专利名称：Rankl-tnf样区鼠源性单克隆抗体及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物制剂领域，具体地，涉及RANKL-TNF样区鼠源性单克隆抗体及其制备方法与应用。
背景技术：
类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis, RA)是一种慢性全身性自身免疫性疾病。 RA有两个主要的病理学特征，表现为慢性的滑膜炎症以及继发的关节软骨与骨的破坏，最终导致患者关节畸形而致残。2006年国家统计局进行的第二次残疾人调查中发现，类风湿关节炎的致残率占疾病所致肢体残疾的79. 4%，造成劳动力丧失，严重影响国民健康水平和国家经济发展，因此研究新型制剂治疗RA具有重要的意义。
慢性进展性的系统性炎症伴随着RA的发生和发展。关节腔与滑膜组织浸润的炎性细胞及其分泌的炎性细胞因子导致了炎症的发生。肿瘤坏死因子a (Tumor necrosis factor, TNF-α )是居于炎性瀑布最上游的炎性细胞因子之一，是一个早期且重要的介导下游炎症正反馈过程的启动因子，可以调节RA慢性炎症的发生和发展。RA中TNF-α主要由活化的巨噬细胞和T细胞所分泌，巨噬细胞的数量、TNF- α的水平与RA病人的关节疼痛指数密切相关。TNF-α从以下几方面参与RA的病理损伤TNF-α可以刺激滑膜巨噬细胞、纤维母细胞产生IL-1、IL-8等促炎细胞因子，它们与TNF-α协同作用，导致炎症发生与组织损伤；TNF-a可诱导内皮细胞表达分泌粘附因子与趋化因子，促使白细胞等炎性细胞向炎症部位渗透；TNF_a可活化自身的环氧酶/环氧化酵素(Cyclooxygenase, C0X),促进前列腺素E2 (Prostaglandin E2, PGE2)与血管扩张素和组织胺的分泌，共同作用加剧血管翳的生成。
RA的骨破坏包括关节软骨与软骨下骨的侵蚀与破坏。破骨细胞(Osteoclast，0C) 的异常增殖与活化所介导的骨代谢失衡是导致RA关节骨破坏的关键。核因子K B活化受体配基(Receptor activator necrosis factor κ B ligand, RANKL)是影响破骨细胞分化与成熟的关键因子。RANKL是TNFSF的成员，有跨膜三聚体与可溶单体两种类型，主要分布在免疫系统、骨骼系统和循环系统中。由活化的T细胞、成纤维样滑膜细胞、巨噬细胞、 成骨/基质细胞分泌的RANKL与骨髓基质细胞、破骨前体细胞膜表面的RANKL受体RANK (Receptor activator NF-κ B)相结合。RANK胞内区与肿瘤坏死因子受体相关因子6 (TNF receptor-associated factor6, TRAF6)结合可活化下游的转录因子NF- κ B,继而可启动核因子活化的 T 细胞 cl (Nuclear factor ofactivated T cell cl, NFATcl),从而可促使破骨细胞分化的相关基因表达，促进了破骨前体细胞增殖分化为成熟的破骨细胞。在体外实验中，应用RANKL与巨卩遼细胞集落刺激因子(Macrophage colony stimulating factor, M-C SF)共同刺激，可以促使骨髓基质细胞分化为成熟的破骨细胞。TNF-α也同时参与到骨损失的过程，TNF- α与成骨/基质细胞膜表面受体结合后可以促进RANKL的表达，同时TNF- α 与破骨细胞及其前体细胞膜表面受体TNFRl或TNFR2相 结合后，启动下游NF-kB、JNK、P38、 ERK和AKt信号，调节破骨细胞的生成与功能。
RA病因尚未完全阐明，是临床上一种难治性疾病，虽然现在治疗手段很多，但都不甚理想。现在已有三种TNF拮抗剂投入临床用于RA的治疗，英夫利昔(Infliximab)、 依那西普(Etanercept)、阿达木(Adalimumab)。英夫利昔为人鼠嵌合单抗，阿达木为全人源化单抗，依那西普为人TNFR2与人的Fe Y I的融合蛋白。在临床上常与甲氨蝶呤 (Methotrexate，MTX)联合应用治疗RA，但TNF-α单抗对抗骨侵蚀作用的效果不一。研究发现，用RANKL单克隆抗体或RANK-Fc能有效改善绝经后骨质疏松以及肿瘤转移性溶骨的骨侵蚀症状。狄诺塞麦(Denosumab)是一种全人源化的抗RANKL的IgG2亚类的单克隆抗体,2010年6月正式被美国食品药物管理局(Food and drug administration, FDA)批准上市，目前，已在27个欧盟成员国及挪威、冰岛和列支敦士登获得批准使用。同时，狄诺赛麦也获美国FDA批准用于骨折风险高的绝经后女性骨质疏松症的治疗，也适用于对其他现有的骨质疏松症治疗方法不耐受或无反应的女性。药理研究证实，狄诺赛麦可抑制破骨细胞的生成、功能和存活，因此可减少骨的再吸收，增加骨小梁和皮质骨内的骨量和强度，但其缺点是对炎症性滑膜炎没有治疗效果，必须与抗TNF-α的其他制剂联合应用。TNF-α的拮抗剂价格较昂贵，RANKL的单克隆抗体还并未在国内上市应用，且联合用药增加了 RA病人的痛苦与经济压力。目前，还没有一种治疗RA的生物制剂能够在缓解炎症的同时抑制骨破坏，研制新型的制剂是亟待解决的问题。发明内容
为了解 决上述技术问题，本发明目的是提供一种RANKL-TNF样区鼠源性单克隆抗体杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体。
本发明另一目的是提供含有上述单克隆抗体的药物。
本发明又一目的是提供上述单克隆抗体在制备治疗炎性骨病或骨质疏松药物中的应用。
为实现上述目的，本发明针对RA发病机制中导致炎症与骨破坏的两个主要致病因子，RANKL与TNF- α，其同为肿瘤坏死因子超家族(tumor necrosis factor superfamily, TNFSF)成员，一级氨基酸序列存在高度相似区，受体配体的识别及其后续的信号转导存在交叉。选取了人RANKL胞外域TNF样区中与TNF-α高度相似的两段区域 171-234和246-309氨基酸残基，以此为基础制备了融合蛋白(具体制备方法参照专利申请号201110135019. 3中公开的方法)。利用该融合蛋白免疫小鼠，获得了可以同时针对人 RANKL和人TNF- α这两个靶点的单克隆抗体。
具体而言，本发明采用小鼠淋巴细胞杂交瘤技术制备RANKL-TNF样区鼠源性单克隆抗体，包括如下步骤
I)动物免疫以人RANKL胞外域TNF样区的171-234与246-309氨基酸序列制备的融合蛋白为免疫原免疫6-8w的BALB/c小鼠。
2)小鼠骨髓瘤细胞的培养培养处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0，并用 8_氮鸟嘌呤(终浓度为20-30 μ g/ml)筛选，保持次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)缺陷。
3)细胞融合收集步骤I)中免疫小鼠的脾细胞，与步骤2)中的骨髓瘤细胞以5:1 的比例混合，以聚乙二醇介导细胞融合，用HAT培养基重悬细胞后，接种于96孔细胞培养板中培养。
4)杂交瘤细胞的筛选酶联免疫吸附检测法(ELISA)和Westernblotting鉴定培养上清中抗体的分泌情况，筛选阳性克隆。
5)杂交瘤细胞的亚克隆培养有限稀释法进行亚克隆培养，重复3次亚克隆，直到杂交瘤细胞的阳性孔率达到100%，将杂交瘤细胞进行扩大培养。
通过上述方法获得了一株稳定分泌RANKL-TNF样区鼠源性单克隆抗体的杂交瘤细胞株ARTHC，申请人于2012年11月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)(北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所邮编100101)对其进行了保藏，分类命名为抗RANKL-TNF样区杂交瘤细胞系，保藏号为=CGMCC NO. 6853。通过ELISA 法鉴定，该杂交瘤细胞株可分泌IgGl亚类单克隆抗体，命名该抗体为8G12。
本发明还提供了上述单克隆抗体的药效学实验。实验表明，该抗体在体外能够中和人RANKL与人TNF-α，在体内针对角叉菜胶致TNF-α释放诱导的急性炎症模型与卵巢切除致RANKL升高所诱导的骨质疏松模型发挥治疗作用。进而，本发明还提供含有上述单克隆抗体8G12的药物，所述药物还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。该药物可用于缓解类风湿关节炎的炎症和骨破坏两个病理特征，进而用于治疗类风湿关节炎等炎性骨病。
本发明还提供了所述单克隆抗体在制备治疗炎性骨病药物中的应用。所述炎性骨病伴随骨破坏。所述炎性骨病如类风湿关节炎；本发明还提供了所述单克隆抗体在制备治疗骨质疏松药物中的应用。
本发明的优点在于能够体内外有效中和人TNF-α，缓解炎症的进展，并且也能够中和人RANKL，有效抑制破骨细胞的分化、成熟，缓解骨质疏松的骨损失；是一种能够抑制炎症和骨破坏的双靶点单克隆抗体，可成为一种有效针对类风湿关节炎两个病理特征的单一制剂。
图1中图1A为利用RANKL-TNF样区融合蛋白免疫小鼠，每次免疫后一周，血清内产生的抗RANKL-TNF样区融合蛋白的抗体滴度结果；图1B为经过亚克隆培养后获得的稳定的单克隆细胞株上清所分泌的单克隆抗体的效价测定结果。
图2为Western blotting鉴定本发明单克隆抗体8G12能够与重组人RANKL和人 TNF-α发生特异性的结合。
图3为Infliximab与本发明8G12的量效关系对比图。
图4为本发明8G12体外中和TNF-α的能力；图4A为流式细胞术检测L929 细胞的凋亡率，从左至右分别为阳性对照组(TNF-α，2ng/ml);市售抗体对照组(2ng/ ml TNF- a +1 μ g/ml TNF-a多克隆抗体)；单克隆抗体实验组(2ng/ml TNF- a +10 μ g/ ml8G12);图4B为凋亡率变化的统计分析图(n=4)。
图5为本发明8G12体外中和RANKL的能力；图5A为破骨细胞生成试验，从左至右分别为阴性对照组(M-CSF，30ng/ml);阳性对照组(30 ng/ml M_CSF+40ng/ml RANKL);单克隆抗体实验组(30ng/ml M_CSF+40ng/ml RANKL+10ug/ml8G12)，图5B为破骨细胞数目的统计分析图(η=3) ο
图6为本发明单克隆抗体8G12对角叉菜胶诱导的急性炎症模型的保护作用；图6A为阳性组、8G12治疗组(50mg/kg)、Infliximab治疗组(5mg/kg)、阴性组小鼠足趾肿胀度的测定结果，图6B为诱导炎症4h后，各组小鼠足趾部软组织的HE染色图。
图7为本发明单克隆抗体8G12对卵巢切除诱导的骨质疏松模型的保护作用。图 7A为各组小鼠在手术后30天，体重变化与子宫重量。从左至右分别为卵巢切除组(OVX); 卵巢切除后单克隆抗体治疗组(0VX+8G12);假手术组(Sham)。图7B为Micro-CT扫描各组小鼠左胫骨骨骺板下等体积松质骨的三维重建图，图7C为各组小鼠的Micro-CT分析各组小鼠松质骨的相对骨体积(8￥/17)、表面体积比(85/17)、骨小梁数目(113.幻、骨小梁分离度(Tb. Sp)骨形态学参数。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。 所用试剂均可商业购得。
RANKL-TNF融合蛋白按照专利申请201110135019. 3中的方法制备得到。
实施例1动物免疫
RANKL-TNF融合蛋白免疫6_8w雌性BALB/c小鼠(SPF级)，按体重分组为蛋白免疫组和对照组，腹部皮下多点免疫小鼠(初次免疫后记为第0d，分别于21d、42d、63d加强免疫)，每只小鼠每次免疫剂量为IOOygQOOy I)。初次免疫将免疫原与等量的完全弗氏佐剂(Complete Freud’s adjuvant, CFA)乳化,加强免疫用免疫原与等量的不完全弗氏佐剂 (Incomplete Freud’s adjuvant, IFA)乳化后进行。每次免疫后一周眼眶静脉丛米血，分离血清，间接ELISA法检测小鼠体内产生的中和抗体含量。具体操作为，用RANKL-TNF融合蛋白(5 μ g/ml)包被ELISA板，4°C过夜，并用5%PBST脱脂奶粉室温封闭4h，待测血清1:1000 稀释，HRP标记的二抗1:20,000稀释。血清抗体滴度测定的结果如图1A所示，随着免疫次数的增加，体内产生中和抗体的滴度也随之升高。第84d用100 μ g未经乳化的免疫原腹腔注射进行冲击免疫。
实施例2RANKL-TNF样区单克隆抗体的制备
冲击免疫后第三天，选取抗体滴度最高的小鼠，颈椎脱白处死后，无菌环境下取出小鼠脾脏，分离结缔组织，将脾脏剪碎后用200目细胞研磨器研磨获取脾细胞悬液。提前一周复苏骨髓瘤细胞系SP2/0，应用含20%胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)的RPMI1640 培养基培养。收获骨髓瘤细胞后，分别计数骨髓瘤细胞与脾细胞，将脾细胞与骨髓瘤细胞以 5:1的比例混匀后，4°C离心，1000rpm/min，10min，去掉细胞上清后，轻弹离心管底，将细胞沉淀打散，在Imin内边搅拌混合边逐滴加入lml50%的MW4000的聚乙二醇(PEG)，再匀速搅拌细胞沉淀lmin，静止Imin后边旋转离心管边逐滴加入20%FBS的RPMI1640培养基，3min 内加至20m l，室温离心，1200rpm/min, 5min。离心后，弃上清。配制含有20%FBS的HAT培养基200ml，用HAT培养基重悬细胞后，铺于96孔细胞培养板，每孔加入200 μ I细胞悬液。
实施例3亚克隆筛选鉴定单克隆细胞系
细胞融合后5-7d在显微镜下观察各孔细胞状态，镜下成堆排列的透亮细胞即为融合成功的杂交瘤细胞。用RANKL-TNF融合蛋白(5 μ g/ml)包被ELISA板，4°C过夜，并用5%PBST脱脂奶粉室温封闭4h，取细胞上清50 μ I间接ELISA法检测，HRP标记的二抗 1:20，000稀释。选取产生高滴度抗体(如图1B所示效价为IO4)的细胞进行亚克隆培养。
亚克隆前一天制备小鼠腹腔巨噬细胞，作为饲养层细胞。具体方法为，6_8w BALB/ c(SPF级)颈椎脱白处死后，75%乙醇浸泡消毒，剪开腹部皮肤与腹膜，镊子夹取腹膜，剪开一小口，用钝头移液吸管吸取5mlRPMI1640基础培养基注入小鼠腹腔，反复抽吸数次。吸回腹腔内液体，注入离心管内。用RPMI1640基础培养基洗涤2次，每次4°C离心，1000rpm/min, lOmin，弃上清。用含10%FBS的RPMI1640完全培养基重悬细胞，调整细胞浓度为2 X 105/ml， 每孔100 μ I加入96孔细胞培养板中，37°C、5%C02条件下培养。
亚克隆采用有限稀释法，将原始孔细胞用HAT培养基稀释后重新分到铺有饲养层细胞的96孔细胞培养板中，一个原始孔细胞分到一块板子中。第二次亚克隆后换HT培养基进行筛选培养。通过3次的亚克隆得到可以稳定分泌抗体的细胞系(杂交瘤细胞命名为ARTHC)，将杂交瘤细胞ARTHC进行保藏，保藏号CGMCC NO. 6853 ;保藏时间2012年11 月15日；保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。用间接ELISA法与 Western blotting法鉴定分泌的单克隆抗体能够有效的结合RANKL-TNF融合蛋白，并且能够有效的结合天然人RANKL与人TNF- α，结果如图2所示。通过ELISA法鉴定单克隆抗体的亚类为IgGl型，命名该抗体为8G12。
实施例4单克隆抗体的大量制备
8-10w BALB/c (SPF级)小鼠，腹腔注射液体石蜡0. 5ml/只，Iw后腹腔注射4 X IO6 个杂交瘤细胞(杂交瘤细胞命名为ARTHC) (500 μ IPBS重悬)，7-8d后当小鼠腹部极度膨胀时抽取腹水，4°C离心，15，000rpm/min, IOmin,去除上层油脂和下层的细胞沉淀,上清分装后于-80°C保存。
实施例5单克隆抗体与Infliximab量效关系对比
建立L929细胞凋亡培养体系，细胞复苏后用含有10%FBS的RPMI1640培养基重悬细胞，细胞计数，将细胞浓度调整为lX106/ml，接种于96孔细胞培养板中，在37°C、5%C02 饱和湿度条件下培养 12h,将 Infliximab 与 8G12 稀释为 1000ng/ml、500ng/ml、100ng/ml、 10ng/mlUng/ml后分别与2ng/ml的TNF-α共同混匀后在37°C孵育lh，加入到96孔细胞培养板中连续培养12h，每组设6个复孔。用结晶紫染色法于570nm波长下测定细胞凋亡率，量效关系结果如图3所示，单克隆抗体8G12的半数有效量(ED50)是Infliximab的20 倍。
实施例6单克隆抗体体外中和TNF-α实验
L929细胞系以细胞浓度为IX 106/ml，接种于24孔板中，在37°C、5%C02饱和湿度条件下培养12h，将实验分为阳性对照组(完全培养基)、人TNF-α多克隆抗体(I μ g/ml)对照组以及8G12实验组(10 μ g/ml)分别与2ng/ml的rhTNF-α混匀，37°C孵育Ih后，加入到24孔细胞培养板连续培养12h，每组3个复孔。12h后收取细胞，Annexin V与PI标记细胞，流式细胞术检测细胞的 凋亡率。结果如图4所示，与阳性对照组相比，8G12实验组和抗体对照组的细胞凋亡率明显降低(P值均〈O. 001 )，且8G12实验组和抗体对照组的凋亡率无统计学差异(P=0. 720>0. 05)。该结果表明，在体外，8G12能够有效的缓解TNF-a引起的细胞凋亡作用。
实施例7单克隆抗体体外中和RANKL实验
取6_8w雌性BALB/c小鼠股骨与胫骨，用PBS冲洗收集骨髓腔内细胞，4°C离心， 1000rpm/min, lOmin，红细胞裂解液裂解红细胞后再次离心去除上清，用10%FBS的a-MEM 培养基重悬细胞后，细胞计数，调整细胞浓度为lX106/ml。24孔板内放入细胞爬片，将细胞接种于24孔板内，将实验分为阴性对照组(30ng/ml M-CSF )、阳性对照组(30ng/ml M-CSF+40ng/ml RANKL)、实验组(10 μ g/ml8G12+30ng/ml M_CSF+40ng/ml RANKL)，每组设 3 个复孔。连续培养7d后去除细胞上清，取出细胞爬片，进行TRAP细胞染色，在光学显微镜下观察各组细胞形态变化，并随机挑取10个视野计算TRAP阳性细胞数目。结果如图5所示，阳性对照组有大量TRAP阳性的成熟破骨细胞，8G12实验组与阴性对照组未见明显的成熟破骨细胞。该结果表明，8G12在体外能够有效中和RANKL促进破骨细胞分化与成熟的作用(P 值均〈O. 001)。
实施例8单克隆抗体对急性炎症模型的作用
6_8w雄性BALB/c小鼠，实验分为4组，阳性对照组、8G12实验组、Inf Iiximab治疗组和阴性对照组。分别在皮下注射8G12 (50mg/kg)、Inf liximab (5mg/kg)、阳性与阴性对照组分别注射等量PBS(500 μ I)。注射Ih后，小鼠后右脚足趾部注射1%角叉菜胶溶液，每小时测量小鼠足趾肿胀度。4h后取小鼠足趾部软组织石蜡包埋切片，进行HE染色，观察炎性细胞浸润程度。结果如图6所示，角叉菜胶注射Ih后，与阳性对照组相比，8G12与Infliximab 治疗组小鼠的足趾肿胀度显著降低(*:8G12治疗组对比阳性组，*，p〈0. 05;#，p〈0.01 ； 氺林，ρ〈0· 001 ；# :1nfliximab 治疗组对比阳性组，#，ρ〈0. 05 ；##, p<0. 01 ；###, ρ<0. 001)，组织切片的炎性细胞浸润程度也有所缓解。该结果表明8G12可以有效缓解TNF-α引起的急性炎症。
实施例9单克隆抗体对骨质疏松模型的作用
8w雌性BALB/c小鼠，实验分为卵巢切除组(OVX )、卵巢切除抗体治疗组 (OVX+8G12)、假手术组(Sham)三组，每组6只小鼠。腹腔注射10%水合氯醛(35 μ l/10g), 待小鼠完全麻醉后，从背部切一纵型开口，钝性分离皮下组织后，小鼠两侧背腰部切开肌肉组织后，翻转脂肪垫，可见粉色卵巢组织，分离输卵管与卵巢后，切除双侧卵巢，逐层缝合肌肉和皮肤。手术后第2d开始分别皮下注射50mg/kg(500 μ I) 8G12，假手术组与阳性对照组皮下注射等量PBS。连续给药29d，手术后第30d，处死小鼠，取左胫骨进行Micro-CT扫描， 分析各组小鼠骨形态学参数。结果如图7所示，与假手术组相比，卵巢切除组小鼠的体重升高，子宫重量降低，骨松质密度降低，相对 骨体积(BV/TV)、表面体积比(BS/TV)、骨小梁数目(Tb. N)明显下降，骨小梁分离度(Tb. Sp)等反应松质骨破坏的指标升高。卵巢切除后给予8G12治疗，相对骨体积、表面体积比等骨量指标升高，骨小梁数目增多，骨小梁分离度下降。说明其有效的增加了骨量，改善了骨小梁微结构。(*:8G12治疗组对比OVX组差异显著，*，ρ〈0· 05 ;**，ρ〈0· 01 ;***，ρ〈0· 001 ；# 0VX 组对比 Sham 组差异显著，#，ρ〈0· 05 ；##, ρ<0. 01 ；###,ρ〈0· 001)
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.一种抗RANKL-TNF样区鼠源性单克隆抗体杂交瘤细胞株，其保藏号为CGMCC NO. 6853。
2.权利要求1所述杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。
3.一种用于治疗炎性骨病的药物，其包括权利要求2所述的单克隆抗体。
4.根据权利要求3所述的药物，其特征在于，还包含药学上可接受的载体和/或赋形剂。
5.权利要求2所述单克隆抗体在制备治疗炎性骨病中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述炎性骨病伴随骨破坏。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述炎性骨病为类风湿关节炎。
8.权利要求2所述单克隆抗体在制备治疗骨质疏松药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种RANKL-TNF样区鼠源性单克隆抗体、其制备方法与应用。该单克隆抗体来源于一种抗RANKL-TNF样区鼠源性单克隆抗体杂交瘤细胞株，其保藏号为CGMCC NO.6853。本发明的单克隆抗体及其相关试剂可在体外有效中和TNF-α，抑制TNF-α所致的细胞凋亡，中和RANKL，抑制破骨细胞的生成。在体内能有效缓解急性炎症的程度，增加骨质疏松小鼠的骨量，改善松质骨的骨小梁微结构，有效改善骨质疏松的症状。
文档编号C12R1/91GK103060274SQ20121058566
公开日2013年4月24日 申请日期2012年12月28日 优先权日2012年12月28日
发明者赵文明, 钱红燕, 袁慧慧 申请人:首都医科大学