专利名称：人二倍体狂犬病疫苗病毒液的灭活方法
技术领域：
本发明涉及一种人二倍体狂犬病疫苗病毒液的灭活方法，属于生物制品制备技术领域。
背景技术：
狂犬病是一种侵害中枢神经系统的急性病毒性传染病，是迄今为止人类病死率最高的急性传染病，一旦发病死亡率为100%。卫生部2009年、2010年全国法定传染病报告发病、死亡统计表中，狂犬病的死亡率第一，死亡数第三，狂犬病已成为我国最严重的公共卫生问题之一。
为满足我国国内市场的需求，国内很多厂家都在生产狂犬疫苗，主要包括原代地鼠肾细胞、原代鸡胚细胞和VeiO传代细胞疫苗。这些疫苗都存在异源蛋白，外源因子，DNA污染等各种不同的风险因素。人二倍体细胞狂犬病疫苗目前只在欧洲有上市，如美国Wyeth厂，法国Sanofi Pasteur厂和德国Behring厂生产的二倍体疫苗,通过几十年的市场销售，已证实具有良好的免疫原性和安全性，这得益于生产工艺的稳定。国内目前狂犬病疫苗主要为灭活疫苗,灭活疫苗已失去对机体的感染力，但仍保持其免疫原性，可以刺激机体产生相应的免疫力，抵抗野毒株的感染，灭活疫苗免疫效果良好。灭活剂主要为福尔马林和β_丙内酯，但是福尔马林对狂犬病毒有持续的灭活作用，导致疫苗效力不断下降，而丙内酯灭活的疫苗经37°C作用后能完全水解，所以保持交苗效力的相对称定，国内目前狂犬病毒疫苗灭活工艺，采用超滤浓缩后加入β -丙内酯4°C灭活24h后水解灭活剂，工艺较粗略，对灭活过程较少监控，只在灭活完成后进行灭活效果验证，存在灭活过程的不确定性，给大规模化的生产带来未知性，也对终产品的放行具有潜在危险因素。本方法不止在灭活前对技术参数确认，并且在灭活过程中进行灭活效果监控，灭活后进行灭活效果验证试验，通过在灭活步骤增加过滤及转移，以及对灭活条件参数的确定，达到最终生产出的灭活疫苗安全性。
发明内容
本发明目的是提供一种人二倍体狂犬病疫苗病毒液的灭活方法。本发明提供的人二倍体狂犬病疫苗病毒液的灭活方法，包括以下步骤(I)浓缩人二倍体狂犬病疫苗病毒液，浓缩倍数为10 20倍，获得病毒浓缩液；(2)添加灭活剂β -丙内酯，搅拌；(3)灭活病毒液的转移；包括两次灭活病毒液的转移，第I次是将添加了灭活剂并搅拌后的病毒液转移至另一容器，第2次是将第I次转移后的灭活病毒液继续搅拌灭活，然后再转移到无毒区的容器中；(4)水解去除灭活剂。其中，步骤(I)浓缩病毒液的方法是将人二倍体狂犬病疫苗病毒液经3 6μπι的过滤器和O. 8 μ m的过滤器过滤，再进行超滤浓缩.
所述的超滤浓缩是采用IOKB的超滤膜包进行超滤。超滤浓缩前，用不含人血白蛋白的冲洗液平衡超滤膜包，膜包平衡后的回流液的pH值为6. O 8. O。所述的冲洗液为BME液，含质量百分比O. 02%谷氨酰胺，24. 63%碳酸氢钠。进一步，本发明灭活方法中，步骤(I)还包括将超滤浓缩后的浓缩液先后经3 6 μ m的过滤器和O. 45 μ m的过滤器过滤。本发明的狂犬病病毒液浓缩液存放于2 8°C不超过30天。本发明实施例中所用的人二倍体狂犬病疫苗病毒液是在人用二倍体细胞上接种狂犬病病毒株得到的狂犬病病毒收获液。所述的人用二倍体细胞可以为KMB-17、W1-38、MRC-5、2BS中的一种。优选地，本发明所述的狂犬病病毒为狂犬病病毒固定毒PM-1503-3M(简称PM株)。在本发明的实施例中，所用的人用二倍体细胞为MRC-5。 进一步地，步骤(I)获得的浓缩病毒液中人血白蛋白的浓度为40 60mg/ml，浓缩液的PH值为7. O 9. 0,10 15°C下平衡。更进一步地，步骤(I)获得的浓缩病毒液中人血白蛋白的浓度为45 55mg/ml，浓缩液的pH值为7. 5 8. 5。本发明方法中，步骤(2)添加添加灭活剂丙内酯的方法是先将丙内酯用灭菌水1:40倍稀释，再以体积比1:100添加到浓缩病毒液中。其中，步骤(2)搅拌条件为10 15°C下，155 180r/min。其中，步骤(3)中在灭活剂添加后的第50 70min时，进行第I次灭活病毒液的转移；病毒液转移入另一容器后继续搅拌，待添加灭活剂后的第600min 700min时，将灭活液转移到无毒区的容器中继续搅拌灭活至灭活剂添加后的第1400 1500min。进一步地，步骤(3)的操作在10_15°C条件下进行。本发明灭活方法中，将步骤(3)获得的灭活液于37°C进行水解140 160min。本发明的灭活方法对狂犬病毒液的灭活效果好，加入灭活剂后10小时即可完全灭活，且对狂犬病病毒的抗原含量没有负面影响。本发明提供的病毒液灭活方法步骤简单、灭活时间短、灭活效果良好、成本低、无污染，适宜在疫苗制备领域大规模推广应用。说明书附1为丙内酯灭活病毒灭活效果曲线图。图2为丙内酯水解曲线图。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。本发明实施例中使用的狂犬病病毒为固定毒ΡΜ-1503-3Μ (简称PM株)，人二倍体细胞为MRC-5，均购自法国Sanofi Pasteur公司。人二倍体狂犬病疫苗病毒液来自北京民海生物科技有限公司。实施例1狂犬病疫苗病毒液的规模化灭活方法(I)取制备好的人二倍体狂犬病疫苗病毒液的收获液先经3 μ m滤器过滤再经O. 8 μ m滤器过滤，澄清过滤后用Millipore的超滤膜包超滤(10KB)，超滤浓缩前，先用不含人血白蛋白的冲洗液(BME液，含质量百分比O. 02%谷氨酰胺，24. 63%碳酸氢钠)来平衡膜包，检测回流液的PH值，pH值为6. 0，符合要求后进行浓缩，浓缩倍数为14. 6，浓缩后的单次浓缩液先经3 μ m滤器过滤，再经O. 45 μ m滤器过滤后存放于2°C 28天。根据收获的次数，将单次病毒收获液浓缩后合并，调整人血白蛋白的浓度至45mg/ml，测得浓缩液的pH值为7. 50，再将温度平衡至12°C过夜，将丙内酯首先用灭菌注射用水1:40倍稀释，再按照1:100的体积比滴加到浓缩合并液中，12°C下持续搅拌，转速为155r/min，在加入β-丙内酯后第58min时停止搅拌，将灭活液转移至另一容器，使瓶壁或管道中的未灭活病毒不沾染灭活液，继续搅拌(155r/min)灭活，在加入β -丙内酯后第660min时，将灭活液通过区域传递孔转移到无毒区的另一个新容器中继续灭活至灭活剂加入后第1420min时，结束灭活，整个灭活过程保持温度为12°C。将容器转移水浴锅中，37°C水解150min，水解后的灭活液称为原液。命名为实例I。通过气相色谱的分析方法监测β -丙内酯在37°C水解情况，见表I。表I β -丙内酯水解情况分析
进样时间(min) 峰面积 β-丙内麗旨浓度(ppm)
O3377299.4
302706236.0
60 1919 161.7 90 1341 107.1 120 892 64,6 _150_571_344_通过检测结果分析，β -丙内酯在水解150分钟时其浓度由未水解时的299. 4ppm降至34. 4ppm，低于该方法定量限以下，说明β -丙内酯在37°C水解150分钟可完全达到水解效果。实施例2狂犬病疫苗病毒液的规模化灭活方法(2)取制备好的人二倍体狂犬病疫苗病毒液的收获液先经4. 5μπι滤器过滤再经O. 8 μ m滤器过滤,澄清过滤后用Millipore的超滤膜包超滤(IOKB),超滤浓缩前,先用不含人血白蛋白的冲洗液(BME液，含质量百分比O. 02%谷氨酰胺，24. 63%碳酸氢钠)来平衡膜包，检测回流液的PH值，pH值为7. 0，符合要求后进行浓缩，浓缩倍数为18. 8倍，浓缩后的单次浓缩液先经4. 5 μ m滤器过滤，再经O. 45 μ m滤器过滤后存放于4°C 20天。将单次收获液浓缩后合并，调整人血白蛋白的浓度至55mg/ml，测得浓缩液的pH值为8. 43，再将温度平衡至11°C。将丙内酯首先用灭菌注射用水1:40倍稀释，再按照1:100的体积比滴加到浓缩合并液中，ire下,持续搅拌,转速为160r/min,在加入β-丙内酯后60min时停止搅拌，将灭活液转移至另一容器，使瓶壁或管道中的未灭活病毒不沾染灭活液，继续搅拌(160r/min)灭活，在680min时，将灭活液通过区域传递孔转移到无毒区的另一个新容器中继续灭活至灭活剂加入后第1440min (即加入灭活剂后第24小时)时，结束灭活，整个灭活过程保持温度为11 12°C之间。将容器转移水浴锅中，37°C水解144min，水解后的灭活液称为原液。命名为实例2。通过气相色谱的分析方法监测丙内酯在37°C水解情况，其水解情况同实施例I类似，β_丙内酯在水解144分钟时其浓度低于该方法定量限以下，说明本实施例中β -丙内酯在37°C水解144分钟可完全达到水解效果。实施例3狂犬病疫苗病毒液的规模化灭活方法(3)取制备好的人二倍体狂犬病疫苗病毒液的收获液先经6 μ m滤器过滤再经O. 8 μ m滤器过滤，澄清过滤后用Millipore的超滤膜包超滤(10KB)，超滤浓缩前，先用不含人血白蛋白的冲洗液(BME液，含质量百分比O. 02%谷氨酰胺，24. 63%碳酸氢钠)来平衡膜包，检测回流液的PH值，pH值为8. 0，符合要求后进行浓缩，浓缩倍数为16. 7倍，浓缩后的单次浓缩液先经6 μ m滤器过滤，再经O. 45 μ m滤器过滤后置于6°C环境下保存30天。根据收获的次数，将单次收获液浓缩后合并，调整人血白蛋白的浓度至48mg/ml，测得浓缩液的pH值为8. 30，再将温度平衡至11.5°C，将丙内酯首先用灭菌注射用水1:40倍稀释，再按照1:100的体积比滴加到浓缩合并液中，在11 12°c条件下持续搅拌，转速为170r/min，在加入 β -丙内酯后62min时停止搅拌，将灭活液转移至另一容器，使瓶壁或管道中的未灭活病毒不沾染灭活液，继续搅拌(170r/min)灭活，在加入β -丙内酯后第700min时，将灭活液通过区域传递孔转移到无毒区的另一个新容器中继续灭活至灭活剂加入后第1460min时，结束灭活，整个灭活过程保持温度为11 12°C之间。将容器转移水浴锅中，37°C水解156min，水解后的灭活液称为原液。命名为实例3。通过气相色谱的分析方法监测丙内酯在37°C水解情况，其水解情况同实施例I类似，β_丙内酯在水解156分钟时其浓度低于该方法定量限以下，说明本实施例中β -丙内酯在37°C水解156分钟可完全达到水解效果。实施例4狂犬病疫苗病毒液的规模化灭活方法(4)取制备好的人二倍体狂犬病疫苗病毒液的收获液先经3 μ m滤器过滤再经O. 8 μ m滤器过滤，澄清过滤后用Millipore的超滤膜包超滤(10KB)，超滤浓缩前，先用不含人血白蛋白的冲洗液(BME液，含质量百分比O. 02%谷氨酰胺，24. 63%碳酸氢钠)来平衡膜包，检测回流液的PH值，pH值为7. 5，符合要求后进行浓缩浓缩后的单次浓缩液先经3 μ m滤器过滤，再经0.45 μ m滤器过滤后存放于8°C 3天。根据收获的次数，按照上述浓缩。对于最后一次浓缩，通过计算使多次浓缩合并液的浓缩倍数为16. 8。将单次收获液浓缩后合并，调整人血白蛋白的浓度至60mg/ml，测得浓缩液的pH值为7. 90，再将温度平衡至12. 5°C过夜，将β-丙内酯首先用灭菌注射用水1:40倍稀释，再按照1:100的体积比滴加到浓缩合并液中，保持温度为12 13°C之间，持续搅拌165r/min，在加入β -丙内酯后60min时将灭活液转移至另一容器，使瓶壁或管道中的未灭活病毒不沾染灭活液，继续搅拌(165r/min)灭活，在加入β -丙内酯后620min时，将灭活液通过区域传递孔转移到无毒区的另一个新容器中继续灭活至灭活剂加入后第1400min时，结束灭活，整个灭活过程保持温度在12 13°C之间。将容器转移水浴锅中，37°C水解140min，水解后的灭活液称为原液。命名为实例4。通过气相色谱的分析方法监测丙内酯在37°C水解情况，其水解情况同实施例I类似，β_丙内酯在水解140分钟时其浓度低于该方法定量限以下，说明本实施例中β -丙内酯在37°C水解140分钟可完全达到水解效果。实施例5狂犬病疫苗病毒液的规模化灭活方法(5)
取制备好的人二倍体狂犬病疫苗病毒液的收获液先经3 μ m滤器过滤再经O. 8 μ m滤器过滤，澄清过滤后用Millipore的超滤膜包超滤(10KB)，超滤浓缩前，先用不含人血白蛋白的冲洗液(BME液，含质量百分比O. 02%谷氨酰胺，24. 63%碳酸氢钠)来平衡膜包，检测回流液的PH值，pH值为7. 8，符合要求后进行浓缩，浓缩后的单次浓缩液先经3μπι滤器过滤，再经0.45 μ m滤器过滤后存放于2°C。根据收获的次数，按照上述浓缩。对于最后一次浓缩，通过计算使多次浓缩合并液的浓缩倍数为13. 2。将单次收获液浓缩后合并，调整人血白蛋白的浓度至55mg/ml，测得浓缩液的pH值为8. 00，再将温度平衡至12°C过夜，将β -丙内酯首先用灭菌注射用水1:40倍稀释，再按照1:100的体积比滴加到浓缩合并液中，在12°C下持续搅拌170r/min，在加入β-丙内酯后50min时将灭活液转移至另一容器，使瓶壁或管道中的未灭活病毒不沾染灭活液，继续搅拌(160r/min)灭活，在加入β -丙内酯后690min时，将灭活液通过区域传递孔转移到无毒区的另一个新容器中继续灭活至灭活剂加入后第1430min时，结束灭活，整个灭活过程保持温度为12°C。将容器转移水浴锅中，37°C水解148min,水解后的灭活液称为原液。命名为实例5。 通过气相色谱的分析方法监测丙内酯在37°C水解情况，其水解情况同实施例I类似，β_丙内酯在水解148分钟时其浓度低于该方法定量限以下，说明本实施例中β -丙内酯在37°C水解148分钟可完全达到水解效果。实施例6狂犬病疫苗病毒液的规模化灭活方法(6)取制备好的人二倍体狂犬病疫苗病毒液的收获液先经6 μ m滤器过滤再经O. 8 μ m滤器过滤，澄清过滤后用Millipore的超滤膜包超滤(10KB)，超滤浓缩前，先用不含人血白蛋白的冲洗液(BME液，含质量百分比O. 02%谷氨酰胺，24. 63%碳酸氢钠)来平衡膜包，检测回流液的PH值，pH值为7. 6，符合要求后进行浓缩，浓缩后的单次浓缩液先经6μπι滤器过滤，再经0.45 μ m滤器过滤后存放于4°C 10天。根据收获的次数，按照上述浓缩。对于最后一次浓缩，通过计算使多次浓缩合并液的浓缩倍数为17.1。将单次收获液浓缩后合并，调整人血白蛋白的浓度至40mg/ml，，测得浓缩液的pH值为9. 0，再将温度平衡至10°C，将β-丙内酯首先用灭菌注射用水1:40倍稀释，再按照1:100的体积比滴加到浓缩合并液中，10 12°C温度范围内，持续搅拌，转速为180r/min，在加入β-丙内酯后70min时将灭活液转移至另一容器，使瓶壁或管道中的未灭活病毒不沾染灭活液，继续搅拌(165r/min)灭活，在加入β -丙内酯后670min时，将灭活液通过区域传递孔转移到无毒区的另一个新容器中继续灭活至灭活剂加入后第1500min时，结束灭活，整个灭活过程保持温度为10 12°C温度之间。将容器转移水浴锅中，37°C水解160min，水解后的灭活液称为原液。命名为实例6。通过气相色谱的分析方法监测丙内酯在37°C水解情况，其水解情况同实施例I类似，β_丙内酯在水解160分钟时其浓度低于该方法定量限以下，说明本实施例中β -丙内酯在37°C水解160分钟可完全达到水解效果。实施例7灭活效果的验证(动物试验)按实施例1 6的方法,分别于灭活剂加入后第1、3、5、7、10、12、14小时和原液取灭活病毒悬液各5ml，在20分钟内进行脑腔注射20只小鼠，每只O. 03ml，小鼠为SPF级昆明小鼠，12 15g，雄性，注射后每日观察，连续观察22天，记录小鼠是否有体重减轻或麻痹、瘫痪等狂犬病病症。试验结束后计算小鼠体重平均增加情况.，并计算动物死亡率。
表2 β -丙内酯灭活狂犬病疫苗病毒液接种小鼠死亡率情况
权利要求
1.一种人二倍体狂犬病疫苗病毒液的灭活方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)浓缩人二倍体狂犬病疫苗病毒液，浓缩倍数为10 20倍，获得病毒浓缩液； (2)添加灭活剂β-丙内酯，搅拌； (3)灭活病毒液的转移；包括两次灭活病毒液的转移，第I次是将添加了灭活剂并搅拌后的病毒液转移至另一容器，第2次是将第I次转移后的灭活病毒液继续搅拌灭活，然后再转移到无毒区的容器中； (4)水解去除灭活剂。
2.如权利要求1所述的灭活方法，其特征在于，步骤(I)浓缩病毒液的方法是将狂犬病病毒液先后经3 6 μ m的过滤器和O. 8 μ m的过滤器过滤，然后进行超滤浓缩。
3.如权利要求2所述的灭活方法，其特征在于，所述的超滤浓缩是采用IOKB的超滤膜包进行超滤。
4.如权利要求2所述的灭活方法，其特征在于，还包括将超滤浓缩后的浓缩液先后经3 6 μ m的过滤器和O. 45 μ m的过滤器过滤。
5.如权利要求1 4任一所述的灭活方法，其特征在于，步骤(I)获得的浓缩病毒液中人血白蛋白的浓度为40-60mg/ml，浓缩液的pH值为7. O 9. 0,10_15°C下平衡。
6.如权利要求1所述的灭活方法，其特征在于，步骤(2)添加添加灭活剂β-丙内酯的方法是先将β_丙内酯用灭菌水1:40倍稀释，再以体积比1:100添加到浓缩病毒液中。
7.如权利要求1所述的灭活方法，其特征在于，步骤(2)搅拌条件为10 15°C下，155 180r/mino
8.如权利要求1所述的灭活方法，其特征在于，步骤(3)中在灭活剂添加后的第50 70min时，进行第I次灭活病毒液的转移；病毒液转移入另一容器后继续搅拌，待添加灭活剂后的第600min 700min时，将灭活液转移到无毒区的容器中继续搅拌灭活至灭活剂添加后的第1400 1500min。
9.如权利要求1所述的灭活方法，其特征在于，步骤(3)的操作在10 15°C条件下进行。
10.如权利要求1所述的灭活方法，其特征在于，将步骤(3)获得的灭活液于37°C进行水解 140 160min。
全文摘要
本发明提供一种人二倍体狂犬病疫苗病毒液的灭活方法，该方法包括以下步骤，即浓缩病毒液、添加灭活剂、病毒灭活液的转移、水解去除灭活剂。本发明的灭活方法对人二倍体狂犬病疫苗病毒液的灭活效果好，加入灭活剂后10小时即可完全灭活，且对狂犬病病毒的抗原含量没有负面影响。本发明提供的病毒液灭活方法操作步骤简单、灭活时间短、成本低、无污染，适宜在疫苗制备领域大规模应用。
文档编号C12N7/06GK103013933SQ20121054606
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月14日 优先权日2012年12月14日
发明者左静, 高正伦, 刘海文, 方群, 季振涛, 郑森远, 张骞, 刘勇, 张芮铭, 代凡, 吴淞, 张雪, 戴会忠, 刘雅静, 王云达, 樊鹏 申请人:北京民海生物科技有限公司