专利名称：一种β-D-呋喃果糖苷酶的固态发酵生产方法
技术领域：
本发明涉及β-D-呋喃果糖苷酶(β-D-fructofuranosidase, EC 3.1.2. 26,简写为FFase)的制备方法，尤其是一种β -D-呋喃果糖苷酶的固态发酵生产方法。
背景技术：
低聚果糖(fructooligosaccharides)是一种新型的保健食品，是功能性低聚糖中颇具代表性的一种。低聚果糖是通过β _(2，I)糖苷键在蔗糖的果糖基上连接f 3个果糖基而形成的一系列果糖寡聚体，主要包括蔗果三糖(GF2)、蔗果四糖(GF3)、蔗果五糖(GF4)。日常食用的蔬菜与水果中含有此类寡糖，尤其是洋葱、牛蒡、芒笋和麦类中含量较高。低聚果糖具有低热值、预防龋齿、增殖肠道内的双歧杆菌、调节机体免疫力等生理功能，被广泛应用于食品、饲料和医药工业，是一种重要的保健型添加剂。目前工业上生产低聚果糖方法主要有两种一是以菊芋为原料提取菊粉，再经酶水解而得。第二种方法是以蔗糖为原料，采用β-D-呋喃果糖苷酶作为生物催化剂通过酶促催化一系列转糖基反应而获得低聚果糖。后一种方法中可以通过将β-D-呋喃果糖苷酶固定化而实现连续生产，具有自动化程度高、操作稳定性好、酶能反复使用、生产成本低等优点而受到青睐，国内外市场上的大多数低聚果糖产品都是采用这种方法生产出来的。β-D-呋喃果糖苷酶(β-D-fructofuranosidase, EC 3.1. 2· 26,简写为 FFase)又称蔗糖酶或转化酶，可以催化水解β-D-果糖苷键，也可以催化转糖基反应。它广泛地存在于生物界，据文献报道，植物中的FFase催化活性很弱，产率低，且受到季节限制，而来自微生物的FFase比植物的催化活性高，且耐高温，反应过程中受杂菌的污染机会少，使用方便。能产生FFase的微生物主要有黑曲霉、米曲霉、酵母以及节杆菌等。微生物产FFase转糖基活力的高低和发酵 制备的难易程度是决定酶转化法制备低聚果糖工艺是否经济的关键因素。但是，目前对微生物源特别是曲霉来源的FFase发酵制备主要采用液体深层发酵法，存在发酵周期长(一般要7天左右)、发酵产酶水平低、废水排放量大、生产成本高等缺点给实际工业生产带来很多困难。
发明内容
本发明的目的是提供一种单位基质酶活力高、发酵周期短、工艺简单、生产成本低的β-D-呋喃果糖苷酶的固态发酵生产方法。—种β -D-呋喃果糖苷酶的固态发酵生产方法，其特别之处在于，包括如下步骤(I)孢子液的准备首先制备试管斜面培养基，将黑曲霉接种到制备好的试管斜面培养基上，在25-32 °C培养3 5天至长出孢子，然后向斜面上加入生理盐水洗涤菌丝体，获得孢子液；(2)种子的扩大培养制备液体种子培养基，按照体积比2% 5%的接种量将步骤
(I)得到的孢子液接入液体种子培养基，于25 32°C、转速180 220rpm的摇床上扩大培养2 4天，获得种子液；(3)固态发酵产β -D-呋喃果糖苷酶制备固态发酵培养基，将种子液接入制备好的固态发酵培养基，充分搅拌混合，然后在料层厚度I 3厘米、湿度45% 80%、发酵温度25-35°C下静置发酵3 5天；(4)后处理获得β -D-呋喃果糖苷酶取步骤(3)得到的固体培养物，加入其6-10倍重量的50毫摩尔pH 5. 5的柠檬酸盐缓冲液，用组织捣碎机粉碎，再搅拌浸提至少4小时，经过离心或过滤使固液分离，得到的上清液或滤液即为粗β -D-呋喃果糖苷酶酶液。步骤(3)中固态发酵培养基的制备方法是将1. 5 3倍重量的营养液均匀喷洒在固体混合物上，然后在121°C灭菌20分钟即可，其中营养液的组成以g/L计为，甘蔗糖蜜10 30，玉米浆5 15，脱脂奶粉3 10，硝酸钠I 3，磷酸氢二钾2 5，硫酸镁O. 5，氯化钾O. 5，这些物质先溶于800毫升去离子水中，然后再定容到I升即可；固体混合物是由甘蔗渣、稻壳、大豆饼三者混合组成，其组成按照重量比为甘蔗渣稻壳大豆饼为3 6 I 3 :0· 5 1. 5。步骤(I)中试管斜面培养基的组成以g/L计为，蔗糖30，硝酸钠3，磷酸氢二钾1，硫酸镁O. 5，氯化钾O. 5，硫酸亚铁O. 01，琼脂15，这些物质先溶于800毫升去离子水中，然后再定容到I升即可。步骤(I)中黑曲霉为黑曲霉AS 3.877。步骤(2)中液体种子培养基的组成以g/L计为，甘蔗糖蜜20，蛋白胨10，酵母膏5，硝酸钠2，磷酸氢二钾3， 硫酸镁O. 5，氯化钾O. 5，这些物质先溶于800毫升去离子水中，然后再定容到I升即可。步骤(3)中种子液接入制备好的固态发酵培养基时，种子液的接种比例为5 15晕升/100克固态发酵培养基。本发明方法克服了 FFase液态发酵的缺点，提供一种FFase的固态发酵生产方法，用固态发酵的方法为低聚果糖的大规模工业生产提供优质酶源。本发明方法的优点是(O固态发酵培养基以甘蔗渣、稻壳、大豆饼等为原料，原料价格低廉；(2)发酵周期短，工艺设备简单，降低成本，益于工业化生产；(3)液体废水较液体发酵大大减少，从根本上有效解决污水排放问题，非常有利于环境保护。
具体实施例方式下列实施例中采用的检测方法是FFase转果糖基活力的测定，用50mM、pH 5. 5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液配制25% (w/w)的蔗糖溶液作为底物，加入粗FFase酶液适量(使反应I小时后，体系中蔗果三糖的含量不超过总糖含量的10% (w/w)为宜)，置于55°C水浴中振荡反应I小时，然后于沸水浴中加热10分钟，终止酶反应。用高效液相色谱法测定反应体系中的蔗果三糖，由蔗果三糖的量来计算转果糖基活力。一个酶活力单位定义为每分钟在上述条件下产生IumoL鹿果三糖所需的酶量。色谱条件色谱柱，Hypersi1-NH2 (4. 6X250X5,大连依利特公司)；示差检测器的灵敏度，1/8 ;流动相，乙腈水=68:32;流速，lmL/min;柱温，30°C。本发明及下列实施例中所采用的黑曲霉是黑曲霉AS 3. 877，其为中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)公开供索取、购买的菌株，菌种编号为3. 877，中文菌名为黑曲霉，拉丁学名为 Aspergillus niger。实施例1 :固态发酵生产FFase。(I)孢子液的准备将30g蔗糖、3g硝酸钠、Ig磷酸氢二钾、O. 5g硫酸镁、O. 5g氯化钾、O. Olg硫酸亚铁、15g琼脂溶于800毫升去离子水中，再定容至1000毫升，pH自然，121°C灭菌20分钟，冷却凝固之前倾斜30度制成试管斜面培养基。将黑曲霉AS 3. 877接种到制备好的试管斜面培养基上，25°C培养5天长出孢子，向斜面上加入O. 9%的生理盐水洗涤菌丝体，获得孢子液。(2)种子的扩大培养将20g甘蔗糖蜜、IOg蛋白胨、5g酵母膏、2g硝酸钠、3g磷酸氢二钾、O. 5g硫酸镁、O. 5g氯化钾溶于800毫升去离子水中，再定容至1000毫升，pH自然，121°C灭菌20分钟，制备液体种子培养基。按照体积比2%的接种量将孢子液接入液体种子培养基，于25°C、转速180rpm的摇床上扩大培养2天，获得种子液。(3)固态发酵产FFase :将1. 5倍重量的营养液均匀喷洒在固体混合物上，在121°C灭菌20分钟，制备固态发酵培养基。所述的营养液组成为(g/L):甘蔗糖蜜10，玉米浆5，脱脂奶粉3，硝酸钠I，磷酸氢二钾2，硫酸镁O. 5，氯化钾O. 5，这些物质先溶于800毫升去离子水中，然后再定容到I升。所述的固体混合物由甘蔗渣、稻壳、大豆饼三者混合组成，其重量组成比例为甘蔗渣稻壳大豆饼为3:1:0.5。将种子液按照5毫升/100克固态培养基的比例接入制备好的固态发酵培养基，充分搅拌混合，然后在料层厚度I厘米(即种子液先加入固体发酵培养基中，然后充分搅拌混合，混合后将此混合物放在发酵容器内，使其高度I厘米，下同)、湿度45%、发酵温度25°C下静置发酵3天。(4)后处理获得FFase `:取固体培养物10g，加入80毫升50毫摩尔pH 5. 5的柠檬酸盐缓冲液，用组织捣碎机粉碎，再搅拌浸提4小时，过滤，滤液即为粗FFase酶液。按照检测方法测得酶活为236. 48U/mL。实施例2 固态发酵生产FFase。(I)孢子液的准备试管斜面培养基的制备同实施例1。将黑曲霉AS 3.877接种到制备好的试管斜面培养基上，26°C培养5天长出孢子，向斜面上加入生理盐水洗涤菌丝体，获得孢子液。(2)种子的扩大培养液体种子培养基的制备同实施例1。按照体积比2. 25%的接种量将孢子液接入液体种子培养基，于26°C、转速185rpm的摇床上扩大培养2天，获得种子液。(3)固态发酵产FFase将1. 75倍重量的营养液均匀喷洒在固体混合物上，在121°C灭菌20分钟，制备固态发酵培养基。所述的营养液组成为(g/L):甘蔗糖蜜12. 5，玉米浆7. 5，脱脂奶粉4，硝酸钠1. 25，磷酸氢二钾2. 25，硫酸镁O. 5，氯化钾O. 5，这些物质先溶于800毫升去离子水中，然后再定容到I升。所述的固体混合物由甘蔗渣、稻壳、大豆饼三者混合组成，其重量组成比例为甘蔗渣稻壳大豆饼为3. 25:1. 25:0. 75。将种子液按照7. 5毫升/100克固态培养基的比例接入制备好的固态发酵培养基，充分搅拌混合，然后在料层厚度1. 25厘米、湿度50%、发酵温度26°C下静置发酵3天。
(4)后处理获得FFase取固体培养物10g，加入80毫升50毫摩尔pH 5. 5的柠檬酸盐缓冲液，用组织捣碎机粉碎，再搅拌浸提4. 5小时，过滤，滤液即为粗FFase酶液。按照检测方法测得酶活为274. 32U/mL。实施例3 固态发酵生产FFase。(I)孢子液的准备试管斜面培养基的制备同实施例1。将黑曲霉AS 3.877接种到制备好的试管斜面培养基上，27°C培养5天长出孢子，向斜面上加入生理盐水洗涤菌丝体，获得孢子液。(2)种子的扩大培养液体种子培养基的制备同实施例1。按照体积比2. 5%的接种量将孢子液接入液体种子培养基，于27°C、转速190rpm的摇床上扩大培养2天，获得种子液。(3)固态发酵产FFase将2倍重量的营养液均匀喷洒在固体混合物上，在121°C灭菌20分钟，制备固态发酵培养基。所述的营养液组成为(g/L):甘蔗糖蜜15，玉米浆10，脱脂奶粉5，硝酸钠1. 5，磷酸氢二钾2. 5，硫酸镁O. 5，氯化钾O. 5，这些物质先溶于800毫升去离子水中，然后再定容到I升。所述的固体混合物由甘蔗渣、稻壳、大豆饼三者混合组成，其重量组成比例为甘蔗渣稻壳大豆饼为3. 5:1. 5:1. O。将种子液按照10毫升/100克固态培养基的比例接入制备好的固态发酵培养基，充分搅拌混合，然后在料层厚度1. 5厘米、湿度55%、发酵温度27°C下静置发酵3天。(4)后处理获得FFase取固体培养物10g，加入80毫升50毫摩尔pH 5. 5的柠檬酸盐缓冲液，用组织捣碎机粉碎，再搅拌浸提5小时，过滤，滤液即为粗FFase酶液。按照检测方法测得酶活为355. 25U/mL。实施例4
固态发酵生产FFase。(I)孢子液的准备试管斜面培养基的制备同实施例1。将黑曲霉AS 3.877接种到制备好的试管斜面培养基上，28°C培养4天长出孢子，向斜面上加入生理盐水洗涤菌丝体，获得孢子液。(2)种子的扩大培养液体种子培养基的制备同实施例1。按照体积比2. 75%的接种量将孢子液接入液体种子培养基，于28°C、转速195rpm的摇床上扩大培养3天，获得种子液。(3)固态发酵产FFase将2. 25倍重量的营养液均匀喷洒在固体混合物上，在121°C灭菌20分钟，制备固态发酵培养基。所述的营养液组成为(g/L):甘蔗糖蜜17. 5，玉米浆10，脱脂奶粉6，硝酸钠1. 75，磷酸氢二钾2. 75，硫酸镁O. 5，氯化钾O. 5，这些物质先溶于800毫升去离子水中，然后再定容到I升。所述的固体混合物由甘蔗渣、稻壳、大豆饼三者混合组成，其重量组成比例为甘蔗渣稻壳大豆饼为3. 75:1. 75:1. O。将种子液按照10毫升/100克固态培养基的比例接入制备好的固态发酵培养基，充分搅拌混合，然后在料层厚度1. 75厘米、湿度60%、发酵温度28°C下静置发酵4天。(4)后处理获得FFase取固体培养物10g，加入80毫升50毫摩尔pH 5. 5的柠檬酸盐缓冲液，用组织捣碎机粉碎，再搅拌浸提5小时，过滤，滤液即为粗FFase酶液。按照检测方法测得酶活为420. 45U/mL。
实施例5 固态发酵生产FFase。(I)孢子液的准备试管斜面培养基的制备同实施例1。将黑曲霉AS3. 877接种到制备好的试管斜面培养基上，28°C培养4天长出孢子，向斜面上加入生理盐水洗涤菌丝体，获得孢子液。(2)种子的扩大培养液体种子培养基的制备同实施例1。按照体积比3%的接种量将孢子液接入液体种子培养基，于28°C、转速200rpm的摇床上扩大培养3天，获得种子液。(3)固态发酵产FFase将2. 5倍重量的营养液均匀喷洒在固体混合物上，在121°C灭菌20分钟，制备固态发酵培养基。所述的营养液组成为(g/L):甘蔗糖蜜20，玉米浆10，脱脂奶粉5，硝酸钠2，磷酸氢二钾3，硫酸镁O. 5，氯化钾O. 5，这些物质先溶于800毫升去离子水中，然后再定容到I升。所述的固体混合物由甘蔗渣、稻壳、大豆饼三者混合组成，其重量组成比例为甘蔗渣稻壳大豆饼为4:2:1。将种子液按照10毫升/100克固态培养基的比例接入制备好的固态发酵培养基，充分搅拌混合，然后在料层厚度2厘米、湿度60%、发酵温度28°C下静置发酵4天。(4)后处理获得FFase取固体培养物10g，加入80毫升50毫摩尔pH 5. 5的柠檬酸盐缓冲液，用组织捣碎机粉 碎，再搅拌浸提5小时，过滤，滤液即为粗FFase酶液。按照检测方法测得酶活为521. 65U/mL。实施例6 固态发酵生产FFase。(I)孢子液的准备试管斜面培养基的制备同实施例1。将黑曲霉AS3. 877接种到制备好的试管斜面培养基上，28°C培养4天长出孢子，向斜面上加入生理盐水洗涤菌丝体，获得孢子液。(2)种子的扩大培养液体种子培养基的制备同实施例1。按照体积比3. 5%的接种量将孢子液接入液体种子培养基，于28°C、转速200rpm的摇床上扩大培养3天，获得种子液。(3)固态发酵产FFase将2. 5倍重量的营养液均匀喷洒在固体混合物上，在121°C灭菌20分钟，制备固态发酵培养基。所述的营养液组成为(g/L):甘蔗糖蜜20，玉米浆12. 5，脱脂奶粉5，硝酸钠2，磷酸氢二钾3. 5，硫酸镁O. 5，氯化钾O. 5，这些物质先溶于800毫升去离子水中，然后再定容到I升。所述的固体混合物由甘蔗渣、稻壳、大豆饼三者混合组成，其重量组成比例为甘蔗渣稻壳大豆饼为4. 5:2. 5:1。将种子液按照10毫升/100克固态培养基的比例接入制备好的固态发酵培养基，充分搅拌混合，然后在料层厚度2厘米、湿度65%、发酵温度28 °C下静置发酵4天。(4)后处理获得FFase取固体培养物10g，加入80毫升50毫摩尔pH 5. 5的柠檬酸盐缓冲液，用组织捣碎机粉碎，再搅拌浸提5. 5小时，过滤，滤液即为粗FFase酶液。按照检测方法测得酶活为486. 13U/mL。实施例7 固态发酵生产FFase。(I)孢子液的准备试管斜面培养基的制备同实施例1。将黑曲霉AS 3.877接种到制备好的试管斜面培养基上，28°C培养4天长出孢子，向斜面上加入生理盐水洗涤菌丝体，获得孢子液。(2)种子的扩大培养液体种子培养基的制备同实施例1。按照体积比3. 75%的接种量将孢子液接入液体种子培养基，于28°C、转速200rpm的摇床上扩大培养3天，获得种子液。(3)固态发酵产FFase将2. 5倍重量的营养液均匀喷洒在固体混合物上，在121°C灭菌20分钟，制备固态发酵培养基。所述的营养液组成为(g/L):甘蔗糖蜜22. 5，玉米浆12. 5，脱脂奶粉7，硝酸钠2，磷酸氢二钾3. 5，硫酸镁O. 5，氯化钾O. 5，这些物质先溶于800毫升去离子水中，然后再定容到I升。所述的固体混合物由甘蔗渣、稻壳、大豆饼三者混合组成，其重量组成比例为甘蔗渣稻壳大豆饼为4. 75:2. 5:1. 25。将种子液按照12. 5毫升/100克固态培养基的比例接入制备好的固态发酵培养基，充分搅拌混合，然后在料层厚度2厘米、湿度65%、发酵温度28°C下静置发酵4天。(4)后处理获得FFase取固体培养物10g，加入80毫升50毫摩尔pH 5. 5的柠檬酸盐缓冲液，用组织捣碎机粉碎，再搅拌浸提5. 5小时，过滤，滤液即为粗FFase酶液。按照检测方法测得酶活为465. 20U/mL。实施例8 固态发酵生产FFase。(I)孢子液的准备试管斜面培养基的制备同实施例1。将黑曲霉AS 3.877接种到制备好的试管斜面培养基上，29°C 培养4天至长出孢子，向斜面上加入生理盐水洗涤菌丝体，获得孢子液。(2)种子的扩大培养液体种子培养基的制备同实施例1。按照体积比4%的接种量将孢子液接入液体种子培养基，于29°C、转速200rpm的摇床上扩大培养3天，获得种子液。(3)固态发酵产FFase将2. 5倍重量的营养液均匀喷洒在固体混合物上，在121°C灭菌20分钟，制备固态发酵培养基。所述的营养液组成为(g/L):甘蔗糖蜜25，玉米浆12. 5，脱脂奶粉7，硝酸钠2. 5，磷酸氢二钾4，硫酸镁O. 5，氯化钾O. 5，这些物质先溶于800毫升去离子水中，然后再定容到I升。所述的固体混合物由甘蔗渣、稻壳、大豆饼三者混合组成，其重量组成比例为甘蔗渣稻壳大豆饼为5:2. 75:1. 25。将种子液按照12. 5毫升/100克固态培养基的比例接入制备好的固态发酵培养基，充分搅拌混合，然后在料层厚度2. 5厘米、湿度70%、发酵温度29°C下静置发酵4天。(4)后处理获得FFase取固体培养物10g，加入80毫升50毫摩尔pH 5. 5的柠檬酸盐缓冲液，用组织捣碎机粉碎，再搅拌浸提6小时，过滤，滤液即为粗FFase酶液。按照检测方法测得酶活为440. 25U/mL。实施例9 固态发酵生产FFase。(I)孢子液的准备试管斜面培养基的制备同实施例1。将黑曲霉AS 3.877接种到制备好的试管斜面培养基上，30°C培养4天长出孢子，向斜面上加入生理盐水洗涤菌丝体，获得孢子液。(2)种子的扩大培养液体种子培养基的制备同实施例1。按照体积比4. 5%的接种量将孢子液接入液体种子培养基，于30°C、转速210rpm的摇床上扩大培养3天，获得种子液。
(3)固态发酵产FFase将2. 75倍重量的营养液均匀喷洒在固体混合物上，在121°C灭菌20分钟，制备固态发酵培养基。所述的营养液组成为(g/L):甘蔗糖蜜27. 5，玉米浆12. 5，脱脂奶粉8，硝酸钠2. 75，磷酸氢二钾4. 5，硫酸镁O. 5，氯化钾O. 5，这些物质先溶于800毫升去离子水中，然后再定容到I升。所述的固体混合物由甘蔗渣、稻壳、大豆饼三者混合组成，其重量组成比例为甘蔗渣稻壳大豆饼为5. 5:2. 75:1. 25。将种子液按照12. 5毫升/100克固态培养基的比例接入制备好的固态发酵培养基，充分搅拌混合，然后在料层厚度2. 75厘米、湿度75%、发酵温度32°C下静置发酵4天。(4)后处理获得FFase取固体培养物10g，加入80毫升50毫摩尔pH 5. 5的柠檬酸盐缓冲液，用组织捣碎机粉碎，再搅拌浸提7小时，过滤，滤液即为粗FFase酶液。按照检测方法测得酶活为365. 45U/mL。实施例10 固态发酵生产FFase。(I)孢子液的准备试管斜面培养基的制备同实施例1。将黑曲霉AS 3.877接种到制备好的试管斜面培养基上，32°C培养5天长出孢子，向斜面上加入生理盐水洗涤菌丝体，获得孢子液。(2)种子的扩大培养液体种子培养基的制备同实施例1。按照体积比5%的接种量将孢子液接入液体种子培养 基，于32°C、转速220rpm的摇床上扩大培养3天，获得种子液。(3)固态发酵产FFase将3倍重量的营养液均匀喷洒在固体混合物上，在121°C灭菌20分钟，制备固态发酵培养基。所述的营养液组成为(g/L):甘蔗糖蜜27. 5，玉米浆15，脱脂奶粉9，硝酸钠3，磷酸氢二钾5，硫酸镁O. 5，氯化钾O. 5，这些物质先溶于800毫升去离子水中，然后再定容到I升。所述的固体混合物由甘蔗渣、稻壳、大豆饼三者混合组成，其重量组成比例为甘蔗渣稻壳大豆饼为6:2. 5:1. 5。将种子液按照15毫升/100克固态培养基的比例接入制备好的固态发酵培养基，充分搅拌混合，然后在料层厚度2. 75厘米、湿度75%、发酵温度32 °C下静置发酵5天。(4)后处理获得FFase取固体培养物10g，加入80毫升50毫摩尔pH 5. 5的柠檬酸盐缓冲液，用组织捣碎机粉碎，再搅拌浸提7小时，过滤，滤液即为粗FFase酶液。按照检测方法测得酶活为205. 85U/mL。实施例11 固态发酵生产FFase。(I)孢子液的准备试管斜面培养基的制备同实施例1。将黑曲霉AS 3.877接种到制备好的试管斜面培养基上，32°C培养5天长出孢子，向斜面上加入生理盐水洗涤菌丝体，获得孢子液。(2)种子的扩大培养液体种子培养基的制备同实施例1。按照体积比5%的接种量将孢子液接入液体种子培养基，于32°C、转速220rpm的摇床上扩大培养4天，获得种子液。(3)固态发酵产FFase将3倍重量的营养液均匀喷洒在固体混合物上，在121°C灭菌20分钟，制备固态发酵培养基。所述的营养液组成为(g/L):甘蔗糖蜜30，玉米浆15，脱脂奶粉10，硝酸钠3，磷酸氢二钾5，硫酸镁O. 5，氯化钾O. 5，这些物质先溶于800毫升去离子水中，然后再定容到I升。所述的固体混合物由甘蔗渣、稻壳、大豆饼三者混合组成，其重量组成比例为甘蔗渣稻壳大豆饼为6:3:1. 5。将种子液按照15毫升/100克固态培养基的比例接入制备好的固态发酵培养基，充分搅拌混合，然后在料层厚度3厘米、湿度80%、发酵温度35 °C下静置发酵5天。(4)后处理获得FFase取固体培养物10g，加入80毫升50毫摩尔pH 5. 5的柠檬酸盐缓冲液，用组织捣碎机粉碎，再搅拌浸提7小时，过滤，滤液即为粗FFase酶液。按照检测方法测得酶活为128. 36U/mL。上述参照实施例对固态发酵生产FFase的方法进行的详细描述，是说明性的而不是限制性的，可根据所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体思想下的任何变化和修改，应属于本发明`的保护范围之内。
权利要求
1.一种β-D-呋喃果糖苷酶的固态发酵生产方法，其特征在于，包括如下步骤 (1)孢子液的准备首先制备试管斜面培养基，将黑曲霉接种到制备好的试管斜面培养基上，在25-32°C培养3 5天至长出孢子，然后向斜面上加入生理盐水洗涤菌丝体，获得孢子液； (2)种子的扩大培养制备液体种子培养基，按照体积比2% 5%的接种量将步骤(I)得到的孢子液接入液体种子培养基，于25 32°C、转速180 220rpm的摇床上扩大培养2 4天,获得种子液； (3)固态发酵产β-D-呋喃果糖苷酶制备固态发酵培养基，将种子液接入制备好的固态发酵培养基，充分搅拌混合，然后在料层厚度I 3厘米、湿度45% 80%、发酵温度25-35°C下静置发酵3 5天； (4)后处理获得β-D-呋喃果糖苷酶取步骤(3)得到的固体培养物，加入其6-10倍重量的50毫摩尔pH 5. 5的柠檬酸盐缓冲液，用组织捣碎机粉碎，再搅拌浸提至少4小时，经过离心或过滤使固液分离，得到的上清液或滤液即为粗β -D-呋喃果糖苷酶酶液。
2.如权利要求1所述的一种β-D-呋喃果糖苷酶的固态发酵生产方法，其特征在于步骤(3)中固态发酵培养基的制备方法是将1. 5 3倍重量的营养液均匀喷洒在固体混合物上，然后在121°C灭菌20分钟即可，其中营养液的组成以g/L计为，甘蔗糖蜜10 30，玉米浆5 15，脱脂奶粉3 10，硝酸钠I 3，磷酸氢二钾2 5，硫酸镁O. 5，氯化钾O. 5，这些物质先溶于800毫升去离子水中，然后再定容到I升即可；固体混合物是由甘蔗渣、稻壳、大豆饼三者混合组成，其组成按照重量比为甘蔗渣稻壳大豆饼为3 6 :1 3 :0. 5 1.5。
3.如权利要求1所述的一种β-D-呋喃果糖苷酶的固态发酵生产方法，其特征在于步骤(I)中试管斜面培养基的组成以g/L计为，蔗糖30，硝酸钠3，磷酸氢二钾1，硫酸镁O.5，氯化钾O. 5，硫酸亚铁O. 01，琼脂15，这些物质先溶于800毫升去离子水中，然后再定容到I升即可。
4.如权利要求1所述的一种β-D-呋喃果糖苷酶的固态发酵生产方法，其特征在于步骤(I)中黑曲霉为黑曲霉AS 3.877。
5.如权利要求1所述的一种β-D-呋喃果糖苷酶的固态发酵生产方法,其特征在于步骤(2)中液体种子培养基的组成以g/L计为，甘蔗糖蜜20，蛋白胨10，酵母膏5，硝酸钠2，磷酸氢二钾3，硫酸镁O. 5，氯化钾O. 5，这些物质先溶于800毫升去离子水中，然后再定容到I升即可。
6.如权利要求1所述的一种β-D-呋喃果糖苷酶的固态发酵生产方法,其特征在于步骤(3)中种子液接入制备好的固态发酵培养基时,种子液的接种比例为5 15晕升/100克固态发酵培养基。
全文摘要
本发明涉及β-D-呋喃果糖苷酶(β-D-fructofuranosidase,EC 3.1.2.26，简写为FFase)的制备方法，尤其是一种β-D-呋喃果糖苷酶的固态发酵生产方法。其特点是，包括如下步骤(1)孢子液的准备；(2)种子的扩大培养；(3)固态发酵产β-D-呋喃果糖苷酶；(4)后处理获得β-D-呋喃果糖苷酶。本发明方法克服了FFase液态发酵的缺点，提供一种FFase的固态发酵生产方法，用固态发酵的方法为低聚果糖的大规模工业生产提供优质酶源。优点是(1)固态发酵培养基以甘蔗渣、稻壳、大豆饼等为原料，原料价格低廉；(2)发酵周期短，工艺设备简单，降低成本，益于工业化生产。
文档编号C12R1/685GK103045561SQ20121054525
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月17日 优先权日2012年12月17日
发明者王双平, 陈龙, 苏二正 申请人:宁夏乙征生物工程有限公司