专利名称：(r)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法
技术领域：
本发明属于生物制药和绿色化学领域，具体涉及一种(R) -4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法
背景技术：
阿托伐他汀(atorvastatin,商品名立普妥，Lipitor)是世界上第一个年销售额超过百亿美元的药品。它通过抑制羟甲基戊二酰CoA还原酶，阻碍肝脏中胆固醇合成的限速步骤来降低血液中胆固醇的含量。现在工艺的关键步骤是利用(S)-4_氯-3-羟基丁酸乙酯(A4) —步法合成(R) -4-氰基-3-羟基丁酸乙酯(A5) (Angew. Chem.1nt. Ed. 2005，44:362-365)。 在该步反应中，由于生物法避免了化学法中存在的碱性条件下形成副产物过多，分离纯化困难的缺点，因此利用齒代醇脱齒酶(halohydrin dehalogenase, HHDH)从A4合成A5的工艺已经被研究。美国专利US 7125693和US 7132267公布了 Codexis公司对于该项目的研究，其酶投料量为底物的1.5%(w/w)，粗收率为93%。之后国内的专利CN102168117A对该工艺进行了改良，实现了氰化钠的回收利用，但是其酶投料量高达底物的8. 0%(w/w)，粗收率仅为 83. 8%ο综合以上文献检索信息，我们发现目前存在的工艺中，存在着酶用量过高，反应条件不适当等缺陷。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种改进的(R)-4_氰基-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法。为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案一种(R)-4_氰基-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法，其以(S)-4_氯-3-羟基丁酸乙酯为底物，该底物在生物催化剂的作用下，与氰化钠反应生成目标产物(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯，所述的生物催化剂为重组卤代醇脱卤酶，所述的重组卤代醇脱卤酶的制备方法为将卤代醇脱卤酶单菌落接种到含氨苄青霉素抗性的液体LB培养基中，于30-40°C下摇床活化8-12小时，将活化后得到的培养物转接到含氨苄青霉素抗性的液体LB培养基中，于30-40°C下扩大培养至0D600值达到O. 6-0. 8，加入诱导剂，于25_35°C继续培养8-12小时，离心收集沉淀物，加入磷酸盐缓冲液得悬浮液，将悬浮液置于冰浴中超声波破碎8-12分钟，再离心，分离上清液，将上清液预冻至温度为-1(T-25°C，然后再冻干24-48小时，即得重组卤代醇脱卤酶，所述的反应在PH为6-8的水相中进行。进一步地，在起始时的反应体系中，所述的底物(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的浓度为150-200mg/ml，所述的重组卤代醇脱卤酶为底物(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的O.4-1% (w/w)0进一步地,在起始时的反应体系中,所述的氰化钠与所述的底物(S)-4-氯-3-轻基丁酸乙酯的摩尔比为1. 5-2. 5:1。进一步地，反应结束后底物的转化率为98-100%，产物光学纯度大于99%，纯度大于 97%。优选地，所述的反应在pH为7. O的水相中进行。优选地，所述的反应中所述的重组卤代醇脱卤酶为底物(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的 O. 5% (w/w)0优选地，所述的反应中底物(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的浓度为200mg/ml。
优选地，所述的诱导剂为异丙基_β-D-硫代半乳糖苷或乳糖。进一步地，所述的制备方法的实施过程如下在反应容器中依次加入水，底物
(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，搅拌均匀后慢慢滴加氰化钠溶液，再加入重组卤代醇脱卤酶，在40-60°C下搅拌反应，利用GC检测反应进程，待转化率大于98%时，加入硫酸调节pH至2-3，加入乙酸乙酯萃取，合并有机相，旋转蒸发即得(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯产品。根据本发明，除重组卤代醇脱卤酶，其余原料均可由通用渠道商购获得。本发明的有益效果在于本发明通过采用重组卤代醇脱卤酶催化反应并通过对工艺的优化，使得底物浓度提高，酶用量降低，从而降低了生产成本，并且使得产品的纯度和收率都有所提高。
具体实施例方式本发明的反应式如下
权利要求
1.一种(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法，其以(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯为底物，该底物在生物催化剂的作用下，与氰化钠反应生成目标产物(R)_4-氰基-3-羟基丁酸乙酯，其特征在于所述的生物催化剂为重组卤代醇脱卤酶，所述的重组卤代醇脱卤酶的制备方法为将卤代醇脱卤酶单菌落接种到含氨苄青霉素抗性的液体LB培养基中，于30-40°C下摇床活化8-12小时，将活化后得到的培养物转接到含氨苄青霉素抗性的液体LB培养基中，于30-40°C下扩大培养至0D600值达到O. 6-0. 8，加入诱导剂，于25-35°C继续培养8-12小时，离心收集沉淀物，加入磷酸盐缓冲液得悬浮液，将悬浮液置于冰浴中超声波破碎8-12分钟，再离心，分离上清液，将上清液预冻至温度为-1(T-25°C，然后再冻干24-48小时，即得重组卤代醇脱卤酶，所述的反应在pH为6-8的水相中进行。
2.根据权利要求1所述的(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法，其特征在于在起始时的反应体系中，所述的底物(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的浓度为150-200 mg/ml，所述的重组卤代醇脱卤酶为底物(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的O. 4-1% (w/w)0
3.根据权利要求1所述的(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法，其特征在于在起始时的反应体系中，所述的氰化钠与所述的底物(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的摩尔比为1. 5-2. 5:1。
4.根据权利要求1所述的(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法，其特征在于所述的反应在pH为7. O的水相中进行。
5.根据权利要求1所述的(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法，其特征在于所述的诱导剂为异丙基_β -D-硫代半乳糖苷或乳糖。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法，其特征在于所述的制备方法的实施过程如下在反应容器中依次加入水，底物(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，搅拌均匀后慢慢滴加氰化钠溶液，再加入重组卤代醇脱卤酶，在40-60°C下搅拌反应，利用GC检测反应进程，待转化率大于98%时，加入硫酸调节pH至2-3，加入乙酸乙酯萃取，合并有机相，旋转蒸发即得(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯产品。
全文摘要
一种(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法，其以(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯为底物，该底物在生物催化剂的作用下，与氰化钠反应生成目标产物(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯，所述的生物催化剂为重组卤代醇脱卤酶，所述的反应在pH为6-8的水相中进行。本发明通过采用重组卤代醇脱卤酶，使得底物浓度提高，酶用量降低，从而降低了生产成本，并且本发明通过对工艺的优化，使得产品的纯度和收率都有所提高。
文档编号C12P13/00GK103014082SQ20121055637
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月20日 优先权日2012年12月20日
发明者鞠鑫, 尹将来, 张超 申请人:苏州汉酶生物技术有限公司