上述斜面用于接种至灭菌后的一级液体种子培养基中，一级液体种子培养基组成包括，单位1L:葡萄糖15-20g，酵母粉4-8g，牛肉膏4-8g，蛋白胨3-6g，K2HPO4 2_3g，MgSO4 0.01-0.03g，用蒸馏水定容至lL，pH值7.0 ;将液体种子培养基于115°C、15min灭菌再冷却；然后用接种环从菌种保藏斜面上挑I环菌体接入上述冷却的液体种子培养基中，500ml规格的摇瓶装液量是100ml，摇瓶于30°C、转速为150rpm的摇床上培养24h，得到一级液体种子；[0010]S3.上述一级液体种子用于接种至灭菌后的二级级液体种子培养基中，二级液体种子培养基组成包括，单位IL:葡萄糖15-20g，酵母粉4-8g，蛋白胨3-6g，K2HPO4 2_3g，MgSO4 0.01-0.038，用蒸馏水定容至11^，pH值7.0 ;将液体种子培养基于115°C、15min灭菌再冷却；然后将一级液体种子按10%接种量接入上述冷却的二级液体种子培养基中，500ml规格的摇瓶装液量是100ml，摇瓶于28-38 °C、转速为120_200rpm的摇床上培养12-24h，得到二级液体种子；
[0011]S4.上述二级液体种子培养基用于接种至灭菌后的5L发酵罐中，发酵罐培养基组成包括，单位 IL:玉米淀粉水解液 250-400ml, NaNO3 3.0-4.0g, MgSO40.2-0.4g，K2HPO4
4.5-6.0g，CaCO3 1.0-2.0g，FeS04 0.001-0.005g，蛋白胨 5_10g，用蒸馏水定容至 3L，pH 值
5.0-8.0，将发酵罐培养基于115°C、15min灭菌再冷却；然后按照体积比5-12%的接种量将液体培养基接入上述冷却的发酵罐培养基中，发酵温度28-38°C，溶氧控制在30-40% ；
[0012]S5.发酵14-30个小时后，将发酵液排出1_2.5L，并将灭过菌的1_2.5L液体发酵培养基加入5L小罐中，继续在28-38°C条件下培养10-20个小时；上述操作重复1_3次。
[0013]S6.发酵结束，将发酵液用水稀释0-3倍，用旋涡式搅拌桨以300-400转/分钟速度搅拌，再匀速缓慢加入0.8-1.3倍体积的丙酮，搅拌半小时,离心将上清液倒掉，固体烘干后粉碎。得到韦兰胶的产量为20-40g/L。
[0014]与现有技术相比，本发明采用割罐法生产韦兰胶，可以大大提高底物的利用率，并减少种子制备的繁琐，相当于普通发酵3-4个周期的效果，有效的提高生产效率，降低了成本。并且不需要复杂的设备，后处理方法简单，用丙酮可以有效去除了发酵液中的各种杂质，脱色效果也非常明显，使得到产品的纯度有了很大的提高，同时提高了韦兰胶的收率，进一步降低了成本。该方法具有很高的实际应用价值，市场优势非常明显。
【具体实施方式】
[0015]以下结合实施例，对依据本发明提供的【具体实施方式】详述如下:
[0016]实施例1
[0017]S1.菌种保藏斜面的制备:将产碱杆菌(Alcaligenes sp.) ATCC31555接种到培养基斜面上，于30°C恒温培养2-4天待用；斜面培养基组成包括，单位IL:蔗糖15g，酵母粉3g,蛋白胨5g,牛肉膏5g,琼脂15g,用蒸懼水定容至1L, pH值7.0 ;其中所用菌种:鞘氨醇单胞菌(Alcaligenes sp.)ATCC31555 ；
[0018]S2.上述斜面用于接种至灭菌后的一级液体种子培养基中，一级液体种子培养基组成包括，单位IL:葡萄糖15g,酵母粉4g,牛肉膏4g,蛋白胨3g, K2HPO4 2g, MgSO4 0.01g,用蒸馏水定容至lL，pH值7.0 ;将液体种子培养基于115°C、15min灭菌再冷却；然后用接种环从菌种保藏斜面上挑I环菌体接入上述冷却的液体种子培养基中，500ml规格的摇瓶装液量是100ml，摇瓶于30°C、转速为150rpm的摇床上培养24h，得到一级液体种子；
[0019]S3.上述一级液体种子用于接种至灭菌后的二级级液体种子培养基中，二级液体种子培养基组成包括，单位IL:葡萄糖15g，酵母粉4g，蛋白胨3g，K2HP042g，MgSO4 0.01gj蒸馏水定容至lL，pH值7.0 ;将液体种子培养基于115°C、15min灭菌再冷却；然后将一级液体种子按10%接种量接入上述冷却的二级液体种子培养基中，500ml规格的摇瓶装液量是100ml，摇瓶于30°C、转速为200rpm的摇床上培养16h，得到二级液体种子；
[0020]S4.上述二级液体种子培养基用于接种至灭菌后的5L发酵罐中，发酵罐培养基组成包括，单位 IL:玉米淀粉水解液 250ml，NaNO3 3.0g, MgSO4 0.2g，Κ2ΗΡ044.5g，CaCO3 1.0g,FeS04 0.0Olg，蛋白胨5g，用蒸馏水定容至3L，pH值7.0，将发酵罐培养基于115°C、15min灭菌再冷却；然后按照体积比12%的接种量将液体培养基接入上述冷却的发酵罐培养基中，发酵温度38 °C，溶氧控制在30% ；
[0021]S5.发酵14个小时后，将发酵液排出2L，并将灭过菌的2L液体发酵培养基加入5L小罐中，继续在38°C条件下培养15个小时；
[0022]S6.将步骤S5.重复3次。
[0023]S7.发酵结束，将发酵液原液用旋涡式搅拌桨以的400转/分钟速度搅拌，再匀速缓慢加入0.8倍丙酮，搅拌半小时，离心将上清液倒掉，固体烘干粉碎。得到韦兰胶产品为220g。
[0024]实施例2
[0025]S1.菌种保藏斜面的制备:将产碱杆菌(Alcaligenes sp.) ATCC31555接种到培养基斜面上，于30°C恒温培养2-4天待用；斜面培养基组成包括，单位IL:蔗糖15g，酵母粉3g,蛋白胨5g,牛肉膏5g,琼脂15g,用蒸懼水定容至1L, pH值7.0 ;其中所用菌种:鞘氨醇单胞菌(Alcaligenes sp.)ATCC31555:
[0026]S2.上述斜面用于接种至灭菌后的一级液体种子培养基中，一级液体种子培养基组成包括，单位11^:葡萄糖2(^，酵母粉88，牛肉膏88，蛋白胨68，K2HPO4 3g，MgSO4 0.03g,用蒸馏水定容至lL，pH值7. 0 ;将液体种子培养基于115°C、15min灭菌再冷却；然后用接种环从菌种保藏斜面上挑I环菌体接入上述冷却的液体种子培养基中，500ml规格的摇瓶装液量是100ml，摇瓶于30°C、转速为150rpm的摇床上培养24h，得到一级液体种子；
[0027]S3.上述一级液体种子用于接种至灭菌后的二级级液体种子培养基中，二级液体种子培养基组成包括，单位IL:葡萄糖20g，酵母粉8g，蛋白胨6g，K2HP043g, MgSO40.03g，用蒸馏水定容至lL，pH值7.0 ;将液体种子培养基于115°C、15min灭菌再冷却；然后将一级液体种子按10%接种量接入上述冷却的二级液体种子培养基中，500ml规格的摇瓶装液量是100ml，摇瓶于28°C、转速为120rpm的摇床上培养12h，得到二级液体种子；
[0028]S4.上述二级液体种子培养基用于接种至灭菌后的5L发酵罐中，发酵罐培养基组成包括，单位 IL:玉米淀粉水解液 400ml，NaNO3 4.0g, MgSO40.4g，K2HPO4 6.0g, CaCO3 2.0g,FeS04 0.005g，蛋白胨10g，用蒸馏水定容至3L，pH值8.0，将发酵罐培养基于115°C、15min灭菌再冷却；然后按照体积比5%的接种量将液体培养基接入上述冷却的发酵罐培养基中，发酵温度28 V，溶氧控制在40 % ；
[0029]S5.发酵30个小时后，将发酵液排出2.5L，并将灭过菌的2.5L液体发酵培养基加入5L小罐中，继续在28°C条件下培养20个小时。
[0030]S6.将步骤S5.重复2次。
[0031 ] S7.发酵结束，将发酵液稀释3倍，用旋涡式搅拌桨以的400转/分钟速度搅拌，再匀速缓慢加入1.3倍丙酮，搅拌半小时，离心将上清液倒掉，固体烘干粉碎。得到韦兰胶产品为330g。
[0032] 实施例3[0033]S1.菌种保藏斜面的制备:将产碱杆菌(Alcaligenes sp.) ATCC31555接种到培养基斜面上，于30°C恒温培养2-4天待用；斜面培养基组成包括，单位IL:蔗糖15g，酵母粉3g,蛋白胨5g,牛肉膏5g,琼脂15g,用蒸懼水定容至1L, pH值7.0 ;其中所用菌种:鞘氨醇单胞菌(Alcaligenes sp.)ATCC31555 ；
[0034]S2.上述斜面用于接种至灭菌后的一级液体种子培养基中，一级液体种子培养基组成包括，单位IL:葡萄糖18g，酵母粉5g，牛肉膏6g，蛋白胨4g，K2HPO4 2.5g，MgSO4 0.02g,用蒸馏水定容至lL，pH值7.0 ;将液体种子培养基于115°C、15min灭菌再冷却；然后用接种环从菌种保藏斜面上挑I环菌体接入上述冷却的液体种子培养基中，500ml规格的摇瓶装液量是100ml，摇瓶于30°C、转速为150rpm的摇床上培养24h，得到一级液体种子；
[0035]S3.上述一级液体种子用于接种至灭菌后的二级级液体种子培养基中，二级液体种子培养基组成包括，单位IL:葡萄糖18g，酵母粉5g，蛋白胨4g，K2HPO4 2.5g，MgSO4
0.02g，用蒸馏水定容至lL，pH值7.0 ;将液体种子培养基于115°C、15min灭菌再冷却；然后将一级液体种子按10%接种量接入上述冷却的二级液体种子培养基中，500ml规格的摇瓶装液量是100ml，摇瓶于35°C、转速为150rpm的摇床上培养18h，得到二级液体种子；
[0036]S4.上述二级液体种子培养基用于接种至灭菌后的5L发酵罐中，发酵罐培养基组成包括，单位 IL:玉米淀粉水解液 350ml，NaNO3 3.5g，MgSO40.3g，K2HPO4 5.0g, CaCO3 1.5g，FeSO4 0.004g,蛋白胨8g，用蒸馏水定容至3L，pH值5.0，将发酵罐培养基于115°C、15min灭菌再冷却；然后按照体积比8%的接种量将液体培养基接入上述冷却的发酵罐培养基中，发酵温度35 °C，溶氧控制在30% ；
[0037]S5.发酵20个小时后，将发酵液排出1L，并将灭过菌的IL液体发酵培养基加入5L小罐中，继续在35°C条件下培养10个小时；
[0038]S6.将步骤S5.重复3次。
[0039]S7.发酵结束，将发酵液稀释I倍，用旋涡式搅拌桨以的350转/分钟速度搅拌，再匀速缓慢加入I倍丙酮，搅拌半小时，离心将上清液倒掉，固体烘干粉碎。得到韦兰胶产品为 175g。
[0040]实施例4
[0041]S1.菌种保藏斜面的制备:将产碱杆菌(Alcaligenes sp.) ATCC31555接种到培养基斜面上，于30°C恒温培养2-4天待用；斜面培养基组成包括，单位IL:蔗糖15g，酵母粉3g,蛋白胨5g,牛肉膏5g,琼脂15g,用蒸懼水定容至1L, pH值7.0 ;其中所用菌种:鞘氨醇单胞菌(Alcaligenes sp.)ATCC31555 ；
[0042]S2.上述斜面用于接种至灭菌后的一级液体种子培养基中，一级液体种子培养基组成包括，单位1L:葡萄糖18g，酵母粉6g，牛肉膏6g，蛋白胨5g，K2HPO4 2g，MgSO4 0.01g,用蒸馏水定容至lL，pH值7.0 ;将液体种子培养基于115°C、15min灭菌再冷却；然后用接种环从菌种保藏斜面上挑I环菌体接入上述冷却的液体种子培养基中，500ml规格的摇瓶装液量是100ml，摇瓶于30°C、转速为150rpm的摇床上培养24h，得到一级液体种子；
[0043]S3.上述一级液体种子用于接种至灭菌后的二级级液体种子培养基中，二级液体种子培养基组成包括，单位IL:葡萄糖18g，酵母粉6g，蛋白胨5g，K2HPO4 2g, MgSO4 0.01g,用蒸馏水定容至lL，pH值7.0 ;将液体种子培养基于115°C、15min灭菌再冷却；然后将一级液体种子按10%接种量接入上述冷却的二级液体种子培养基中，500ml规格的摇瓶装液量是100ml，摇瓶于30°C、转速为180rpm的摇床上培养20h，得到二级液体种子；
[0044]S4.上述二级液体种子培养基用于接种至灭菌后的5L发酵罐中，发酵罐培养基组成包括，单位 IL:玉米淀粉水解液 300ml, NaNO3 3g，MgSO4 2g，Κ2ΗΡ045.5g，CaCO3 2g，FeS04
0.003g，蛋白胨7g，用蒸馏水定容至3L，pH值7.5，将发酵罐培养基于115°C、15min灭菌再冷却；然后按照体积比10%的接种量将液体培养基接入上述冷却的发酵罐培养基中，发酵温度30 V，溶氧控制在40 %。
[0045]S5.发酵18个小时后，将发酵液排出1.5L，并将灭过菌的1.5L液体发酵培养基加入5L小罐中，继续在30°C条件下培养12个小时；
[0046]S6.将步骤S5.重复I次。
[0047]S7.发酵结束，将发酵液稀释2倍，用旋涡式搅拌桨以的300转/分钟速度搅拌，再匀速缓慢加入1.2倍丙酮，搅拌半小时，离心将上清液倒掉，固体烘干粉碎。得到韦兰胶IlOgo
[0048]上述参照实施例对割罐法发酵生产韦兰胶的方法的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可根据所限定范围例举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范`围之内。
【权利要求】
1.一种割罐法发酵生产韦兰胶的方法，其特征在于:依次步骤如下: . 51.菌种保藏斜面的制备:将产碱杆菌ATCC31555接种到培养基斜面上，于30°C恒温培养2-4天待用；斜面培养基组成包括:蔗糖15g，酵母粉3g，蛋白胨5g，牛肉膏5g，琼脂15g，用蒸馏水定容至1L，pH值7.0 ;所用菌种:鞘氨醇单胞菌ATCC31555 ； .52.上述斜面用于接种至灭菌后的一级液体种子培养基中，一级液体种子培养基组成包括:葡萄糖15_20g，酵母粉4-8g，牛肉膏4-8g，蛋白胨3-6g，K2HPO4 2_3g，MgSO4.0.01-0.03g，用蒸馏水定容至lL，pH值7.0 ; 将液体种子培养基于115°C、15min灭菌再冷却；然后用接种环从菌种保藏斜面上挑I环菌体接入上述冷却的液体种子培养基中，500ml规格的摇瓶装液量是100ml，摇瓶于.30°C、转速为150rpm的摇床上培养24h，得到一级液体种子； .53.上述一级液体种子用于接种至灭菌后的二级级液体种子培养基中，二级液体种子培养基组成包括:葡萄糖15_20g，酵母粉4-8g，蛋白胨3-6g，K2HPO4 2_3g，MgSO4.0.01-0.03g，用蒸馏水定容至lL，pH值7.0 ; 将液体种子培养基于115°C、15min灭菌再冷却；然后将一级液体种子按10%接种量接入上述冷却的二级液体种子培养基中，500ml规格的摇瓶装液量是100ml，摇瓶于28_38°C、转速为120-200rpm的摇床上培养12_24h，得到二级液体种子； .54.上述二级液体种子培养基用于接种至灭菌后的5L发酵罐中，发酵罐培养基组成包括:玉米淀粉水解液 250-400ml, NaNO3 3.0-4.0g, MgSO40.2-0.4g, K2HPO4 4.5-6.0g, CaCO3.1.0-2.0g, FeS04 0.001-0.005g，蛋白胨 5_10g，用蒸馏水定容至 3L，pH 值 5.0-8.0 ； 将发酵罐培养基于115°C、15min灭菌再冷却；然后按照体积比5-12%的接种量将液体培养基接入上述冷却的发酵罐培养基中，发酵温度28-38°C，溶氧控制在30-40% ； .55.发酵14-30个小时后，将发酵液排出1-2.5L，并将灭过菌的1_2.5L液体发酵培养基加入5L小罐中，继续在28-38°C条件下培养10-20个小时；上述操作重复1_3次。 .56.发酵结束，将发酵液用水稀释0-3倍，用旋涡式搅拌桨以300-400转/分钟速度搅拌，再匀速缓慢加入0.8-1.3倍体积的丙酮，搅拌半小时，离心将上清液倒掉，固体烘干后粉碎，得到韦兰胶的产量为20-40g/L。
【文档编号】C12R1/05GK103695498SQ201210364669
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2012年9月27日 优先权日:2012年9月27日
【发明者】李红芬, 梁军军, 刘云 申请人:天津科百生物科技研发有限公司