一种重组磷脂酶d的生产方法

专利名称：一种重组磷脂酶d的生产方法
技术领域：
本发明涉及利用基因工程菌发酵生产磷脂酶D的方法，尤其是一种重组磷脂酶D的生产方法。
背景技术：
磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine, PS))是磷脂家族成员之一,它是唯一能够调控细胞膜关键蛋白功能状态的磷脂，具有独特的理化性质和营养价值，被广泛应用于食品、保健品和医药行业。PS可影响脑内化学讯息的传递，并帮助脑细胞储存和读取资料，是维持大脑正常记忆力、反应和健康情绪的重要营养元素。近20年来国内外的动物试验及临床应用表明PS的主要功效有(1)提高大脑机能，改善老年痴呆症；(2)帮助修复大脑损伤；(3)缓解压力，促进用脑疲劳的恢复、平衡情绪。 PS的制备方法主要有化学合成法、提取法和酶转化法。化学合成法工艺控制难度大、产品成分复杂，目前仅限于实验室规模。提取法主要是从植物细胞、动物的卵磷脂中提取PS，从动物中提取国外大部分以牛、羊、兔、马、驴等家禽的动物脑为原料来提取，但是近年来由于疯牛病等动物疾病的原因，利用动物细胞提取PS的方法，其提取产品的安全性受到人们的怀疑，现在已处于淘汰边缘；大豆磷脂中PS含量丰富，经过大量的临床研究，证明从大豆磷脂中提取的PS是一种更安全的、可以用作保健食品的原料，但是从大豆磷脂中提取PS仍存在诸多问题(1)目前采用有机溶剂萃取法，需要消耗大量的有机溶齐U，有机溶剂回收能耗大，此外，有机溶剂的使用对环境有一定的危害性；(2)大豆中磷脂成分复杂多样，各磷脂成分结构相似，性质相近，因此PS提取困难，产品纯度低，常含有其它磷脂；(3)最关键的问题是大豆磷脂中PS含量较低，磷脂类物质占大豆总重1. 6-2. 0%，这其中PS只占O. 5-1%，既每公斤大豆中只含有80-200毫克PS，再加上分离纯化成本，造成提取的PS产品价格极高。酶转化法是以天然的卵磷脂为基质，加入丝氨酸，在磷脂酶D (PLD)的作用下，生成PS，其反应原理是酶类催化转酰基反应。酶法合成条件温和、产物纯度高、制备量大是生产PS最理想的方法，受到国内外研究人员的广泛关注(参见中国专利申请文献 CN102277394A、CN101319237A、CN101230365A ;美国专利文献US6878532B1、US005700668A ；SCI 文献J Lipid Res, 1990，31:1719-1721、JAOCS, 2003，80:653-657)。PLD活力的高低和制备的难易程度是决定酶转化法工艺是否经济的关键因素。PLD首先发现于植物中(如卷心菜、花生等作物)，之后在微生物(链霉菌、沙门氏菌)和哺乳动物细胞中均有发现，其研究历史已有五十年左右，取得了丰富的研究成果，但是距工业化生产PS的需要还有较大差距，这是因为PLD在动植物体内含量低，分离提纯工艺复杂，且活力也不高，导致PLD价格非常昂贵。来自于微生物界的PLD相比较于动植物界的有更强的转酯能力，其中又以链霉菌属的PLD转酯能力尤为突出，但是目前微生物发酵法生产PLD主要采用野生链霉菌或经简单物理化学诱变的链霉菌，发酵周期长(一般要7天)、产酶水平低、生产成本高，给实际应用带来很多困难。利用大肠杆菌重组表达并通过高密度培养可能是一个不错的解决方案。国内天津科技大学的路福平、日本名古屋大学的Yugo Iwasak1、意大利国家研究委员会的Carlo Zambonelli等尝试将链霉菌的PLD基因在大肠杆菌中进行表达，但是PLD主要以无活性的包涵体存在，经过发酵条件优化酶活也只与野生菌相当或略高，仍然无法实现大规模生产。

发明内容
本发明的目的是提供一种重组磷脂酶D的生产方法，目的在于克服现有技术中大肠杆菌重组表达PLD包涵体多、发酵酶活低等问题，提供一种大肠杆菌重组表达PLD包涵体少、发酵酶活高、成本低的生产方法。为实现上述目的，本发明采取如下技术方案
一种重组PLD的生产方法，包括以下步骤(I)构建重组基因工程菌，所述基因工程菌为表达了 PLD的重组大肠杆菌，该重组大肠杆菌的构建方法按照常规分子生物学操作完成(参考PET系统操作手册，第10版，2002年；《分子克隆》，科学出版社，第二版，2002年)；(2)配制摇瓶种子培养基和发酵培养基；(3)将构建的重组基因工程菌在平板上活化16 20小时，再挑取在平板上活化后的基因工程菌接种至装有摇瓶种子培养基的摇瓶中，在37°C的条件下振荡培养10-16小时，得到种子液；(4)将经步骤(3)振荡培养后得到的种子液接入发酵培养基中进行发酵，接种比例按照种子液/发酵培养基(V/V)为1°/Γ10%进行；发酵培养的温度控制在2(T37°C，发酵液的pH值控制在6. 5^7. 5，溶氧控制在20°/Γ40% ;当发酵液中的细胞光密度0D600在O. 5^0. 9时，向发酵液中添加诱导剂至其在发酵液中的终浓度为1°/Γ5% ;然后继续发酵32 48小时；所述发酵培养基的组成包括糊精2(T50g/L、鱼蛋白胨10_30g/L、安琪酵母膏5 15g/L、基础盐2(T50mL/L、微量元素l(T30mL/L、氨苄青霉素钠3(Tl00mg/L。(5 )步骤(4 )完成后，采用常规方法从步骤(4 )所得发酵液的培养物中获得PLD，经后续处理，完成整个生产过程。根据本发明，重组基因工程菌构建采用的质粒为默克公司开发的pET系统质粒，优选地，所述质粒为pET-32 (a);采用的宿主菌为默克公司开发BL21系列大肠杆菌，优选地，所述宿主菌为BL21 (DE3) pLysS ;采用的PLD基因来源于微生物，优选地，所述PLD基因来源于链霉菌。优选地，所述摇瓶种子培养基的组成包括甘油10g/L、胰蛋白胨20g/L、酵母膏10g/L、磷酸氢二钠5g/L和氨苄青霉素钠50mg/L，pH值为7· O。优选地，所述的发酵培养基基础盐组成包括K2HPO4 · 3H20 50g/L、KH2P0420g/L、(NH4) 2S042g/L、NaC12g/L、NaHPO4 · 12H20 70g/L、CaCl2L 2g/L、MgS043. 5g/L。优选地，所述的发酵培养基微量元素组成包括FeS04 · 7H20 2g/L、CoC12 · 6H20
O.4g/L、ZnC120. 3ug/L、Na2Mo04 · 2H20 0. 2g/L、CuS04 · 5H20 0. lg/L、MnS04 · H20 0. 08g/L,H3B040. 06ug/L。在本发明的一个优选实施方式中，所述发酵培养基的组成包括糊精30g/L、鱼蛋白胨20g/L、安琪酵母膏10g/L、基础盐35mL/L、微量元素20mL/L、氨苄青霉素钠50mg/L。优选地，所述诱导剂为乳糖，诱导时机为0D600在O. 5^0. 9时，诱导剂浓度为其在发酵液中的终浓度为1°/Γ5%，诱导时长为32 48小时。优选地，步骤(4)的发酵过程中，添加诱导剂前为菌体生长阶段，控制发酵液的pH值在6. 5^7. O之间，控制发酵温度在28 37°C，控制溶氧在30°/Γ40%有利于菌体繁殖生长；添加诱导剂后为诱导表达阶段，控制发酵液的PH值在7. (Γ7. 5之间，控制发酵温度在2(T28°C，控制溶氧在20% 30%，有利于PLD的诱导生成。本发明中所述的细胞光密度皆指的是0D600值。0D600是追踪液体培养物中微生物生长的标准方法。本发明的生产方法与现有技术相比具有以下有益效果(I)采用慢速利用碳源糊精作为碳源，一方面增加了细胞的培养密度，实现了高密度发酵，另一方面减缓了 PLD的表达速度减少了包涵体的生成；(2)利用乳糖代替IPTG作为诱导剂，一方面由于不使用昂贵的IPTG，降低了成本，避免了 IPTG的毒性，另一方面，乳糖作为诱导剂可在一定程度上减缓 PLD的表达速度，利于可溶性表达，同时乳糖在诱导的同时还起到了补充碳源的作用，增加了细胞的培养密度；(3)通过发酵培养基和发酵工艺条件的系统优化，最终重组PLD的可溶性表达达到90%以上，活性PLD表达量达到68mg/Lssw，发酵酶活达到30U/mLsgw以上。
具体实施例方式以下具体实施例用于进一步阐明本发明，应该理解的是，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。本发明中的基因工程菌一重组大肠杆菌的构建按照常规分子生物学操作完成(参考pET系统操作手册，第10版，2002年；《分子克隆》，科学出版社，第二版，2002年)。本实验使用的发酵罐为Bioengineering AG生产的5L发酵罐。本发明重组PLD生产的一个具体实施步骤包括( I)配制摇瓶种子培养基和发酵培养基；(2)将构建的重组基因工程菌在平板上活化16 20小时，再挑取在平板上活化后的基因工程菌接种至含有IOOmL摇瓶种子培养基的500mL摇瓶中，在37°C的条件下以200r/min的转速振荡培养10-16小时，再按接种液/摇瓶种子培养基的体积比为20%的接种量将前述振荡培养液接入二级摇瓶中，同样条件下再振荡培养10-16小时，得到种子液。分两次摇瓶培养只是为扩大菌株的培养量，这是常规操作。(3)将经步骤(2)振荡培养后得到的种子液接入发酵培养基中进行发酵，接种比例按照种子液/发酵培养基(V/V)为1°/Γ10%进行；发酵培养的温度控制在2(T37°C，发酵液的pH值控制在6. 5^7. 5，溶氧控制在20°/Γ40% ;当发酵液中的细胞光密度0D600在O. 5^0. 9时，向发酵液中添加诱导剂至其在发酵液中的终浓度为1°/Γ5% ;然后继续发酵32 48小时；(4 )步骤(3 )完成后，采用常规方法从步骤(3 )所得发酵液的培养物中获得PLD，经后续处理，完成整个生产过程。上述步骤中用到的摇瓶种子培养基的组成包括甘油10g/L、胰蛋白胨20g/L、酵母膏10g/L、磷酸氢二钠5g/L和氨苄青霉素钠50mg/L，pH值为7. O。其配制过程如下称取IOg甘油、20g胰蛋白胨、IOg酵母膏、5g磷酸氢二钠,溶解在800ml去离子水中,调节pH至7.0，用去离子水定容至1000ml，121°C下灭菌20分钟，待溶液冷却至室温后加入经过滤灭菌的氨苄青霉素钠使其最终浓度为50mg/L。上述步骤中用到的发酵培养基组成包括糊精2(T50g/L、鱼蛋白胨10_30g/L、安琪酵母膏5 15g/L、基础盐2(T50mL/L、微量元素l(T30mL/L、氨苄青霉素钠3(Tl00mg/L。其中基础盐组成包括 K2HPO4 ·3Η20 50g/L,KH2PO4 20g/L、(NH4) 2S042g/L、NaC12g/L、NaHP04 · 12H2070g/L、CaCl2L 2g/L、MgS043. 5g/L ;微量元素组成包括 FeS04 · 7H20 2g/L、CoC12 · 6H200. 4g/L、ZnC12 0. 3ug/L、Na2Mo04 · 2H20 0. 2g/L、CuS04 · 5H20 0. lg/L、MnS04 ·Η20 0. 08g/L, H3B040. 06ug/L。发酵培养基中的糊精主要为菌株的生长提供碳源，其他常见的碳源还有甘油、蔗糖、葡萄糖、山梨醇、淀粉、乳糖等；鱼蛋白胨、安琪酵母膏主要为菌株的生长提供氮源，一般常见的氮源还有玉米浆、牛骨蛋白、大豆粉、花生粉、牛肉膏等有机氮源，以及NaN03、(NH4) 2SO4和尿素等无机氮源。 本发明PLD酶活的测定方法如下( I)酶活测定所需缓冲液I摩尔/升的pH 8. O的Tris-HCl缓冲液、O.1摩尔/升的pH 8. O的Tris-HCl缓冲液、20毫摩尔/升pH 7. 5的Tris-HCl缓冲液。以上缓冲液配制按照常规操作进行。(2)底物溶液的配制称取磷脂酰胆碱100毫克、O. 111克无水氯化钙溶于100毫升20毫摩尔/升pH
7.5的Tris-HCl缓冲液中，再向其中添加100微升曲拉通100，用玻璃棒充分搅拌，使磷脂酰胆碱完全溶解形成均一的溶液，此即为测酶活的底物溶液。( 3 )反应终止液称取乙二胺四乙酸二钠(EDTA) 3. 7224克溶于100毫升I摩尔/升的pH 8. O的Tris-HCl缓冲液既得反应终止液。(4)显色液称取O. 0076克苯酚、O. 011克4-氨基安替比啉溶于50毫升O.1摩尔/升的pH
8.O的Tris-HCl缓冲液既得显色液。(5)显色混合酶液称取不同量的胆碱氧化酶和辣根过氧化物酶溶入5毫升O.1摩尔/升的pH 8. O的Tris-HCl缓冲液中，使最终的溶液中含62. 5U的胆碱氧化酶和50U的辣根过氧化物酶。(6)酶活测定具体操作步骤取I毫升底物溶液加入具塞试管中，再向其中添加适量的PLD酶液(如果酶活过高，可适当稀释后再测，使最终测定的0D500在标准曲线的线性范围内)得反应混合物。对照以等酶量体积的20毫摩尔/升pH 7. 5的Tris-HCl溶液代替酶液。上述反应混合物置于37°C水浴中反应10分钟，反应结束后向反应混合物中迅速加入200微升的反应终止液，并置于沸水中煮沸10分钟。煮沸后置于室温下，待反应混合物温度降到室温后，向反应混合物中分别加入100微升显色液和100微升的显色混合酶液，然后置于37°C水浴中显色30分钟，显色过程中要经常震荡。显色结束后将不同测酶活反应混合物在8000转/分钟下离心10分钟，离心结束后取上清在500nm测定0D500，以对照作为空白。以不同浓度的氯化胆碱溶液代替PLD酶液按照上述操作步骤绘制标准曲线。根据0D500的值及标准曲线计算出反应混合物中胆碱的量，根据胆碱的量和酶活定义计算出酶液的酶活单位。上述测定条件下，酶活的定义为每分钟水解释放I微摩尔胆碱所需要的酶量定义为I个酶活单位。1、碳源对重组PLD生产的影响。在相同的操作条件下，本实施例用甘油、蔗糖、葡萄糖、山梨醇、淀粉、乳糖等常见碳源分别代替糊精作为发酵培养基中碳源，以对比不同碳源对于所生产的PLD的酶活性的影响。结果表明(表I)，使用替代碳源时所产PLD的酶活均比糊精要低，替代碳源的浓度增加对酶活没有明显促进作用甚至还导致酶活下降。表I碳源对重组基因工程菌产PLD的影响
权利要求
1.一种重组磷脂酶D的生产方法，其特征在于，包括如下步骤(1)构建重组基因工程菌，该基因工程菌为表达了磷脂酶D的重组大肠杆菌；(2)配制摇瓶种子培养基和发酵培养基；(3)将构建的重组基因工程菌在平板上活化16 20小时，再挑取在平板上活化后的基因工程菌接种至装有摇瓶种子培养基的摇瓶中，在37°C的条件下振荡培养10-16小时，得到种子液；(4)将得到的种子液接入发酵培养基中进行发酵，接种比例按照种子液/发酵培养基 (V/V)为19TlO%进行；发酵培养的温度控制在2(T37°C，发酵液的pH值控制在6. 5^7. 5，溶氧控制在20°/Γ40% ;当发酵液中的细胞光密度0D600在O. 5^0. 9时，向发酵液中添加诱导剂至其在发酵液中的终体积浓度为1°/Γ5% ;然后继续发酵32 48小时；(5)从发酵液的培养物中获得磷脂酶D即可。
2.如权利要求1所述的一种重组磷脂酶D的生产方法，其特征在于步骤(I)中重组基因工程菌的构建采用的质粒为默克公司开发的PET系统质粒；采用的宿主菌为默克公司开发的BL21系列大肠杆菌；采用的磷脂酶D基因来源于微生物。
3.如权利要求2所述的一种重组磷脂酶D的生产方法，其特征在于步骤(I)中重组基因工程菌的构建采用的质粒为默克公司开发的PET系统质粒pET-32(a);采用的宿主菌为默克公司开发的BL21系列大肠杆菌BL21 (DE3)pLysS ;采用的磷脂酶D基因来源于微生物链霉菌。
4.如权利要求1所述的一种重组磷脂酶D的生产方法，其特征在于步骤(2)中摇瓶种子培养基的组成包括甘油8 12g/L、胰蛋白胨15 25g/L、酵母膏8 12g/L、磷酸氢二钠2.5^7. 5g/L和氨苄青霉素钠3(T50mg/L，上述物品溶于去离子水中，定容到1L，用盐酸或氢氧化钠调节PH值为6. 5^7. 5。
5.如权利要求1所述的一种重组磷脂酶D的生产方法，其特征在于步骤(2)中发酵培养基的组成包括糊精2(T50g/L、鱼蛋白胨10-30g/L、安琪酵母膏5 15g/L、基础盐2(T50mL/ L、微量元素l(T30mL/L、氨苄青霉素钠3(Tl00mg/L，上述物品溶于去离子水中，定容到1L。
6.如权利要求5所述的一种重组磷脂酶D的生产方法，其特征在于其中基础盐的组成为=K2HPO4 ·3Η20 占 50g/L,KH2PO4 占 20g/L、(NH4)2SO4 占 2g/L、NaCl 占 2g/L,NaHPO4 · 12H20 占 70g/L、CaCl2 占1. 2g/L、MgSO4 占 3. 5g/L ;而微量元素的组成为=FeSO4 · 7H20 占 2g/L、 CoCl2 · 6H20 占 O. 4g/L、ZnCl2 占 O. 3ug/L、Na2MoO4 · 2H20 占 O. 2g/L、CuSO4 · 5H20 占 0.1 g/L, MnSO4 · H2O 占 0. 08g/L、H3BO4 占 0. 06ug/L。
7.如权利要求1所述的一种重组磷脂酶D的生产方法，其特征在于步骤(4)中添加诱导剂前，用盐酸或氢氧化钠控制发酵液的PH值在6. 5^7. O之间，控制发酵温度在28 37°C， 控制溶氧在30% 40%，诱导时机为0D600在O. 5 O. 9之间。
8.如权利要求1所述的一种重组磷脂酶D的生产方法，其特征在于步骤(4)中添加诱导剂后，用盐酸或氢氧化钠控制发酵液的PH值在7. (Γ7. 5之间，控制发酵温度在2(T28°C， 控制溶氧在20% 30%，诱导表达时间长度为32 48小时。
9.如权利要求1所述的一种重组磷脂酶D的生产方法，其特征在于步骤(4)中的诱导剂为乳糖。
全文摘要
本发明涉及利用基因工程菌发酵生产磷脂酶D的方法，尤其是一种重组磷脂酶D的生产方法。其特点是，包括如下步骤(1)构建重组基因工程菌；(2)配制摇瓶种子培养基和发酵培养基；(3)将构建的重组基因工程菌在平板上活化16~20小时，再接种至装有摇瓶种子培养基的摇瓶中，得到种子液；(4)接入发酵培养基中进行发酵；添加诱导剂至其在发酵液中的终体积浓度为1%~5%；继续发酵32~48小时；(5)从发酵液的培养物中获得磷脂酶D即可。本发明的生产方法与现有技术相比具有以下有益效果采用慢速利用碳源糊精作为碳源，一方面增加了细胞的培养密度，实现了高密度发酵，另一方面减缓了PLD的表达速度减少了包涵体的生成。
文档编号C12R1/19GK103013947SQ20121054525
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月17日 优先权日2012年12月17日
发明者陈龙, 王双平, 成小飞 申请人:宁夏乙征生物工程有限公司