专利名称：染色体10q26上的年龄-相关黄斑病变(ARM)易感基因的制作方法
染色体10q26上的年龄-相关黄斑病变(ARM)易感基因本申请是2006年6月7日递交的申请号为200680027015. 0，发明名称为“染色体10q26上的年龄-相关黄斑病变(ARM)易感基因”的分案申请。发明者迈克尔 B 高瑞约翰纳 加科伯斯多缇尔耶维特 P 孔利丹尼尔 E 威克斯特玛麦 S 马何-费瑞瑟罗伯特 E 费瑞尔
背景技术：
年龄-相关黄斑病变(已知为一种年龄-相关的黄斑变性)是一种在老年人群中引起中心失明的主要原因，并且大量研究表明一种强潜力基因组成了这种复杂疾病。使用大家系的基因组-范围连锁扫描，患病同胞对，及最近的表型不一致同胞对，已经鉴定了大量潜在的易感 位点。(Klein 等，1998 Age-related maculardegeneration.Clinical features in a large family and linkage tochromosome lq. Archivesof Ophthalomolgy 116 1082-1088. ；Weeks 等 2000A full genomescan for agerelated maculopathy. Human Molecuar Genetics 9 :1329-1349 ;Majewski 等，2003Age~related macular degeneration-a genome scan in extendedfami lies. Am JHum Genet 73 :540-550 ；Schick 等 2003 AwhoIe-genome screen of a quantitativetrait of age-relatedmaculopathy in sibships from the Beaver Dam Eye Study.Am J HumGenet 72 :1412-1424 ;Seddon 等 2003 A genomewide scan forage-relatdmacular degeneration provides evidence for linkage toseveral chromosomalregions. Am J Hum Genet 73 :780-790 ;Abecasis 等 2004-Age-related maculardegeneration a high—resolution genome scan for susceptibility Loci in apopulationenriched for late—stage disease. Am J Hum Genet 74 :482-494 ;Iyengar等，2004 Dissection of genomewide-scan data in extendedfami lies reveals a majorlocus and oligogenic susceptibility forage-related macular degeneration.Am J Hum Genet 74 :20-39 ；Kenealy 等 2004 Linkage analysis for age-relatedmaculardegeneration supports a gene on chromosome 10q26. Mol VislO :57-61 ；Schmidt 等 2004 Ordered subset linkage analysis supportsa susceptibility locusfor age-related macular degeneration onchromosome 16pl2. BMC Genet 5 18 ；Weeks等 2004 Age-relatedmaculopathy a genomewide scan with continued evidenceofsusceptibility loci within the lq31，10q26，and 17q25 regions. Am JHum Gemet75 :174-189 ;Scantangelo 等 2005 A Discordant Sib-Pair Linkage Analysis ofAge-Related Macular Degeneration. Ophthalmic Genetics 26 :61-68)基因组-范围交联扫描强烈显示10q26区域含有年龄-相关黄斑变性(AMD)基因(Weeks等2004)；该区域已经被许多其他研究所支持并且是最近meta分析中的顶-级区域(Fisher等2005 Meta-analysis of genome scans ofage-related macular degeneration. HumMol Genet. 2005 Augl ； 14 (15) :2257-64)。最近，Science 上的三篇文章(Edwards 等2005Complement Factor H Polymorphism and Age-Related MacularDegeneration.Science 308，421-424 ;Haines 等 2005 ComplementFactor H Variant Increases theRisk of Age-Related MacularDegeneration.Science 308，419-421. Klein 等 2005ComplementFactor H Polymorphism in Age-Related Macular Degeneration.Science308,385-389)鉴定了对应于染色体I上交联信号的补体因子H(CFH)上的等位基因变体，其在家族和零星情况中导致ARM重要归因危险性。这些发现已经被证实(Conley等2005Candidate gene analysis suggests a role for fatty acid biosynthesisandregulation of the complement system in the etiology ofage-related maculopathy.Hum Mol Genet 14 :1991-2002 ;Hageman等(2005a)From The Cover A common haplotypein thecomplement regulatory gene factor H(HF1/CFH)predisposesindividualsto age-related macular degeneration. Proc natl Acad SciUSA 102 :7227-7232 ；和 Zareparsi 等 2005a Strong Association of the Y402H Variant in ComplementFactor H at lq32 withSusceptibility to Age-Related Macular Degeneration. AmJ HumGenet 77 :149-53)。CF1H在Hageman和Anderson先前的研究中已经怀疑在ARM中起作用(Hageman 和 Mullins 1999 Molecularcomposition of drusen as related tosubstructural phenotype. Molecular Vision 5 :28 ; Johnson 等 2000 A potential rolefor immunecomplex pathogenesis in drusen formation. Experimental EyeResearch70 :441-449 Complement activation and inflammatoryprocesses in Drusenformation and age related macular degeneration. Experimental Eye Research 73 887-896 ；Mullins 等 2000 Drusenassociated with ageing and age-related maculardegeneration containproteins common to extracellular deposits associatedwithatherosclerosis, elastosis，amyloidosis, and dense deposit desease. FASEBJournal 14:835-846 ；Ha geman 等 2001 An integratedhypothesis that considersdrusen as biomarkers of immune-mediatedprocesses at the RPE-Bruch^ s membraneinterface in aging andage-related macular degeneration. Progress in Retinal &EyeResearch 20 :705-732 Johnson等2001)，我们已经发现许多ARM病人中观察到的视网膜床(玻璃膜疣)含有补体因子。然而直到其他导致ARM的基因被鉴定后，CFII仍然是一个独立的难题，表明选择性途径和炎症是ARM的发病机制，但并非眼科中观察到的唯一病理学。
发明内容
至此，如上所述，等位基因变异型，包括单核甘酸多态性，已经在染色体10q26上鉴定。这里显示这些等位基因变异型与随年龄增长-相关黄斑变性的增高危险性相关。等位基因变异型随L0C387715和/或PLEKHA1基因一起定位在染色体10q26上。一个实施方案中，等位基因变型伴随L0C387715。
在本发明的一个非-限制性实施方案中，提供了一种鉴定高危发生年龄-相关黄斑病变的个体的方法。该方法包括在来源于主体的核酸样本中，鉴定与发生年龄-相关黄斑变性危险性相关的染色体10q26上的等位基因变异的存在。在一个非-限制性实施方案中，等位基因变异发生在染色体10q26上的PLEKHA1/L0C387715/PRSS11。例如并且非限制性的，等位基因变异是发生于PLEKHA1和L0C387715其一或两者上的等位基因变异，例如，非限制性的，L0C387715上的丝氨酸69丙氨酸变异。另一个非-限制实施方案中，变异是包括一种或一种以上定义为rs4146894,rsl0490924, rsl045216, rsl882907, rs760336, rs763720, rs800292, rsl483883 和rsl853886变异的多态性。等位基因变异可以是，非限制性的，产生一种非-功能基因产物的突变和一种基因产物的变异表达，如一种或一种以上移码突变，启动子突变和拼接突变。一个实施方案中，该方法包括在来源于主体核酸样本中进一步定义补体因子H等位基因变异的存在，如，非限制性的，对应于单核甘酸多态性rsl852883的变异。此方法可以使用任何可用的技术，例如非限制性的核酸扩增方法，例如PCR，反转录PCR(RT-PCR)，等温扩增，基于核酸序列扩增(NASBA)，5’荧光核酸方法(例如TAQMAN方法)，核酸信标方法和滚环扩增。这种等位基因变异可以使用一种阵列进行鉴定，其典型地包括一种或一种以上用于在来源于主体的核酸样本中，鉴定包括两种或多种单核甘酸多态性，rs4146894, rsl0490924, rsl045216, rsl882907, rs760336, rs763720, rs800292,rsl483883和rsl853886的等位基因变异的存在的试剂。另一个非-限制性实施方案中，提供一个包括一种或一种以上试剂序列的阵列，其鉴定来源于主体的核酸样本中与发生年龄-相关黄斑变性危险性相关的染色体10q26上的等位基因变异的存在。非限制性的，等位基因变异可以发生在染色体10q26上的PLEKHA1/L0C387715/PRSS11,并且，例如，可以对应于一种或一种以上定义为rs4146894，rsl045216, rsl0490924, rsl882907, rs760336, rs763720, rs800292, rsl483883 和rsl853886的单核甘酸多态性。
`图1 :相对于候选基因的CIDR位置和局部基因型SNPs。染色体10上的位点，距离和核酸位点来源于NCBI Entrez-gene和SNP数据库。图2 :染色体10的单-点和多点连锁结果。左图表示使用所有SNPs时的结果。右图表示仅使用H-clust SNPs分析的结果。标记”F”的峰表示可能为由于高SNP-SNP LD导致的假峰，而标记” G”和” P”的峰，分别对应于包括GRK5和PLEKHA1的位点。水平线表示多点Sall (Sall-1最大值)的1-单位支撑间隔。图3A-3D :基于196CIDR SNPs和179非相关对照的染色体10的连锁不平衡模式。图3A 135cM的假峰(见图2)，图3B 142cM的假峰(见图2)，图3C :连锁峰。图3D-1和3D-2是图3C的放大版本，源于线A-A’。假峰中带有最大Sall的SNP (图3A和3B)以灰色显示而真实连锁峰中来源于CCREL(表5)的5个基因(GRK5/RGS10/PLEKHA1/L0C387715/PRSSlI)上的重要SNPs以灰色显示。灰色阴影表示SNP对之间的重要LD (无号的深灰方块表示成对D’= 1)，白色方块表示无重要LD的迹象，而无号的灰色方块表示不带有统计重要性的值为I的成对D，运用D’测定LD并且方块中的数字以D’ *100给出成对LD。
图4 :染色体I的多点连锁结果。左图表示使用所有SNPs时的结果，而右图表示仅使用H-clust SNPs分析的结果。标记”F”的峰表示可能为由于高SNP-SNP LD导致的假峰，而标记”C”的峰对应于CFH基因。水平线表示多点Sall (CFH-1最大值Sall)的1-单位支撑间隔。图5A-5C提供基于679CIDR SNPs和179非相关对照的染色体I的连锁不平衡模式。图5A 188cM的假峰(见图4)，图5B 202cM的假峰(见图4)，图5C =CFH位点上的连锁峰。假峰中带有最大Sall的SNP以灰色显示而真实连锁峰中来源于CCREL(表5)的CFH上的重要SNPs以灰色显示。灰色阴影表示SNP对之间的重要LD(无号的深灰方块表示成对D’= 1)，白色方块表示无重要LD的迹象，而无号的灰色方块表示不带有统计重要性的值为I的成对D’。运用D’测定LD并且方块中的数字以D’ *100给出成对LD。图 6A 和 6B :图 6A GRK5(1 区域)，RGSlO (SNP6), PLEKHAI (2 区域)，L0C387715(3区域)，PRSSlI (4区域)的连锁不平衡模式。图6B:Cm(区域I)的连锁不平衡模式。灰色阴影表示SNP对之间的重要LD (无号的深灰方块表示成对D’ = I)，白色方块表示无重要LD的迹象，而无号的灰色方块表示不带有统计重要性的值为I的成对D’。运用D’测定LD并且方块中的数字以D’ *100给出成对LD。CCREL等位基因试验中的重要S NPs是灰色中最高的(见表6)。三个SNPs(rs642835·2，rsl2258692和rsll528141)由于非常低的杂合性不包括在内，而一个SNPs，rs2736911，由于其无信息也不包括在内。表明这些区域清楚的显示了基因的位置而非代表单体型区域。图1 显示 CFH，EL0VL4，PLKEHA1，和 L0C387715 基因的评估的粗略 ORs 和 95% CIs0一个或两个危险等位基因(RR+RN)将与非-危险等位基因(NN)主体纯合子比较。实线表示对应于OR(开环)的95% Cl。点垂直线表示OR为I的空值。垂直列给出了在AREDS和CHS队列中评估的对比值。图8 显示了 CFH 的评估 ORs 和 95% Cl S。A :显性效应(CT+CC vs. TT)评估 ORdonj0B :杂合子(CT vs. TT)危险性评估ORhrt。C :隐形效应(CC vs. CT+TT)评估0RM。。D :杂合子(CC vs. TT)危险性评估ORtal。点垂直线表示OR为I的空值。图9显示了 EL0VL4的评估ORs和95 % Cl S。A :显性效应(AG+GG vs. AA)评估ORd0mo B :杂合子(AG vs. AA)危险性评估0Rhrt。C :隐形效应(GG vs. AG+AA)评估ORra。D 杂合子(GG vs. AA)危险性评估0RhM。点垂直线表示OR为I的空值。图10 显示了 L0C387715 的评估 ORs 和 95% CIs0 A :显性效应(GT+IT vs. GG)评估0RdM。B:杂合子(GT vs. GG)危险性评估0Rhet。C :隐形效应(TT vs. GT+GG)评估0RM。。D :杂合子(TT vs. GG)危险性评估0Rh()m。点垂直线表示OR为I的空值。图11 显示了 PLEKHAI 的评估 ORs 和 95% CIs0 A :显性效应(AG+AA vs. GG)评估ORd0mo B :杂合子(AG vs. GG)危险性评估0Rhrt。C :隐形效应(AA vs. AG+GG)评估ORra。D 杂合子(AA vs. GG)危险性评估0RhM。点垂直线表示OR为I的空值。图12提供了来源于包括了 CFH中Y402H熔解-分析数据组的评估ORs和95%CIs，及从固定和随机效应模型中汇集的评估值。顶端的数据显示ORhrt(CT杂合子对比于TT的0R)而底部的数据显示ORhom(CC杂合子对比于TT的0R)。‘Hage-C’和iHage-F表不来源于 Hageman 等的 Columbia 和 Iowa cohortsD 评估值(Hageman, G. S 等(2005)Acommon haplotype in the complement regulatory gene factor H(HF1/CFH)predisposesindividuals to age-related macular degeneration. Proc Natl AcadSci USA. 2005 May17 ；102(20) :7227-32. Epub 2005 May 3)，分别地，‘Jakobs’ 表示来源于 Jakobsdottir等文章的评估值(Jakobsdottir, J等(2005) Susceptibility genes for age-relatedmaculopathy on chromosome 10q26. Am J Hum Genet. 77, 389-407)。” 固定”表不来源于所有试验的汇集的评估值都假设研究之间的可变性是归因于偶然的。”随机”表示来源于所有试验的汇集的评估值都考虑了研究中的异质性。”n_。”是评估值中包括的ARM情况的全部数量，而” n_”包括在评估值中的无ARM的对照的全部数量。点垂直线表示同质下汇集OR的点评估值(”固定”)。图13提供了 A :在包括CM中的Y402H的meta-分析的阵列中，非相关ARM情况中的基因型频率(％)。B :在包括CFH中的Y402H的meta-分析的研究中，无ARM的非相关对照的基因型频率(％ )。”Hage_C”和”Hage-1”表示来源于Hageman等的Columbia和Iowa阵列的评估值,分别地，” Jakobs”表示来源于Jakobsbottir等文章的评估值。图14提供了来源于包括了 L0C387715中S69A熔解-分析数据组的评估ORs和95% CIs，及从固定和随机效应模型中汇集的评估值。顶端的数据显示ORhrt (GT杂合子对比于GG的0R)而底部的数据显示ORtal(GG杂合子对比于TT的0R)。“Jakobs”表示来源于 Jakobsdottir 等文章的评估值(Jakobsdottir, J 等(2005) Susceptibility genes forage-related maculopathy on chromosome 10q26. Am J Hum Genet. 77, 389-407)。，，固定，，表示来源于所有试验的汇集的评估值都假设研究之间的可变性是归因于偶然的。”随机”表示来源于所有试验的汇集的评估值都考虑了研究中的异质性。”n_”是评估值中包括的ARM情况的全部数量，而”n_”包括在评估值中的无ARM的对照的全部数量。点垂直线表示同质下汇集OR的点评估值(”固 定”)。图15提供了 A :在包括L0C387715中的S69A的meta-分析的阵列中，非相关ARM情况中的基因型频率(％ )。B :在包括L0C387715中的S69A的meta-分析的研究中，无ARM的非相关对照的基因型频率(％ )。“Jakobs”表示来源于Jakobsbottir等文章的评估值。图16提供了 L0C387715的氨基酸(序列号19)和核酸序列(序列号20)。
具体实施例方式如下列所述，等位基因变异型，包括单核苷酸多态性，已经在染色体10q26上被鉴定。这里显示的等位基因变异型与年龄-相关黄斑变性的高危发生相关。实施例1鉴定了PLEKHAI和/或L0C387715是ARM相关的等位基因变异型位点。进一步的研究，如实施例2显示，证实并进一步支持L0C387715变异作为ARM标记的相关性。L0C387715变异作为ARM标记的相关性还未被排除，但最近的遗传学研究的证据更加强烈显示变异发生在L0C387715基因上。因此提供了对具有高危险性发生年龄-相关黄斑变性的病人个体进行确认的方法。本方法包括鉴定来源于主体核酸样本中P LEKHAl和/或L0C387715，在一个非限制性实施方案中，L0C387715中，等位基因变异或特定单倍型的发生(包括几种等位基因变异)。特定单核甘酸多态性(SNPs)在这些位点上已经被鉴定，包括，非限制性的，这些SNPs鉴定为 rs4146894, rsl045216, rsl0490924, rsl882907, rs760336，和 rs763720。方法进一步包括在补体因子H(CFH)中对等位基因变异型进行鉴定，例如，非限制性的等位基因变异型定义为 rsl853883。这里使用的，“等位基因变异型”指核酸上的，典型的为主体的，如病人的一个或一个以上等位基因原初氨基酸序列的变异。等位基因变异包括在蛋白表达中具有任何某项效应的单一或多重核苷酸和氨基酸的替换，增加或删除，包括但不局限于调节转录的启动子活性，移码，早期蛋白终止，蛋白错误-折叠，选择性蛋白加工，破坏(或增强)蛋白的活性位点或结合位点，mRNA的错误拼接或影响最终基因产物的表达和/或功能的核酸或蛋白的任何其他特征。一个氨基酸和核酸序列的变异可以是或非沉默的，即非表型效应，如疾病的威胁，可以与序列变异相关。另一方面，等位基因变异可以是公认的”野生型”核酸或氨基酸序列的变异，其通过这里描述的示范性和非限制性统计学方法，被认为与疾病危险，如ARM，是牵连的，相关的或相联系的。这样，L0C387715单核甘酸多态性rsl0490924 (Ser69Ala)是一种等位基因变异。大量的方法，包括高通量的方法，可用于测定SNPs和/或其他等位基因变异，非限制性地如下列实施例描述的PCR和限制性片断长度多态性方法。一个实施方案中，通过任何方法对样本中的DNA进行测序(重新测序)鉴定SNP或小等位基因变异。许多重新测序的方法在领域中是已知的，包括高-通量方法。扩增-基础的方法也可以用于鉴定等位基因变异，如SNPs，包括，非限制性的PCR，反转录PCR(RT-PCR)，等温扩增，基于核酸序列的扩增(NASBA)，5’荧光核酸酶方法(例如TAQMAN方法)，分子信标方法和滚环扩增。其他方法，如作为合适的和有效的鉴定不同等位基因的限制性片断长度多态性RFLP，也可以应用。方法可以是多重的，意味两种或多种反应可以在相同的物理位置同时进行，如在相同的管或阵列中相同位置-只要多重反应的反应产物可以区分。作为非限制性的实施例，可以通过使用和监控对应于两种不同序列-特意探针的不同荧光燃料的聚集或损耗，复合TAQMAN或分子信标方法。许多情况下，通过个人选择和经验，现有的设备和试剂，高通量和/或复合方法的需要，费用，方法的精确性，和技术员操作方法的技术水平来指定合适的方法。这些技术的设计和实施是广 泛-知晓的并在本领域中技术人员平均能力之内。在这里提供的方法的实施中，可以使用一个阵列。在进行高-通量方法时阵列是特别有用的。阵列典型地包括一种或一种以上试剂，例如非限制性的，核酸引物和/或探针，以鉴定人类主体核酸样本中对应于L0C387715和/或PLEKHA1上的一个或一个以上单核甘酸多态性的等位基因变异的发生，例如，非限制性的，以下鉴定的SNPs rs4146894,rsl045216,rsl0490924,rsl882907,rs760336,rs763720,rs800292,rsl483883,rsl853883和rsl853886。阵列可以同时测试和鉴定L0C387715和/或PLEKHA1上的一个或一个以上等位基因变异，例如，非限制性的，以下鉴定的SNPs rs4146894, rsl045216, rsl0490924,rsl882907, rs760336, rs763720, rs800292, rsl483883, rsl853883 和 rsl853886,以及同时测定CFH，其他基因/位点和对照基因/位点/核酸上的等位基因变异。这里使用的术语”阵列”指有助于鉴定基因上定位于两个或更多已鉴定的位置的等位基因变异的试剂。一个实施方案中，阵列是一种装置，其具有两个或更多分离的，确认的反应腔室，例如，非限制性的为96-孔板，在其中进行包括确定组分的反应。一个示范性实施方案中，两种或更多核酸引物或探针以空间可寻址方式固定于基质上，从而每个独立的引物或探针固定于基质的不同的和(可寻址的)确定位置。基质包括，非限制性的，多-孔板，娃片和娃珠。一个实施方案中，阵列包括两套或多套珠，每套珠具有一个确定的标记，如一个量子点或荧光标签，从而可以使用，例如非限制性的，流式细胞仪对珠进行单独确认。一个实施方案中，在目前所描述的范围中，阵列可以是包括两个或多个反应腔室，其带有扩增DNA以鉴定SNPs的引物或结合特定序列的探针。从而，试剂，如探针和引物可以结合或沉积于阵列的特定位置。试剂可以为任何合适的形式，包括，非限制性的溶液，干燥，冻干或玻璃化。有用的阵列技术包括,例如并且非限制性的，Affymetrix Ge neChip^ Array,
例如，GeneChip^ CustomSeq垃 ResequencingArrays (可从 California, SantaClara,Affymetrix Inc.商业获得)和相似技术。从病人样本获得的数据中分析阵列数据和/或鉴定遗传危险性因子的信息和/或统计软件或其他计算机-执行程序在本领域中是已知的。这里使用的，”鉴定主体核酸样本中发生等位基因变异的试剂”，其中该等位基因特被异地鉴定或在基因或位点中被鉴定，指通过任何合适的方法，例如非限制性的，通过PCR,再测序5’外切核酸酶(TaqMan)方法和/或阵列或高-通量方法，鉴定特定等位基因变异的试剂。这些试剂的非-限制性实施例包括在任何有用的方法系统中使用的序列-特异引物，引物对和探针。引物和探针可以为任何有用的形式，但是典型地为核酸，但可以为核酸类似物，如，非限制的为硫代磷酸化物。 实施例1中，使用高密度SNP板在lq31和10q26的两个交联区域进行基于家族的交联研究和疾病-对照相关的研究。染色体lq31的SNP交联和相关的结果证实交联峰和ARM最强关联位于CFH基因上。分析染色体10q26的家族和疾病-对照数据以鉴定下一个主要ARM易感-相关基因。实施例2描述的以下研究中，对心血管研究(CHS)恢复的主体，一种不将年龄-相关黄斑变性(ARM)情况作为研究因素的群体-基础的队列，和年龄-相关眼疾病研究(AREDS)，一种将ARM情况作为研究因素的群体-基础的队列进行嵌套式疾病_对照设计。这些队列以不同研究策略被用于研究两个队列中ARM易感性中的CFH，PLEKHA1，L0C387715和EL0VL4基因。此外，这两个队列在0C387715的meta-分析中分别包括了额外增加I和4个疾病-对照研究。两个队列中Cm与ARM情况显著相关(p < 0. 00001)并且meta-分析证实了杂合和纯合情况下(0R，2. 4和6. 2 ；95% Cl (置信区间)，分别为2. 2-2. 7和5. 4-7. 2)危险等位基因提供了该易感性。两个队列中L0C387715与ARM情况显著相关(p < 0. 00001)并且meta-分析证实了杂合和纯合情况下(0R，2. 5和7. 3 ;95 % Cl，分别为2. 2-2. 9和
5.7-9. 4)危险等位基因提供了该易感性。PLEKHA1，其与L0C387715紧密相关，在AREDS队列而非CHS队列中与ARM情况明显相关，而EL0VL4在两个队列中都与ARM显著不相关。通过对具有ARM情况不同研究策略的阵列进行评估以及meta-分析的进一步支持，该研究提供了 CFH和L0C387715基因在ARM易感性中的进一步支持。实施例1材料和方法家族和疾病-对照阵列共612个AMD家族和184的非相关对照送至遗传疾病研究中心(CIDR)鉴定基因型。由于人种基础的可能性，我们的数据仅限制于对高加索组进行分析。高加索组具有594个AMD家族，包括1443个基因型个体，和179个非相关对照。高加索家族包括430个基因型相关的血缘对，38个基因型相关的伯父对，和52个基因型相关的第一代堂兄妹对。共323个高加索家族，117峰非相关对照，和196个非相关疾病也对额外SNPs进行部分基因型鉴定。部分组包括824个基因型个体，298个基因型相关的血缘伯父对，23个基因型相关的伯父对和38个基因型相关的第一代堂兄妹对。Merlin package中的PdeStats (Abecasis等,2000)可方便地用于概要计算家族数据。疾病情况模型三个经典的模型(A，B和C)用于定义ARM情况的严重性(Weeks等，2004)。最简化的情况下，仅限于关注最严重的和最保守诊断的”类型A”疾病。仅使用在所有三种诊断模型中都未受影响的非相关对照。未受影响是那些眼睛护理纪录和/或眼底照相显示无任何黄斑变化(包括玻璃膜疣)或少量(少于10)硬玻璃膜疣(50微米直径或更小)而无任何其他RPE变化的个体。当具有可用信息时，带有大量黄斑外玻璃膜疣的个体不属于未受影响。为解释特异ARM亚-型，只有那些疾病末阶段的，任一眼中被证明具有脉络膜新生血管膜(CNV)的，或任一眼中具有地区萎缩(GA)的情况被选择关注。具报道大量个体皆具有地区萎缩和CNV，然而由于这些情况中难以获知地区萎缩是继发于CNV的损害或来自于限制CNV生长的治疗(例如，激光，手术，或光力学治疗)，其将是问题化的。由于难以在照片或纪录中辨别病人眼GA是否先于CNV的发生，CNV组中包括了皆具两种疾病的病人。然而，在地区萎缩组中仅包括该交叠组中的亚组，特别是具报道一个眼睛中具有地区萎缩而无CNV证据的情况。表I显示三种情况组中个体的数量。这些研究可能排除了地区萎缩组中的小部分个体，其在相同眼中在CNV发生之前就具有不对称地区萎缩或在两眼中都发生CNV时已经具有对称地区萎缩。表I高度ARM病人的亚型分布。括号中的数字指皆具CNV和GA并且包括在GA组 中(见选择标准)用于几率和归因危险性评估和相关试验的个体。
I_____
CIDR家族情况局部家族情况局部非相关情况
GA无 GA GA无 GA GA无 GA
CNV 220( 76 ) 187130(45 ) 10671 ( 17) 59
无 CNV 1086257284026系谱和分型错误和数据处理PedCheck程序(O’Connell和Weeks 1998 PedCheck :在交联分析中分析基因型不相容的程序。Am J Hum Genet 63 :259-266)用于验证Mendelian矛盾。在小家族中确定哪个基因型是错误的是非常困难的(Mukhopadhyay 等，2004 Comparative studyof multipointmethods for genotype error decetion. Hum-Hered 58 :175-189),在含有 Mendelian 矛盾的家族中的每个缺失问题标记中设定所有基因型。Mega2 (Mukhopadhyay等，http://watson. hRen. pitt. edu/reRister)用于建立文件进行交联分析以及通过基因-计数评估等位基因频率。等位基因频率和Hardy Weinberg平衡从非相关和非影响对照中，通过直接计数，评估交联分析中的等位基因频率。所有对照在所有三个疾病情况模型中都是未受影响的。未有小孩的基因型配偶，或其小孩非本研究的一部分，合并入本研究的对照。精确的Hardy Weinberg平衡，按Mega2执行(Mukhopadlyay等 2005 Mega2 :data_handling for facilitati ng genetic linkage andassociation analyses. Bioinformatics)，用于我们的 SNPs。Mendel version 5(Lange 等，2001 MENDEL Version 4. 0 A complete packagefor the exact genetic analysis of discrete traits in pedigree and populationdata sets. Am J of Hum Genet 69 (Supplement) A 1886)也直接用于评估家族数据的等位基因频率，Mendel在评估等位基因频率时完全地说明主体的相关性。因为基因型家族成员大多数是患病的，这些评估值与使用非相关疾病获得的评估值相当接近。遗传图谱Rutgers 联合交联-物理图谱(2. 0 版本)(Kong 等，2004A combinedlinkage-physical map of the human genome. AmJ Hum Genet 75 :1143-1148)被用于予页测在Rutger图谱中还未出现的SNPs遗传位点。因为我们的SNPs在期望区域的分布非常密集，故几个SNPs之间的评估重组为零；这些情况下重组设定为0. 000001。获得来源于NCBIdbSNP数据库(人类构造35)的我们的所有SNPs物理位点。交联不平衡结构进行交联分析时忽视SNPs之间的高交联不平衡(LD)可以导致假阳性结果(Schaid 等，2002Caution on pedigree haploty pe inference with sftware thatassumes linkage equil ibrium. Am J Hum Genet 71 :992-995 ;Huang等 2004 Ignoringlinkage disequilibrium among tightly linked markers induces false-positiveevidence of linkage for affected sib pair analysis. Am JHum Genet 75:1106-1112)。考虑高SNP-SNP LD的努力包括1.运用H-cluster方法研究非相关对照中的LD结构(Rinaldo等,2005Characterization of multilocus linkage disequilibrium. Genetic Epidemiology28 193-206),其以 R 进行操作(RDevelopment Core Team 2004R A language andenvironment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing,Vienna, Austria.1SBN 3-900051-07-0, R statistical software website, http://www.r-ro ject. or只/)。目的是测定交联分析中的单模标本-标记的SNPs (htSNPs)。方法使用分层聚类来汇集高相关SNPs。聚类后，H-clust方法在每个聚类中选择htSNP ；htSNP是聚类中与其他所有SNPs最具相关性的SNP。对SNPs进行选择从而使得每个SNP至少与一个htSNP的相关系数(r 2)大于0. 5 ；2.程序 Haplo View (Barrett 等 2005 Haploview analysisand visualizationof LD and haplotype maps. Bioinformatics 21: 263-265.)被用于获得染色体 I 和 10上的SNP-SNP LD图形显示；以及3.使用两个和三个-SNP移动窗进行单倍型-基础的相关性分析(见如下)。交联分析
1.单一点分析。如我们先前的研究(Weeks等，2004)，LOD分值在单一(疾病等位基因频率=0.0001并且外显率矢量=
)。由于ARM显性杂性和晚发性，仅使用两种疾病显性”模型A中收影响的”和”未知”。在异质性下计算参变量LOD数值(HLOD)，而运用线性Sall统计学计算模型-自由LOD数值。两种数值都用Allegro计算(Gudb jartsson 等，2000A Ilegro, a new computer program for multipoint linkageanalysis. NatGenet 25 :12-13.)。2.忽略交联不平衡的多点分析。既然内部-标记距离通常是非常小的，SNPs之间的LD可以非常高并且违背许多交联分析程序获得的无LD的假设。运用Allegro进行忽略LD的多点分析(Gudbjartsson等,2000)。HLODs和Sall统计都被计算。3.运用htSNPs的多点分析。当仅使用htSNPs计算LOD数值时，染色体I和染色体10上的SNPs数量减少至533和159个。如上进行多点LOD分析(Weeks等，2004)。忽略的SNPs很好地符合Haplo View评估的SNP-SNP LD结构(Barrett等，2005)。相关性分析为了使家族中的所有病例都能被使用，新的CCREL程序(Biwnig等，2005Case-Control single-marker and haplotypicassociation analysis of pedigreedate. Genet epidomiol 28 :110-122)被运用，其通过同时使用相关病例和非相关对照以测试相关性。CCREL被用于在染色体I和10的交联峰分析SNPs以测定相关性。CCREL试验通过计算病例和对照的有效数量而关注于生物-相关的主体。对于这些分析，非相关对照被给予”正常”表型，而 未受”类型A” ARM影响的家族成员被给予”未知”表型(CCREL方法还未能够同时使用相关病例和相关对照)。用于相关性试验的每个SNP的对照的有效数量是对该SNP进行基因型定义的对照的数量。一个等位基因试验，一个使用两个SNP滑动窗口的单模标本试验，使用三个SNP滑动窗口的单模标本试验和一个基因型试验被执行。根据作者所提供的使用CCREL R包进行分析(Browning等，2005)。GIST 分析为了研究对于交联信号最关键的等位基因/SNP，使用来源于CCREL试验的局部基因型SNPs和重要SNPs，在染色体I和10交联峰之间进行基因型-1BD共享试验(GIST)。GIST试验测定一个等位基因或LD等位基因是否部分为观察到的交联信号(Li等，2004)。计算三种不同疾病模型(隐性，显性，附加)下每个受影响亲缘关系的重量-在无疾病-标记相关性的零假设下这些重量是非偏差的。试验统计的基础是家族重量变数和非参数联结(NPL)值间的相关性。因为GIST试验目前仅应用于受影响的亲缘对家族成员，故在计算NPL值之前将家族成员划分入其成员核心家系。因为以下的疾病模型是未知的，我们在三种不同疾病模型下(隐性，显性，附加)进行测定，对三种模型运用适合于多重试验的P-值，并取混合值。三重分析以三步连续步骤进行分析。首先，分析已经以CIDR进行基因分型的一套数据。第
二，在染色体10PLEKHA1/L0C387715/PRSS11区域对8个附加SNPs进行局部基因分型，分析局部-基因型数据组。注意应使所有PRSSll区域上的PLEKHA1中所有已知非-同义SNPs都被研究。这两组数据在大小和成分上都不同，易于分离地对其进行分析(表2)。按上述对这些(重叠)数据组进行等位基因频率评估，CCREL相关性试验，和GIST试验。第三，我们测试染色体I和染色体10区域的交互作用，并测定危险性的不同是否为地图状萎缩或脉络膜新生血管膜的因素。表2每部分统计分析和样 本大小概要
权利要求
1.一种体外检测包括与年龄-相关黄斑病变易感性有关的多态性的核酸样品的方法，该方法包括在样品中检测SEQ ID N0:20(rsl0490924)的第270碱基处是否存在胸腺嘧啶或者鸟嘌呤，其中，在一个或者两个等位基因上存在胸腺嘧啶说明该核酸样品包括一种多态性，这种多态性显示增加的年龄-相关黄斑病斑易感性，并且，在两个等位基因处存在鸟嘌呤说明该核酸样品包括一种多态性，这种多态性显示减少的年龄-相关黄斑病斑易感性。
2.—种体外检测包括与年龄-相关黄斑病变易感性有关的多态性的核酸样品的方法，该方法包括检验PLEKHA1、PRSS11、L0C387715中一个或者一个以上的等位基因变体从而检测主体基因组SEQ ID NO 20(rsl0490924)的第270碱基处的多态性，其中，在SEQ ID NO:20 (rsl0490924)的第270碱基处存在胸腺嘧啶显示增加的年龄-相关黄斑病斑易感性，并且在SEQ ID NO 20(rsl0490924)的第270碱基处存在鸟嘌呤显示减少的年龄-相关黄斑病斑易感性。
3.根据权利要求1或者2所述的方法，其中所述年龄-相关黄斑病斑是严重的年龄-相关黄斑病斑。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测步骤包括在样品的染色体10q26的PLEKHAI/LOC387715/PRSS11位点上检测等位基因变体。
5.根据权利要求1或者2所述的方法，包括检测LOC387715的rsl0490924上的胸腺嘧啶或者鸟嘌呤。
6.根据权利要求1或2所述的方法，包括检测单核苷酸多态性rs4146894上的碱基。
7.根据权利要求1或2所述的方法，包括检测单核苷酸多态性rsl045216上的碱基。
8.根据权利要求1或2所述的方法，包括检测单核苷酸多态性rsl882907上的碱基。
9.根据权利要求1或2所述的方法，包括检测单核苷酸多态性rs760336上的碱基。
10.根据权利要求1或2所述的方法，包括检测单核苷酸多态性rs763720上的碱基。
11.权利要求1或2所述的方法进一步包括检测样品中补体因子H相对于单核苷酸多态性rs800292的多态性。
12.权利要求1或2所述的方法进一步包括检测样品中补体因子H相对于单核苷酸多态性rs 1853883的多态性。
13.权利要求1或2所述的方法进一步包括检测样品中补体因子H相对于单核苷酸多态性rsl061170的多态性。
14.权利要求1或2所述的方法包括检测LOC387715中的等位基因变体。
15.根据权利要求2所述的方法，其中，等位基因变体是产生一种非-功能基因产物并改变基因产物表达的突变体。
16.根据权利要求2所述的方法，其中，等位基因变体是一个或一个以上移码突变，启动子突变和剪切突变。
17.权利要求1或2所述的方法进一步包括识别所述样品中显示增加或者减少的年龄-相关黄斑病斑易感性的补体因子H多态性。
18.根据权利要求17所述的方法，其中识别的多态性对应于单核苷酸多态性rs800292、rsl061170 和 rsl853883 中的一个。
19.根据权利要求1或者2所述的方法，包括使用核酸扩增方法定义检测多态性。
20.根据权利要求19所述的方法，核酸扩增方法包括PCR，反转录PCR(RT-PCR)，等温扩增，基于核酸序列扩增(NASBA)，5’荧光核酸方法，核酸信标方法和滚环扩增中的一种。
21.根据权利要求1或者2所述的方法，包括使用阵列检测多态性。
22.根据权利要求21的方法,其中阵列包括一种或一种以上的试剂,用于在核酸样本中鉴定相应于一种或一种以上单核甘酸多态性rs4146894，rsl045216, rs4405249,rsl882907, rsl0490923, rs760336、rs763720，和 rsl803403 的等位基因变体的存在。
23.根据权利要求3所述的方法，其中，在一个或者两个等位基因上存在胸腺嘧啶显示了增加的末阶段年龄相关黄斑病变的易感性，并且在两个等位基因上存在鸟嘌呤显示了减少的末阶段年龄相关黄斑病变的易感性。
24.根据权利要求23所述的方法，其中，在一个或者两个等位基因上存在胸腺嘧啶显示了增加的地图状萎缩或脉络膜新生血管膜的一个或者两个的易感性，并且在两个等位基因上存在鸟嘌呤显示了减少的地图状萎缩或脉络膜新生血管膜的一个或者两个的易感性。
25.—种体外检测包括与年龄-相关黄斑病变易感性有关的蛋白样品的方法，包括从LOC387715的基因产物中识别等位基因变异同型体，其中所述同型体在其69位点上包括丝氨酸表示增加的年龄-相关黄斑病变的易感性，在其69位点上包括丙氨酸表示减少的年龄-相关黄斑病变的易感性。
全文摘要
基因PLEKHAL和LOC387715中的等位基因变异在这里作为年龄相关黄斑变性(ARM)危险因子被识别。因而提供了一种方法用于识别个体中发生ARM的危险性，包括识别PLEKHAL和/或LOC387715中含有等位基因变异体。相关的设备，如阵列，经鉴定可用于实施这些方法。
文档编号C12Q1/68GK103060449SQ201210585809
公开日2013年4月24日 申请日期2006年6月7日 优先权日2005年6月8日
发明者迈克尔·B·高瑞, 丹尼尔·E·威克斯, 耶维特·P·孔利, 罗伯特·费瑞尔, 约翰纳·加科伯斯多缇尔, 特玛麦·S·马何-费瑞瑟 申请人:匹兹堡大学