专利名称：一种可催化不对称还原反应的球孢白僵菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种真菌，尤其涉及一种可催化不对称还原反应的球孢白僵菌及其应用。
背景技术：
4-氯-3-羟基丁酸乙酯中含有性质活泼的氯原子，使之在一些不对称合成中得到广泛应用，成为许多手性药物的重要手性中间体。S-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(S-CHBE)是合成Slagenins B和C，HMG-CoA还原酶抑制剂的关键手性中间体，它还可以还原为1，4_ 二氢吡啶型β阻断剂。R-4-氯-3-羟基丁酸乙酯可以作为合成L-肉碱、R-Y-氨基-β-羟基丁酸、(-)_大内酰亚胺A的关键手性中间体，并能转化为(+)-负霉素。
度洛西汀，化学名为(+) -S-N-甲-Y -基_ (I-萘氧基)-2-噻吩基盐酸盐，是欣百达中的活性成分，它是一种5-羟色胺(5-ΗΤ)和去甲肾上腺素(NE)再摄取的双重抑制药， 该药不仅可以治疗抑郁症，还可用于治疗压力性尿失禁和糖尿病性周围神经病疼痛。S-氮， 氮-二甲基-3-羟基-(2-噻吩)-I-丙胺盐酸盐(S-DAN)是合成度洛西汀重要手性中间体， 具有重要的应用价值。
不对称还原反应主要有二种方法
化学不对称还原法需用铑、钌等价格昂贵的金属作为催化剂，另外需用高压的氢，对反应器要求较高。
生物催化不对称还原法利用提纯后的商品酶和微生物细胞中的酶进行不对称还原，其中酶催化的不对称还原反应需要添加昂贵的辅酶而且转化率较低；微生物催化的不对称还原反应是通过微生物全细胞中酶的立体选择性来实现，同时辅酶的循环由细胞自动完成，进行不对称还原反应时只需加入少量廉价的碳源(如蔗糖或葡萄糖)作为辅助底物即可，所以生物催化因其反应条件温和立体选择性强在合成手性化合物中有很大的优势。 但是筛选到具有高立体选择性的优良微生物菌株比较困难。
目前可用于催化不对称还原反应的菌种已经较多报道，Yasohara等人采用预热的木兰假丝酵母(Candida magnoliae)还原4_氯乙酰乙酸乙酯(C0BE),获得产物 S-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，对映体过量值可达86% e. e.，但是转化率比不进行热处理时的有所下降(日本，公告号JP2000175693A，公告日2000年6月27日)。PankaJ Soni等人筛选出产脱氢酶酵母(CandidatropicaliS)PBR-2，其可以对度洛西汀中间体进行催化反应，产物对映体过量值> 99% e. e.,转化率为84-88% (Enantioselective reduction of acetophenoneand its derivatives with a new yeast isolate Candida tropicalis PBR-2MTCC5158)。
由于野生型酵母细胞含有多种醛/羰基还原酶，转化产物很难获得单一光学纯化合物，光学纯度较低，因此限制了其在生产上的应用。目前已经有很多人通过构建工程菌来获得较高对映体过量值的产物，Shimizu S等人从Sporobolomyces salmonicolor中分离提取得到了可以催化生成对映体纯R-CHBE的酶及其基因，并在大肠杆菌中表达了该基因，在水/有机溶剂两相体系中将COBE还原为R-CHBE，对映体过量值可达到92% e. e.以上(Stereoselective Reduction of Ethyl 4-Chloro-3_0xobutanoate by aMicrobial Aldehyde Reductase in an Organic Solvent-ffater DiphasicSystem)。Wada M等构建了重组菌株，其催化产物(S)-3-羟基-3-(2-噻吩)丙酸乙酯的对映体过量值>98% e. e.，产率 80% (Clonging and overexpressionof the Exiguobacterium sp. F42Gene encoding a new short chaindehydrogenase, which catalyzs the strereoselective reduction of ethyl3-oxo_3-(2-thienyl)propanoate to ethyl (S)-3-hydroxy-3-(2-thienyl) prppanoate)。但是使用表达外源蛋白的工程菌或对细胞进行其它基因改造，菌体的稳定性很差，有时反应的转化率不是很理想，同时存在食品安全方面的隐患。发明内容
本发明提供了一种可催化不对称还原反应的球孢白僵菌，该菌株可以表达高立体选择性的羰基还原酶，解决传统野生菌株无法还原得到单一光学纯化合物，光学纯度较低的问题。
一种可催化不对称还原反应的菌株，分类命名为球孢白僵菌(Beauveria bassiana),完整命名为球抱白僵菌(Beauveria bassiana)Bea-a-2,此菌株已于2012年7 月12日保存在位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC NO. 6345。
本发明菌株属半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、白僵菌属，在沙氏培养基上，菌落呈绒毛状、丛卷毛状至粉状，白色至浅黄色，偶成淡粉色。
利用该微生物菌株可以不对称还原4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)生成高光学纯度的 S-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(S-CHBE)，还可以不对称还原N，N- 二甲基-3-氧代-3-(2-噻吩)-I-丙胺盐酸盐(DKTP)生成高光学纯度的S-N，N-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩)-I-丙胺盐酸盐(S-DAN)。
本发明还提供了以分别以COBE和DKTP为底物，所述球孢白僵菌Bea-a_2在催化合成S-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(S-CHBE)和S-N，N- 二甲基-3-羟基-3- (2-噻吩)-I-丙胺盐酸盐(S-DAN)中的应用。
具体包括将球孢白僵菌Bea-a-2接种于培养基中进行扩大培养，收集菌体悬浮于缓冲液中，加入底物进行反应，反应后分离得到产物。
底物浓度和菌体的浓度影响底物转化的速率，优选地，所述底物的浓度为3g/L 35g/L，更优选为5g/L 30g/L。优选地，所述菌体的浓度为15g/L 250g/L，更优选为 150 250g/L，最优选为 200g/L。
反应的温度和时间同样影响产物的得率和反应速率，温度主要是影响菌体中酶的催化效率，优选为25°C 45°C，更优选为25 30°C。所述反应的时间优选为Ih 48h，更优选为10 30小时。
优选地，所述的扩大培养采用的培养基为SDY液体培养基。
以COBE为底物时，分离方法为
采用乙酸乙酯萃取，并对萃取液进行旋蒸处理，收集得到无色油状液体。
以DKTP为底物时，分离方法为4
将反应体系的pH值调至11以上，再用乙酸乙酯萃取，对萃取液进行旋蒸处理，收集得到透明结晶体。
与现有技术相比较，本发明的有益效果为
本发明球孢白僵菌在催化不对称还原反应中，可以获得高光学纯度的产物，且底物的转化率高。
本发明球孢白僵菌可以不对称还原COBE生成高光学纯度的S-CHBE，COBE的转化率能达到98%，催化产物中S-CHBE的e. e值能达到100% ；
本发明的球孢白僵菌，还可以不对称还原DKTP生成高光学纯度的S-DAN，DKTP的转化率能达到86%，全细胞催化产物中S-DAN的e. e.值能到达100%。
具体实施方式
一、培养基
SDY斜面培养基葡萄糖4%，酵母粉1%，蛋白胨1%，琼脂2%。
SDY选择性培养基葡萄糖4 %，酵母粉I %，蛋白胨I %，琼脂2 %，
4-氯乙酰乙酸乙酯O. I % 1.0%。
SDY液体种子培养基葡萄糖4%，酵母粉I %，蛋白胨I %。
SDY液体发酵培养基葡萄糖4%，酵母粉1%，蛋白胨1%。
二、菌株的分离纯化
菌株的筛选、固体培养及保藏球孢白僵菌(Beauveria bassiana)野生株采用常规方法分离于采集的玉米螟僵死幼虫，并经SDY培养基纯化培养获得。从SDY斜面培养基上挑取一环菌株划线接种新鲜的SDY斜面培养基，在28°C培养箱培养2 7d，4°C冰箱保存。
菌株的诱变选育从新鲜的SDY斜面培养基上挑取一环菌株接种SDY液体种子培养基，在28°C摇床培养2天后制备菌悬液，然后采用紫外照射菌丝体悬液，紫外灯功率为 15W，距离15cm，时间lmin。照射后的菌丝体涂布含O. I % I. 0%的4-氯乙酰乙酸乙酯的 SDY选择性培养基平板，在20 40°C培养2 10天，挑取能在筛选平板上形成菌落的菌株进行培养和催化性能测定(即筛选可以还原4-氯乙酰乙酸乙酯为单一光学纯化合物的 S-4-氯-3-羟基丁酸乙酯)，挑取具有最优催化选择性的菌株进行保藏。
取筛选到的Bea-a-2菌株培养液送于上海生工生物工程有限公司对菌株的保守序列18s RNA进行测序，测序结果显示筛选的菌株为白僵菌属的球孢白僵菌。菌株属半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、白僵菌属，在沙氏培养基上，球孢白僵菌菌落呈绒毛状、丛卷毛状至粉状，白色至浅黄色，偶成淡粉色。
将球孢白僵菌Bea-a-2送于北京市朝阳区北辰西路I号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心(CGMCC)进行保藏，保藏编号为=CGMCC NO. 6345，保藏日期为2012年7月12日。
三、全细胞催化COBE制备S-CHBE
挑取一环诱变后保藏的球孢白僵菌Bea-a-2菌丝体接种至30mLSDY液体培养基， 在温度为28°C、转速为200rpm的恒温振荡摇床上培养40h，然后按10%接种量接种至装液量为50mL的250mL摇瓶，在温度为28°C、转速为200rpm的恒温振荡摇床上培养48h。
离心收集菌体并用无菌生理盐水洗涤2次。然后用适量体积的磷酸缓冲液(O. 2M，PH6. 5)重悬菌体，使菌体浓度为200g/L，然后取20ml菌液放入250ml三角瓶中，加入COBE 反应，COBE的浓度为5g/L。反应温度为30°C，反应时间为24h。
反应结束后,用等体积的萃取剂反萃取反应液两次,合并乙酸乙酯萃取液,再向其中加入5% (w/v)的无水硫酸镁，搅匀后静置过夜以除去残余的水分。过滤收集有机相，在 40°C进行减压旋蒸，回收乙酸乙酯，所得无色油状液体即为催化产物。
四、催化产物中S-CHBE的含量和光学纯度测定
COBE的全细胞催化产物分为两部分，一部分用乙酸乙酯溶解后采用气相色谱检测产物中S-CHBE和R-CHBE的总含量，以计算底物转化率；另一部分产物用乙醇溶解后采用正相HPLC分析S-CHBE的对映体过量值(e. e值)。
底物COBE和产物S-CHBE的浓度采用气相色谱进行鉴定。所用气象色谱仪为福立9790，色谱柱为毛细色谱柱。检测条件为柱箱温度200°C，检测器温度280°C，辅助温度 2800C，载气为氮气，进样量O. 2 μ L。
产物S-CHBE的对映体过量值(e. e)采用正相HPLC测定。所用的高效液相色谱仪为依利特1201，色谱柱为大连依利特Sino-Chiral OD正相色谱柱。检测条件为柱温35°C， 流动相(正己烷异丙醇=9 10)，流速I. OmL/min，紫外检测波长217nm，进样量5 μ L。
结果表明，采用所述的全细胞催化方法，COBE的转化率为98%，催化产物中 S-CHBE 的 e. e 值为 100%。
五、全细胞催化DKTP制备S-DAN
挑取一环诱变后保藏的球孢白僵菌Bea-a-2菌丝体接种至30mLSDY液体培养基， 在温度为28°C、转速为200rpm的恒温振荡摇床上培养40h，然后按10%接种量接种至装液量为50mL的250mL摇瓶，在温度为28°C、转速为200rpm的恒温振荡摇床上培养48h。
离心收集菌体并用无菌生理盐水洗涤2次。然后用适量体积的磷酸缓冲液(O. 2M， PH6. 5)重悬菌体，使菌体浓度为200g/L，然后取20mL菌液放入250mL三角瓶中，加入DKTP 进行反应，DKTP的浓度为30g/L。反应温度为30°C，反应时间为24h。
反应结束后，离心去除菌体，取上清，用NaOH溶液或Na2CO3调节pH至11 12，然后用等体积乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，减压旋蒸回收乙酸乙酯，并用适量的异丙醇溶解固形物，过滤后即为催化产物。
六、DKTP催化产物中S-DAN的含量和光学纯度测定
采用反相HPLC测定催化产物中DAN的浓度，以计算反应得率；采用正相HPLC分析 S-DAN的对映体过量值。
底物DKTP和产物S-DAN的浓度采用反相HPLC进行测定。高效液相色谱仪为日立 L2000，色谱柱为大连依利特C18反相色谱柱(200mmX4.6mm，5ym)。检测条件为检测波长 254nm，流动相(乙腈:KH2P04 (pH 2.5) =40 60)，流速 L OmL/min，柱温 25°C，进样 M 20 μ L0
产物S-DAN对映体过量值(e. e)采用正相HPLC测定。所用高效液相色谱仪为依利特1201，色谱柱为大连依利特Sino-Chiral OD正相色谱柱。测定条件为柱温40°C，检测波长230nm，流动相(正己烷乙醇=95 5)，流速I. OmL/min，进样量10 μ L。
检测结果表明，底物DKTP的转化率为86%，全细胞催化产物中S-DAN的e. e.值为 100%。
权利要求
1.一种可催化不对称还原反应的球孢白僵菌，其特征在于，命名为球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bea-a-2,保藏编号为 CGMCC NO. 6345。
2.如权利要求I所述的球孢白僵菌在催化合成S-4-氯-3-羟基丁酸乙酯或S-N，N-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩)-1_丙胺盐酸盐中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，包括将球孢白僵菌Bea-a-2接种于培养基中进行扩大培养，收集菌体悬浮于缓冲液中，加入底物进行反应，反应后分离得到产物；所述底物为4-氯乙酰乙酸乙酯或N，N- 二甲基-3-氧代-3-(2-噻吩)-1_丙胺盐酸盐。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述底物的添加浓度为3g/L 35g/L。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述菌体的浓度为15g/L 250g/L。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述反应的温度为25°C 45°C。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述反应的时间为Ih 48h。
8.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的扩大培养采用的培养基为SDY液体培养基。
9.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述分离的方法为以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物时，采用乙酸乙酯萃取，并对萃取液进行旋蒸处理，收集得到无色油状液体；以N，N- 二甲基-3-氧代-3-(2-噻吩)-1_丙胺盐酸盐为底物时，将反应体系的pH值调至11 12，再用乙酸乙酯萃取，对萃取液进行旋蒸处理，收集得到透明结晶体。
全文摘要
本发明公开了一种可催化不对称还原反应的球孢白僵菌(Beauveriabassiana)，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，保存号为CGMCC NO.6345，保藏时间2012年7月12日。本发明的菌株可以表达高立体选择性的羰基还原酶，利用该菌株进行4-氯乙酰乙酸乙酯的全细胞催化时，产物中S-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的对映体过量值达到100％e.e.；利用该菌株进行N，N-二甲基-3-氧代-3-(2-噻吩)-1-丙胺盐酸盐的全细胞催化时，产物中(S)-N，N-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩)-1-丙胺盐酸盐的对映体过量值达到100％e.e.。
文档编号C12N1/14GK102925368SQ20121044108
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月7日 优先权日2012年11月7日
发明者金志华, 胡升, 姚成志, 王爱珂, 金庆超, 杨郁, 张丽靖, 曹倩, 梅乐和 申请人:浙江大学宁波理工学院, 宁波美诺华药业股份有限公司