用于香草醛或香草醛β-D-葡萄糖苷的生物合成的组合物和方法

用于香草醛或香草醛β-D-葡萄糖苷的生物合成的组合物和方法
【专利摘要】本发明公开了已被工程化改造以单独地或与一种或多种香草醛生物合成酶类或UDP-糖基转移酶（UGT）组合地表达突变体AROM多肽和/或突变体儿茶酚-O-甲基转移酶多肽的重组微生物、植物和植物细胞。这样的微生物、植物或植物细胞可以生产香草醛或香草醛β-D-葡萄糖苷。
【专利说明】用于香草醛或香草醛β-D-葡萄糖苷的生物合成的组合物和方法
[0001]发明简介
[0002]本申请要求分别提交于2011年8月8日和2011年8月10日的美国临时申请号61/521，090和61/522，096的优先权利益，所述临时申请的内容整体通过参考并入本文。
【背景技术】
[0003]香草醛是世界上最重要的香料化合物之一，全球市场为1.8亿美元。天然的香草醛源自于香草兰(扁叶香果兰(Vanilla planifolia))的熟化种荚，但是世界上大多数的香草醛从石化产品或木浆木质素合成。从香草豆荚生产天然香草醛是费力且缓慢的过程，其需要对花进行手工授粉和将收获到的绿色香草豆荚熟化1-6个月(Ramachandra&Ravishankar (2000)J.Sc1.Food Agric.80:289-304)。生产 I 千克(kg)香草醛需要大约500kg香草豆荚，对应于授粉大约40，000朵花。目前，每年销售的香草醛中仅有约0.25% (16，000吨中的40吨)源自于香草豆荚，而其余的大多数从木质素或化石烃类、尤其是愈创木酚化学合成。合成生产的香草醛售价约为每千克$15，与此相比天然香草醛的价格为每千克 $1200-4000 (Walton 等，(2003) Phytochemistry63:505-515)。
[0004]发明概述
[0005]本发明提供了用于生产香草醛和/或香草醛β-D-葡萄糖苷的方法。本发明的方法包括下列步骤:(a)提供能够生产香草醛的重组宿主，其中所述重组宿主带有编码突变体Arom多功能酶(AROM)多肽和/或突变体儿茶酚_0_甲基转移酶(COMT)多肽的异源核酸；(b)将所述重组宿主培养足以使所述重组宿主产生香草醛和/或香草醛葡萄糖苷的时间；以及(c)从所述重组宿主或从所述培养上清液分离香草醛和/或香草醛葡萄糖苷，由此生产香草醛和/或香草醛β -D-葡萄糖苷。
[0006]在一种实施方式中，提供了突变体AROM多肽，其中所述突变体相对于缺少所述突变的相应AROM多肽具有降低的莽草酸脱氢酶活性。根据这种实施方式，所述突变体AROM多肽可以在结构域5中具有一个或多个突变、缺失结构域5的至少一部分或缺少结构域5。
[0007]在另一种实施方式中，所述突变体AROM多肽是融合多肽，其包括(i )本文描述的AROM多肽，例如，包含缺失结构域5的至少一部分的AROM多肽、或缺少结构域5的AROM多肽；以及(ii)具有3-脱氢莽草酸脱水酶(3DSD)活性的多肽。
[0008]在其他实施方式中，提供了突变体COMT多肽，其中所述突变体具有一种或多种改进的性质。具体来说，本发明提供了倾向于在原儿茶酸和/或原儿茶醛和/或原儿茶醇的间位而不是对位处催化甲基化的突变体COMT多肽。
[0009]本文描述的任何多肽还可以在所述多肽的N-端或C-端包括纯化标签、叶绿体转运肽、线粒体转运肽、造粉体肽、信号肽或分泌标签。
[0010] 在某些实施方式中，所述宿主可以是微生物，例如酵母如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)或大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)。或者,所述宿主可以是植物或植物细胞(例如小立碗藓属(Physcomitrella)植物或植物细胞、或烟草植物或植物细胞)。
[0011]本文描述的任何宿主还可以包含编码芳香族羧酸还原酶(ACAR)、3-脱氢莽草酸脱水酶(3DSD)、尿苷5’ - 二磷酸葡萄糖基转移酶(UGT)、磷酸泛酰巯基乙胺转移酶(PPTase )、野生型AROM和/或野生型O-甲基转移酶(OMT)的基因。
[0012]还提供了编码突变体COMT多肽或突变体AROM多肽的分离的核酸。
[0013]附图简述
[0014]图1是香草醛(4)的从头生物合成的示意图，以及在表达3DSD、ACAR、OMT和UGT以及磷酸泛酰巯基乙胺转移酶(PPTase)的生物体中发现的不同的香草醛降解产物和代谢副产物，即脱氢莽草酸(I)、原」L茶酸(2 )、原儿茶醛(3 )、香草酸(5 )、原儿茶醇(6 )，香草醇
(7)和香草醛β-D-葡萄糖苷(8)的概述。空心箭头示出了酵母中的主要代谢反应；黑色箭头示出了通过代谢工程引入的酶反应；对角条纹箭头示出了酵母固有的不想要的代谢反应。
[0015]图2是使用野生型AROM多肽(左侧)和缺少结构域5的突变体AROM多肽(右侧)细胞生物合成芳香族氨基酸酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸的示意图。
[0016]图3Α示出了在表达各种突变体COMT多肽的酵母菌株中香草醛(VG)和异香草醛(IsoVg)的生产。
[0017]图3Β和图3C示出 了与人类OMT (Hs-OMT)和人类L198Y OMT突变体(HS-0MTL198Y)相比，从各种来源分离的COMT多肽的香草醛(VG)和异香草醛(IsoVg)生产。致病疫霉(Phytophthera infestans) (PI),长春花(Catharanthus roseus) (CR),解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica) (YL),玻璃海鞘(Ciona intestinalis) GENBANK 登记号XP_002121420 和 XP_002131313 (C1-1 和 C1-2)，Capsasproa owczarzaki (CO)，嗜热毛壳菌(Chaetomium therophilum) (CT),卢西坦棒抱酵母(Clavispora Iusitaniae (CL),副球抱子菌属物种(Paracoccidioides sp) ‘lutzii’ PbOl (PL),扁叶香果兰(Vanillaplanifolia) (VP),阿拉比卡咖啡树(Coffea Arabica) (CA),大鼠(Rattus norvegicus)(RN),小鼠(Mus musculus) (MM),泉古菌(Crenarchaeote) (CREN), Mycobacteriumvanbaleeni (MV),或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe) (SP)0
[0018]图4不出了在增补有3mM香草醇的表达简青霉(Penicillium simplicissium)(PS)或Rhodococcus jostii (RJ)香草醇氧化酶(VAO)的酵母菌株中香草醒葡萄糖苷、香草醛、香草醇葡萄糖苷和香草醇的水平。
[0019]图5示出了在增补有3mM香草酸的培养基中生长的表达N.1owensis ACAR或粗糙脉孢霉(N.crassa) ACAR和大肠杆菌磷酸泛酰巯基乙胺转移酶(PPTase)或粟酒裂殖酵母(S.pombe) PPTase的酵母菌株中香草酸、香草醒和香草醒葡萄糖苷的水平。
[0020]发明详述
[0021]本发明是基于下述发现，即突变体AROM多肽可用于在重组宿主中提高3-脱氢莽草酸(3-DHS)积累。3-DHS是香草醛生物合成的前体，并且如果更多的细胞内3-DHS可用，则在香草醛生物合成途径的第一个关键步骤中可以制造更多的原儿茶酸。参见图1。在酵母中，AROM是由AROl基因编码的五功能酶复合物。所述基因长为4764bp，并编码长度为1588个氨基酸的相应多肽。AROM执行5个连续的酶促转化，即将DAHP (3-脱氧-D-阿拉伯糖基-庚酮糖酸-7-磷酸)转变成3-DHQ (3-脱氢奎尼酸)，其被转变成3-DHS (3-脱氢莽草酸)，其被转变成莽草酸，其被转变成莽草酸-3-P (莽草酸3-磷酸)，其被转变成EPSP(5-烯醇丙酮莽草酸3-磷酸)，它们全都在芳香族氨基酸酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸的细胞生物合成途径中(参见图2)。
[0022] AROM的5种催化功能在于AROl编码的多肽的5个不同结构域。AROM多肽的功能结构域的次序，与在DAHP至EPSP的5步转化中需要它们所具有的次序不同(参见图2)。因此，结构域I对应于催化活性1，结构域2对应于催化活性5，结构域3对应于催化活性4，结构域4对应于催化活性2，并且最后的结构域5对应于催化活性3 (参见图1)。
[0023]含有AROM多肽的结构域5变体(例如在结构域5中具有一个或多个突变的AROM多肽或一部分结构域5被缺失的AROM多肽)的重组宿主，与表达野生型AROM多肽的相应宿主相比可以具有提高的3-DHS水平。这样的宿主也可以具有增加的原儿茶酸生产。
[0024]可选替地或此外，突变体COMT多肽可用于提高香草醛β -D-葡萄糖苷的生物合成。例如，本文描述的突变体COMT多肽可以具有下列性质中的一个或多个:提高的周转；倾向于在间位(3’)而不是对位(4’)处甲基化，以便相对于异香草醛更有利于香草醛的生产；或对香草醛途径底物原儿茶酸和原儿茶醛的更好的特异性。
[0025]因此，本发明提供了突变体AROM和突变体COMT多肽和编码这样的多肽的核酸及其在香草醛和/或香草醛葡萄糖苷的生物合成中的使用。所述方法包括下述步骤:提供能够在碳源存在下生产香草醛的重组宿主，其中所述重组宿主带有编码突变体COMT多肽和/或突变体AROM多肽的异源核酸；将所述重组宿主在碳源存在下进行培养；以及从所述重组宿主或从所述培养上清液纯化香草醛和/或香草醛葡萄糖苷。
[0026]本文描述的重组宿主可用于生产香草醛或香草醛葡萄糖苷的方法。例如，如果重组宿主是微生物，方法可以包括将重组微生物在培养基中，在表达香草醛和/或香草醛葡萄糖苷生物合成基因的条件下生长。重组微生物可以在分批、补料分批或连续过程或其组合中生长。通常，重组微生物在处于确定温度下的发酵罐中，在适合的营养源例如碳源存在下生长所需时间长度，以生产所需量的香草醛和/或香草醛葡萄糖苷。
[0027]在本方法中使用的碳源包括可以被重组宿主细胞代谢以促进生长和/或香草醛和/或香草醛葡萄糖苷生产的任何分子。适合的碳源的实例包括但不限于蔗糖(例如在糖蜜中存在的)、果糖、木糖、乙醇、甘油、葡萄糖、纤维素、淀粉、纤维二糖或其他含葡萄糖聚合物。例如，在使用酵母作为宿主的实施方式中，诸如蔗糖、果糖、木糖、乙醇、甘油和葡萄糖的碳源是适合的。碳源可以在整个培养时间段中提供给宿主生物体，或者生物体可以在另一种能量源例如蛋白质存在下生长一段时间，然后仅在分批补料阶段中提供碳源。
[0028]在一种实施方式中，这种方法的微生物带有编码突变体AROM多肽和任选地野生型COMT多肽的核酸。在另一种实施方式中，这种方法的微生物带有编码突变体COMT多肽和任选地野生型AROM多肽的核酸。在又一种实施方式中，这种方法的微生物带有编码突变体AROM多肽和任选地突变体COMT多肽的核酸。取决于方法中使用的具体微生物，也可以存在并表达编码3DSD、ACAR、UGT或PPTase的其他重组基因。因此，在一种实施方式中，重组宿主可以是带有编码3DSD、ACAR、UGT或PPTase的一种或多种异源核酸或上述任一者的与其具有至少80%、例如至少90%、例如至少95%序列同一性的功能同源物的微生物。产物、底物和中间体例如脱氢莽草酸、原儿茶酸、原儿茶醛、香草醛和香草醛β -D-葡萄糖苷的水平，可以通过从培养基提取样品并按照已发表的方法进行分析来确定。[0029]在将重组微生物在培养基中生长所需时间长度后，可以使用本领域已知的各种技术从培养基回收香草醛和/或香草醛β -D-葡萄糖苷，例如通过萃取、真空蒸馏和从水性溶液多步重结晶以及超滤进行分离和纯化(Boddeker等，(1997) J.MembraneSc1.137:155-158 ；Borges da Silva 等，(2009) Chem.Eng.Des.87:1276-1292)。 使用巯基化合物例如二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇、谷胱甘肽或L-半胱氨酸(美国专利号5，128，253)或碱性KOH溶液(W094/13614)的两相萃取方法，已被用于香草醛的回收及其与其他芳香物质的分离。使用聚醚-聚酰胺共聚物膜从生物转化的培养基吸附和渗透蒸发香草醛，也已被描述(Bdddeker 等，(1997)同上；Zucchi 等，(1998) J.Microbiol.Biotechnol.8:719-722)。具有交联聚苯乙烯骨架的大孔吸附树脂，也已被用于从水性溶液回收溶解的香草醒(Zhang等，(2008)Eur.Food Res.Technol.226:377-383)。也已评估了超滤和膜接触器(MC)技术用于回收香草醛(Zabkova等，(2007) J.Membr.Sc1.301:221-237 ；Scuibba等，(2009)Desalination241:357-364)。或者，可以使用常规技术例如渗滤或超临界二氧化碳萃取和反渗透进行浓缩。如果重组宿主是植物或植物细胞，可以使用本领域已知的各种技术从植物组织提取香草醛或香草醛葡萄糖苷。
[0030]在某些实施方式中，香草醛或香草醛β -D-葡萄糖苷可以使用用含前体分子的原材料喂养的完整细胞来生产。原材料可以在细胞生长期间或细胞生长之后进料。完整细胞可以是悬浮的或固定化的。完整细胞可以在发酵液中或在反应缓冲液中。在某些实施方式中，可能需要渗透剂将底物有效转移到细胞中。
[0031]在某些实施方式中， 香草醛或香草醛β-D-葡萄糖苷被分离和纯化至均质(例如纯度至少90%、92%、94%、96%或98%)。在其他实施方式中，香草醛或香草醛β-D-葡萄糖苷被分离为重组宿主的提取物。在这种情况下，香草醛或香草醛β-D-葡萄糖苷可以被分离但不必纯化至均质。理想情况下，生产的香草醛或香草醛β-D-葡萄糖苷的量可以为约Img/I至约20，000mg/L或更高。例如，可以生产约I至约100mg/L、约30至约100mg/L、约50至约 200mg/L、约 100 至约 500mg/L、约 100 至约 I, 000mg/L、约 250 至约 5，000mg/L、约 I, 000至约15，000mg/L或约2，000至约10，000mg/L的香草醛或香草醛β -D-葡萄糖苷。一般来说，更长的培养时间产生更大量的产物。因此，可以将重组微生物培养I天至7天、I天至5天、3天至5天、约3天、约4天或约5天。
[0032]应该认识到，本文中讨论的各个基因和模块可以存在于两种或更多种重组微生物而不是单种微生物中。当使用多种重组微生物时，它们可以在混合培养中生长以生产香草醛和/或香草醛葡萄糖苷。
[0033]分离和任选地纯化的香草醛或香草醛β-D-葡萄糖苷的提取物可用于香料消费品例如食品、饮食增补剂、营养品、药物组合物、牙齿卫生组合物和化妆品中。
[0034]当在本文中使用时，短语“食品”包括但不限于水果、蔬菜、果汁、肉制品例如火腿、培根和香肠，蛋制品、水果浓缩物、明胶和明胶状产品例如果酱、果冻、蜜饯等，乳制品例如冰激凌、酸奶油和果子露，糖霜、糖浆包括糖蜜，玉米、小麦、黑麦、大豆、燕麦、大米和大麦制品，坚果仁和坚果制品，蛋糕、曲奇、糖食例如糖果、橡皮糖、水果味糖?和巧克力，口香糖、薄荷糖、奶油、糖霜、冰激凌、派和面包，饮料例如咖啡、茶、碳酸软饮料例如可口可乐和百事可乐、非碳酸软饮料、果汁和其他水果饮料、运动饮料例如GAT0RADE、咖啡、茶、冰茶、可乐，含酒精饮料例如啤酒、葡萄酒和白酒以及K00L-AID。[0035]食品还包括调味品例如药草、香料和佐料、增味剂。食品还包括制备的包装产品，例如饮食甜味剂、液体甜味剂、在用水重构后提供非碳酸饮料的颗粒调味混合物、即溶布丁混合物、速溶咖啡和茶、咖啡伴侣、麦乳精混合物、宠物食品、牲畜饲料、烟草和用于烘烤应用的材料，例如用于制备面包、曲奇、蛋糕、薄煎饼、甜甜圈等的粉末烘烤混合物。食品还包括含有很少或不含蔗糖的饮食或低卡路里食物和饮料。本发明设想的食品的其他实例描述在下面以及整个本说明书中。
[0036]在另一种实施方式中，食品是水果、蔬菜、果汁、肉制品例如火腿、培根和香肠，蛋制品、水果浓缩物、明胶和明胶状产品例如果酱、果冻、蜜饯等，乳制品例如冰激凌、酸奶油和果子露，糖霜、糖浆包括糖蜜，玉米、小麦、黑麦、大豆、燕麦、大米和大麦制品，坚果仁和坚果制品，蛋糕、曲奇、糖食例如糖果、橡皮糖、水果味糖?和巧克力，奶油、糖霜、冰激凌、派和面包。
[0037]在另一种实施方式中，消费品是药物组合物。优选的组合物是含有香草醛和/或香草醛β-D-葡萄糖苷和一种或多种可药用赋形剂的药物组合物。这些药物组合物可用于配制含有发挥生物效应的一种或多种活性剂的药品。就此而言，药物组合物优选地还包括发挥生物效应的一种或多种活性剂。这样的活性剂包括具有活性的药剂和生物剂。这样的活性剂在本领域中是公知的。参见例如《医生桌面参考》(The Physician’s DeskReference)。这样的组合物可以按照本领域中已知的程序来制备，例如在《Remington制药学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences) , Mack Publishing C0., Easton, PA, USA中所描述的。在一种实施方式中，这样的活性剂包括支气管扩张药、减食欲药、抗组胺药、营养增补剂、缓泻药、镇痛剂、麻醉剂、解酸剂、H2-受体拮抗剂、抗胆碱能类药物、止泻药、缓和剂、止咳药、止恶心药、抗微生物剂、抗细菌剂、抗真菌剂、抗病毒剂、祛痰药、消炎药、退热 剂及其混合物。在一种实施方式中，活性剂是退热剂或镇痛剂，例如布洛芬、对乙酰氨基酚或阿司匹林；缓泻药例如酚酞二辛基磺基琥珀酸钠；食欲抑制剂例如安非他命、苯丙醇胺、苯丙醇胺盐酸盐或咖啡因；解酸剂例如碳酸钙；平喘药例如茶碱；抗利尿剂例如盐酸地芬诺酯；有抗胃肠气胀活性的药剂例如西甲硅油；偏头痛药例如酒石酸麦角胺；精神病药理学药剂例如氟呱啶醇；解痉剂或镇静药例如苯巴比妥；抗运动功能亢进药例如甲基多巴或哌醋甲酯；镇定剂例如苯并二氮卓类、hydroxinmeprobramates或吩噻嗪类；抗组胺药例如阿司咪唑、马来酸氯苯那敏、马来酸吡拉明、琥珀酸多西拉敏、马来酸溴苯那敏、柠檬酸苯托沙敏、盐酸氯环嗪、马来酸非尼拉敏和酒石酸苯茚胺；解充血药例如盐酸苯丙醇胺、盐酸苯肾上腺素、盐酸伪麻黄碱、硫酸伪麻黄碱、重酒石酸苯丙醇胺和麻黄碱；β -受体阻断剂例如普萘洛尔；用于戒酒的药剂例如双硫仑；止咳药例如苯佐卡因、氢溴酸右美沙芬、诺斯卡品、柠檬酸咳必清和盐酸氯苯达诺；氟增补剂例如氟化钠；局部抗生素例如四环素或氯洁霉素；皮质留类增补剂例如泼尼松或泼尼松龙；抗甲状腺肿形成药剂例如秋水仙素或别嘌呤醇；抗癫痫药例如苯妥英钠；抗脱水药剂例如电解质增补剂；防腐剂例如氯化鲸蜡基吡啶；NSAID例如对乙酰氨基酚、布洛芬、萘普生或其盐；胃肠活性剂例如洛哌丁胺和法莫替丁 ；各种生物碱类例如磷酸可待因、硫酸可待因或吗啡；微量元素增补剂例如氯化钠、氯化锌、碳酸钙、氧化镁和其他碱金属盐和碱土金属盐；维生素；离子交换树脂例如消胆胺；胆甾醇抑制药和降脂物质；抗心律不齐药例如N-乙酰普鲁卡因酰胺；以及祛痰药例如愈创木酚甘油醚。[0038]具有特别令人不快的味道的活性物质包括抗细菌剂例如环丙沙星、氧氟沙星和培氟沙星；抗癫痫药例如唑尼沙胺；大环内酯类抗生素例如红霉素；β -内酰胺类抗生素例如青霉素类和头孢菌素类；治疗精神病的活性物质例如氯丙嗪；活性物质例如安乃近；以及具有抗溃疡活性的药剂例如西咪替丁。
[0039]本发明的药物组合物以适合于实现它们所打算的目的的任何形式给药于对象。然而，优选地，组合物是可以通过颊或口部给药的组合物。或者，药物组合物可以是口或鼻喷剂。对象是任何动物例如人类，尽管本发明不打算仅限于此。其他适合的动物包括犬科动物、猫科动物、狗、猫、牲畜、马、牛、绵羊等。当在本文中使用时，兽用组合物是指适用于非人类动物的药物组合物。这样的兽用组合物在本领域中是已知的。
[0040]在另一种实施方式中，药物组合物是用于口服给药的液体剂型，包括可药用乳液、溶液、悬液、糖浆和酏剂。除了活性化合物之外，液体剂型可以含有本领域中常用的惰性稀释剂例如水或其他溶剂，增溶剂和乳化剂例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油类(尤其是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和失水山梨糖醇的脂肪酸酯及其混合物。除了活性化合物之外，悬液还可以包含悬浮剂例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇和失水山梨糖醇的酯类、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄耆树胶及其混合物。
[0041]本发明的药物组合物可以采取可咀嚼片剂的形式。可咀嚼片剂在本领域中是已知的。参见例如美国专利号4，684，534和6，060, 078，其每个以其全部内容通过参考并入本文。可以将任何类型的药物包含在可咀嚼片剂中，优选为具有苦味的药物、天然植物提取物或其他有机化合物。更优选地,可以在核心中包含维生素例如维生素Α、维生素B、维生素B1、维生素Β2、维生素Β6、维生素C、维生素E和维生素K ;天然植物提取物例如 Sohgunjung-tang 提取物、Sipchundaebo-tang 提取物和刺五加片(Eleutherococcussenticosus)提取物；有机化合物例如茶苯海明、氯苯甲嗪、对乙酰氨基酹、阿司匹林、苯丙醇胺和氯化鲸蜡基吡啶；或胃肠药剂例如干燥的氢氧化铝凝胶、多潘立酮、可溶性甘菊环烃、L-谷氨酰胺和水滑石。
[0042]本发明的药物组合物可以是口服崩解组合物。口服崩解片剂在本领域中是已知的。参见例如美国专利号6，368，625和6，316，029，其每个以其全部内容通过参考并入本文。
[0043]本发明的药物组合物可以是固体剂型，包括香草醛或香草醛β-D-葡萄糖苷和水和/或唾液激活的泡腾颗粒，例如具有可控泡腾速率的泡腾颗粒。泡腾组合物还可以包含药物活性化合物。泡腾药物组合物在本领域中是已知的。参见例如美国专利号6，649，186，其全部内容通过参考并入本文。泡腾组合物可用于以下应用:制药、兽医、园艺、家用、食品、烹饪、杀虫、农业、化妆品、除草、工业、清洁、甜食和调味。含有包含香草醛或香草醛β -D-葡萄糖苷的泡腾组合物的制剂还可以包括一种或多种其他佐剂和/或活性成分，其选自本领域中已知的成分，包括调味剂、稀释剂、着色剂、粘合剂、填充剂、表面活性剂、崩解剂、稳定剂、压实介质和非泡腾崩解剂。
[0044]药物组合物可以是膜状或薄片状药物组合物。这样的膜状或薄片状药物组合物可以被配置成例如快速崩解的给药形式，例如在I秒直至3分钟的时间段内崩解的给药形式，或配置成缓慢崩解的给药形式，例如在3至15分钟的时间段内崩解的给药形式。通过使用例如具有不同的崩解或溶解特性的形成基质的聚合物，可以将所示崩解时间设定到上述范围。因此，通过混合相应的聚合物组分，可以调节崩解时间。此外，将水“抽取”到基质内并引起基质从内部迸裂的崩解剂是已知的。因此，本发明的某些实施方式包括这样的崩解剂以便调整崩解时间。
[0045]用于膜状或薄片状药物组合物的适合聚合物包括纤维素衍生物、聚乙烯醇(例如M0W10L)、聚丙烯酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素醚例如乙基纤维素，以及聚乙烯醇、聚氨酯、聚甲基丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯以及上述聚合物的衍生物和共聚物。
[0046]在某些实施方式中，本发明的膜状或薄片状药物组合物的总厚度优选地为5μπι直到IOmm,优选地30 μ m至2mm,特别优选地0.1mm至1mm。药物制剂可以是圆形、卵形、椭圆形、三角形、四边形或多边形，但它们也可以具有任何圆滑的形状。
[0047]本发明的药物组合物可以采取气溶胶形式。气溶胶组合物还可以包含药物活性剂。气溶胶组合物在本领域中是已知的。参见例如美国专利号5，011，678，其全部内容通过参考并入本文。作为非限制性实例，本发明的气溶胶组合物可以包括医学有效量的药物活性物质、香草醛或香草醛β -D-葡萄糖苷和生物相容的推进剂，例如烃/氟碳化合物推进剂。
[0048]在本发明的一种实施方式中，药物组合物是营养组合物。具有不想要的味道的营养组合物的实例包括但不必定限于用于治疗营养缺陷、创伤、手术、克罗恩病、肾病、高血压、肥胖症等的肠营养品，用于促进运动性能、肌肉增强或综合健康状况或先天性代谢障碍例如苯丙酮尿症的肠营养品。具体来说，这样的营养制剂可以含有具有苦味或金属味或回味的一种或多种氨基酸 。这样的氨基酸包括但不限于必需氨基酸例如亮氨酸、异亮氨酸、组氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸的L-异构体。
[0049]在一种实施方式中，本发明的消费品是含有香草醛和/或香草醛β-D-葡萄糖苷的牙齿卫生组合物。牙齿卫生组合物在本领域中是已知的，包括但不必定限于牙膏、漱口液、牙斑冲洗液、牙线、牙痛缓解剂(例如ANBES0L)等。
[0050]在另一种实施方式中，本发明的消费品是含有香草醛和/或香草醛β -D-葡萄糖苷的化妆品。例如但不是限制性地，化妆品可以是面霜、口红、唇彩等。本发明的其他适合的组合物包括润唇膏例如CHAPSTICK或BURT’ S BEESWAX润唇膏，其还包含香草醛和/或香草醛β-D-葡萄糖苷。
[0051]Arom多功能酶(AROM)多肽
[0052]AROM多肽的非限制性实例包括具有SEQ ID NO:4中显示的氨基酸序列的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)多妝(GENBANK登记号X06077),粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)多妝(GENBANK登记号NP_594681.1), Schizosaccharomycesjaponicas 多妝(GENBANK 登记号 XP_002171624),粗糖脉抱霉(Neurospora crassa)多妝(GENBANK 登记号 XP_956000)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)多肽(GENBANK 登记号 XP_505337)。
[0053]当在本文中使用时，术语“AR0M多肽”是指与SEQ ID NO:4中显示的序列具有至少80% (例如至少85、90、95、96、97、98、99或100%)的同一性，并具有酿酒酵母AROM多肽的5
种酶活性即3-脱氢奎尼酸脱水酶活性、3-脱氢奎尼酸合成酶活性、3-磷酸莽草酸1-羧基乙烯基转移酶活性、莽草酸3-脱氢酶(NADP+)活性和莽草酸激酶活性中的至少4种活性的任意氨基酸序列。
[0054]根据本发明的一种实施方式，AROM多肽是具有降低的莽草酸脱氢酶活性的突变体AROM多肽。当在重组宿主中表达时，突变体AROM多肽将代谢流从芳香族氨基酸生产重新导向香草醛前体生产(图2)。降低的莽草酸脱氢酶活性可以使用LC-MS，从表达突变体AROM多肽的重组宿主中脱氢莽草酸的积累推断出来。
[0055]本文描述的突变体AROM多肽可以在结构域5中具有一个或多个突变(例如一个或多个氨基酸的置换，一个或多个氨基酸的缺失，一个或多个氨基酸的插入，或置换、缺失和插入的组合)。例如,突变体AROM多肽可以在结构域5的至少一部分中具有缺失(例如整个结构域5即SEQ ID NO:4中的氨基酸序列的1305至1588位氨基酸的缺失)，或者可以在结构域5中具有一个或多个氨基酸置换，从而使得突变体AROM多肽具有降低的莽草酸脱氢酶活性。缺少结构域5的示例性的突变体AROM多肽提供在SEQ ID N0:2中。在结构域5中具有至少一个氨基酸置换的示例性突变体AROM多肽包括分别显示在SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:8,SEQ ID NO: 10,SEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 14,SEQ ID NO: 16,SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:22 和 SEQ ID NO:24 中的 AROM 多肽 A1533P、P1500K、R1458W、V1349G、T1366G、I1387H、W1571V、T1392K、K1370L 和 A1441P。
[0056]特别有用的氨基酸置换可以存在于例如与SEQ ID NO:4中显示的氨基酸序列的1349、1366、1370、1387、1392、1441、1458、1500、1533 或 1571 位置对齐的一个或多个位置处。例如,修饰的AROM多肽可以在与SEQ ID NO:4中显示的氨基酸序列的1370位置或1392位置对齐的位置处具有置换。
[0057]例如，修饰的AROM多肽可以具有一个或多个下列氨基酸:在与SEQ ID NO:4中显示的氨基酸序列的1349位置对齐的位置处，缬氨酸之外的氨基酸(例如甘氨酸)；在与SEQID NO:4中显示的氨基酸序列的1366位置对齐的位置处，苏氨酸之外的氨基酸(例如甘氨酸)；在与SEQ ID NO:4中显示的氨基酸序列的1370位置对齐的位置处，赖氨酸之外的氨基酸(例如亮氨酸)；在与SEQ ID NO:4中显示的氨基酸序列的1387位置对齐的位置处，异亮氨酸之外的氨基酸(例如组氨酸)；在与SEQ ID NO:4中显示的氨基酸序列的1392位置对齐的位置处，苏氨酸之外的氨基酸(例如赖氨酸);在与SEQ ID NO:4中显示的氨基酸序列的1441位置对齐的位置处，丙氨酸之外的氨基酸(例如脯氨酸)；在与SEQ ID NO:4中显示的氨基酸序列的1458位置对齐的位置处，精氨酸之外的氨基酸(例如色氨酸)；在与SEQ IDNO:4中显示的氨基酸序列的1500位置对齐的位置处，脯氨酸之外的氨基酸(例如赖氨酸)；在与SEQ ID NO:4中显示的氨基酸序列的1533位置对齐的位置处，丙氨酸之外的氨基酸(例如脯氨酸)；或在与SEQ ID NO:4中显示的氨基酸序列的1571位置对齐的位置处，色氨酸之外的氨基酸(例如缬氨酸)。
[0058]在某些实施方式中，将修饰的AROM多肽融合到催化香草醛生物合成的第一关键步骤的多肽3-脱 氢莽草酸脱水酶(3DSD)。具有3DSD活性并且适用于融合多肽中的多妝包括来自于 Podospora pauciseta、玉米黑粉菌(Ustilago maydis)、Rhodoicoccusjosti1、不动杆菌属物种(Acinetobacter sp.)、黑曲霉(Aspergillus niger)或粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)的 3DSD 多肽。参见 GENBANK 登记号 CAD60599、ΧΡ_001905369.1、XP_761560.UABG93191.UAAC37159.1 和 XM_001392464。[0059]例如，可以将修饰的缺少结构域5的AROM多肽融合到具有3DSD活性的多肽(例如Podospora pauciseta3DSD)。SEQ ID NO:26显示了这样的蛋白质的氨基酸序列，SEQ IDNO:27显示了编码所述蛋白质的核酸序列。
[0060]儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)多肽
[0061]在某些实施方式中，本发明的COMT多肽可以是咖啡酰基-O-甲基转移酶。在其他实施方式中，COMT多肽优选地是儿茶酚-O-甲基转移酶。更优选地，本发明的COMT多肽是相对于具有SEQ ID NO:27中显示的氨基酸序列的智人(Homo sapiens)C0MT具有提高的原儿茶醛、原儿茶酸和/或原儿茶醇的间位羟基甲基化的突变体(COMT)多肽。
[0062]可以根据本发明进行突变的COMT多肽的非限制性实例，包括分类在EC编号
2.1.1.6下的家族中的COMT多肽，例如具有SEQ ID NO:27中显示的氨基酸序列的智人(Hs)多肽(也参见GENBANK登记号NM_000754)，具有SEQ ID NO:53中显示的氨基酸序列的拟南芥(Arabidopsis thaliana)多肽(GENBANK 登记号 AY062837)，或具有 SEQ ID NO:54 中显示的氨基酸序列的草莓(Fragaria x ananassa)多肽(GENBANK登记号AF220491 )。人类COMT多肽存在几种变体，并且COMT多肽可以是这些变体中的任一个，然而在优选实施方式中，人类COMT多肽是SEQ ID N0:27或SEQ ID NO:55。其他适合用于本发明的哺乳动物COMT多肽包括但不限于从下述物种分离到的COMT多肽:黑猩猩(Pan troglodytes)(GENBANK 登记号 XP_514984)，普通猕猴(Macaca mulatta) (GENBANK 登记号 AFJ70145)，家马(Equus caballus) (GENBANK 登记号 NP_001075303),家犬(Canis lupus familiaris)(GENBANK登记号 AAR20324)，黑线仓鼠(Cricetulus griseus)(GENBANK登记号 EGV97595)，野猪(Sus scrofa) (GENBANK 登记号 ΝΡ_001182259)和家牛(Bos taurus) (GENBANK 登记号ΝΡ_001095787)。来自于植物和微生物来源的其他示例性COMT多肽包括但不限于从下列物种分离的COMT多肽:月季(Rosa chinensis) (GENBANK登记号CAD29457)，扁桃(Prunus dulcis) (GENBANK 登记号 CAA58218),陆地棉(Gossypium hirsutum) (GENBANK 登记号 ACT32028),麻风树(Jatropha curcas)(GENBANK 登记号 ACT87981),赤按(Eucalyptuscamaldulensis) (ADB82906), Candida orthopsilosis (GENBANK 登记号 CCG25047)，树干毕赤酵母(Pichia stipitis) (GENBANK 登记号 ABN67921)和 Spathaspora passalidarum(GENBANK登记号EGW29958)。在某些实施方式中，本发明的COMT多肽从下述物种获得:致病疫霉(Phytophthera infestans) (GENBANK 登记号 XP_002899214),长春花(Catharanthusroseus) (GENBANK 登记号 EGS21863)，解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica) (GENBANK登记号 XP_500451)，玻璃海鞘(Ciona intestinalis) (GENBANK 登记号 XP_002121420或 XP_002131313)，Capsasproa owczarzaki (GENBANK 登记号 EFW46044)，嗜热毛壳菌(Chaetomium therophilum) (GENBANK 登记号 EGS21863),卢西坦棒抱酵母(Clavisporalusitaniae) (GENBANK 登记号 XP_002899214),副球抱子菌属物种(Paracoccidioidessp) ‘lutzii’PbOl (GENBANK 登记号 XP_002793380)，扁叶香果兰(Vanilla planifolia)(SEQ ID NO:56)，阿拉比卡咖啡树(Coffea Arabica) (GENBANK 登记号 AAN03726)，大鼠(Rattus norvegicus) (GENBANK 登记号 NP_036663),小鼠(Mus musculus) (GENBANK 登记号 NP_031770),泉古菌(Crenarchaeote) (GENBANK 登记号 ABZ07345), Mycobacteriumvanbaleeni (GENBANK 登记号 ABM14078),或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(GENBANK登 记号NP_001018770)，其已被显示表现出所需的COMT活性(图3B和3C)。[0063]当在本文中使用时，术语“C0MT多肽”是指与SEQ ID N0:27中显示的Hs COMT序列具有至少80% (例如至少85、90、95、96、97、98、99或100%)的同一性并具有野生型Hs COMT多肽的儿茶酚-O-甲基转移酶活性的任意氨基酸序列。
[0064]在一种实施方式中，当在本文中使用时，术语“突变体COMT多肽”是指其具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:27中显示的Hs COMT序列具有至少80%、例如至少85%、例如至少90%、例如至少95%、例如至少96%、例如至少97%、例如至少98%、例如至少99%的同一性，并且能够催化原儿茶酸和/或原儿茶醛的间位处的-OH基团的甲基化的任意多肽，其中所述突变体COMT多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:27的差别为至少一个氨基酸。此外，突变体COMT多肽的氨基酸序列应该与SEQ ID NO:53,SEQ ID N0:54和SEQ ID N0:55有至少一个氨基酸的差别。优选地，突变体COMT多肽与任意野生型COMT多肽的任意序列有至少一个氨基酸的差别。
[0065]在本发明的另一种实施方式中，术语“突变体COMT多肽”是指其具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:54具有至少80%、例如至少85%、例如至少90%、例如至少95%、例如至少96%、例如至少97%、例如至少98%、例如至少99%的同一性，并且能够催化原儿茶酸和/或原儿茶醛的间位处的-OH基团的甲基化的多肽，其中所述突变体COMT多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54中的每一个具有至少一个氨基酸的差别。
[0066]本文描述的突变体COMT多肽在例如底物结合位点中可以具有一个或多个突变(例如一个或多个氨基酸的置换，一个或多个氨基酸的缺失，一个或多个氨基酸的插入，或置换、缺失和插入的组合)。例如，突变体COMT多肽可以在人类COMT的底物结合位点中具有一个或多个氨基酸置换。
[0067]在某些实施方 式中，本发明的“突变体COMT多肽”与SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:53,SEQ ID N0:54或SEQ ID NO:55仅有一个或两个氨基酸残基的差别，其中所述突变体与野生型蛋白质之间的差别在底物结合位点中。
[0068]正如本文所描述的，突变体COMT多肽可用于提高香草醛葡萄糖苷的生物合成。例如，突变体COMT多肽可以具有下述性质中的一个或多个:提高的周转；倾向于在间位(3’)而不是对位(4’ )处甲基化，以便相对于异香草醛更有利于香草醛的生产；或对香草醛途径底物原儿茶酸和原儿茶醛的更好的特异性。突变体COMT多肽可以在体外使用甲基化分析法表征，或者在重组宿主体内基于香草酸、香草醛或香草醛葡萄糖苷的生产来表征。
[0069]异香草醛、香草醛、异香草酸和香草酸的结构如下所示。
[0070]
【权利要求】
1.一种用于生产香草醒和/或香草醒β -D-葡萄糖苷的方法,所述方法包括: Ca)提供能够生产香草醛的重组宿主，其中所述重组宿主带有编码突变体Arom多功能酶(AROM)多肽和/或突变体儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)多肽的异源核酸； (b)将所述重组宿主培养足以使所述重组宿主产生香草醛和/或香草醛葡萄糖苷的时间；以及 (c)从所述重组宿主或从所述培养上清液分离香草醛和/或香草醛葡萄糖苷，由此生产香草醛和/或香草醛β -D-葡萄糖苷。
2.权利要求1的方法，其中所述突变体AROM多肽相对于野生型AROM多肽表现出降低的莽草酸脱氢酶活性。
3.权利要求1或2的方法，其中所述突变体AROM多肽包含下述突变中的一个或多个: (a)在与SEQID NO:4中显示的氨基酸序列的1349位置对齐的位置处，缬氨酸之外的氨基酸；(b)在与SEQID NO:4中显示的氨基酸序列的1366位置对齐的位置处，苏氨酸之外的氨基酸；(c)在与SEQID NO:4中显示的氨基酸序列的1370位置对齐的位置处，赖氨酸之外的氨基酸； (d)在与SEQID NO:4中显示的氨基酸序列的1387位置对齐的位置处，异亮氨酸之外的氨基酸；(e)在与SEQID NO:4中显示的氨基酸序列的1392位置对齐的位置处，苏氨酸之外的氨基酸；(f)在与SEQID NO:4中显示的氨基酸序列的1441位置对齐的位置处，丙氨酸之外的氨基酸；(g)在与SEQID NO:4中显示的氨基酸序列的1458位置对齐的位置处，精氨酸之外的氨基酸；(h)在与SEQID NO:4中显示的氨基酸序列的1500位置对齐的位置处，脯氨酸之外的氨基酸； (i)在与SEQID NO:4中显示的氨基酸序列的1533位置对齐的位置处，丙氨酸之外的氨基酸；以及 (j)在与SEQ ID NO:4中显示的氨基酸序列的1571位置对齐的位置处，色氨酸之外的氨基酸。
4.权利要求1或2的方法，其中所述突变体AROM多肽包含下述突变中的一个或多个:(a)在与SEQID NO:4中显示的氨基酸序列的1349位置对齐的位置处的甘氨酸残基；(b)在与SEQID NO:4中显示的氨基酸序列的1366位置对齐的位置处的甘氨酸残基；(c)在与SEQID NO:4中显示的氨基酸序列的1370位置对齐的位置处的亮氨酸残基；(d)在与SEQID NO:4中显示的氨基酸序列的1387位置对齐的位置处的组氨酸残基；(e)在与SEQID NO:4中显示的氨基酸序列的1392位置对齐的位置处的赖氨酸残基；(f)在与SEQID NO:4中显示的氨基酸序列的1441位置对齐的位置处的脯氨酸残基；(g)在与SEQID NO:4中显示的氨基酸序列的1458位置对齐的位置处的色氨酸残基；(h)在与SEQID NO:4中显示的氨基酸序列的1500位置对齐的位置处的赖氨酸残基；(i)在与SEQ ID NO:4中显示的氨基酸序列的1533位置对齐的位置处的脯氨酸残基；以及 (j)在与SEQ ID NO:4中显示的氨基酸序列的1571位置对齐的位置处的缬氨酸残基。
5.权利要求1或2的方法，其中所述突变体AROM多肽缺失结构域5的至少一部分。
6.权利要求1、2或5的方法，其中所述突变体AROM多肽缺少结构域5。
7.权利要求1、2、5或6的方法，其中所述突变体AROM多肽是融合多肽，其包含: (i)缺失结构域5的至少一部分；并且 (ii)具有3-脱氢莽草酸脱水酶(3DSD)活性。
8.权利要求1的方法，其中所述突变体COMT多肽能够催化原儿茶酸的-OH基团的甲基化，其中所述甲基化导致产生与异香草酸相比至少4倍多的香草酸。
9.权利要求1或8的方法，其中所述突变体COMT多肽具有在SEQID NO:27的整个长度上确定的与SEQ ID NO:27享有至少80%序列同一性的氨基酸序列；并且其具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:27的差别为至少一个氨基酸残基。
10.权利要求1、8或9的方法，其中所述突变体COMT多肽在SEQID NO:27中显示的氨基酸序列中包含I至10个氨基酸置换。
11.权利要求1、8、9或10的方法，其中所述突变体COMT多肽在SEQID NO:27的198位置处包含具有比亮氨酸更低的亲水指数的氨基酸。
12.权利要求1、8、9、10或11的方法，其中所述突变体COMT多肽在SEQID NO:27的198位置处包含 Ala、Arg、Asn、Asp、Cys> Glu、Gin、Gly、His、Lys> Met> Phe> Pro、Ser> Thr>Trp 和 Tyr。
13.权利要求1或8-12的方法，其中所述突变体COMT多肽在SEQID NO:27的199位置处包含在PH7.4下具有中性或正的侧链电荷的氨基酸。
14.权利要求1或8-13的方法，其中所述突变体COMT多肽在SEQID NO:27的199位置处包含 Ala、Arg、Asn、Cys> Gin、Gly、His、lie、Leu、Lys> Met、Phe> Pro、Ser> Thr> Trp>Tyr 和 Val。
15.前述权利要求任一项的方法，其中所述突变体AROM多肽或突变体COMT多肽还在所述多肽的N-端或C-端包含纯化标签、叶绿体转运肽、线粒体转运肽、造粉体肽、信号肽或分泌标签。
16.前述权利要求任一项的方法，其中所述宿主是微生物。
17.前述权利要求任一项的方法，其中所述宿主是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)或大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)。
18.前述权利要求任一项的方法，其中所述宿主是包含pdcl缺失、gdhl缺失并且过表达谷氨酸脱氢酶2 (GHD2)的酿酒酵母(S.cerevisiae)。
19.权利要求1-15任一项的方法，其中所述宿主是植物或植物细胞。
20.权利要求1-15或19任一项的方法，其中所述宿主是小立碗藓属(Physcomitrella)植物或植物细胞、或烟草植物或植物细胞。
21.前述权利要求任一项的方法，其中所述宿主还包含编码3-脱氢莽草酸脱水酶(3DSD)的基因、编码芳香族羧酸还原酶(ACAR)的基因、编码尿苷5’ - 二磷酸葡萄糖基转移酶(UGT)的基因、编码磷酸泛酰巯基乙胺转移酶(PPTase)的基因和/或编码香草醇氧化酶(VAO)的基因。
22.前述权利要求任一项的方法，其中所述宿主带有编码突变体COMT多肽的异源核酸，并且还包含编码野生型AROM多肽的基因。
23.权利要求1-21任一项的方法，其中所述宿主带有编码突变体AROM多肽的异源核酸，并且还包含编码野生型O-甲基转移酶(OMT)的基因。
24.一种提取物，其包含通过前述任一方法生产的香草醛和/或香草醛葡萄糖苷。
25.一种消费品，其包含权利要求24的提取物。
26.权利要求25的消费品，其中所述消费品是食品、药物组合物、饮食增补剂、营养品、牙齿卫生组合物、餐桌甜味剂或化妆品。
27.一种分离的突变体Arom多功能酶(AROM)多肽或突变体儿茶酚_0_甲基转移酶(COMT)多肽，其中所述突变体AROM多肽相对于野生型AROM多肽表现出降低的莽草酸脱氢酶活性，并且所述突变体COMT多肽能够催化原儿茶酸的-OH基团的甲基化，其中所述甲基化导致产生与异香草酸相比至少4倍多的香草酸。
28.权利要求27的分离的突变体AROM多肽，其中所述突变体AROM多肽包含下述突变中的一个或多个: (a)在与SEQID NO:4中显示的氨基酸序列的1349位置对齐的位置处，缬氨酸之外的氨基酸； (b)在与SEQID NO:4中显示的氨基酸序列的1366位置对齐的位置处，苏氨酸之外的氨基酸； (c)在与SEQID NO:4中显示的氨基酸序列的1370位置对齐的位置处，赖氨酸之外的氨基酸； (d)在与SEQID NO:4中显示的氨基酸序列的1387位置对齐的位置处，异亮氨酸之外的氨基酸； (e)在与SEQID NO:4中显示的氨基酸序列的1392位置对齐的位置处，苏氨酸之外的氨基酸； (f)在与SEQID NO:4中显示的氨基酸序列的1441位置对齐的位置处，丙氨酸之外的氨基酸； (g)在与SEQID NO:4中显示的氨基酸序列的1458位置对齐的位置处，精氨酸之外的氨基酸； (h)在与SEQID NO:4中显示的氨基酸序列的1500位置对齐的位置处，脯氨酸之外的氨基酸； (i)在与SEQID NO:4中显示的氨基酸序列的1533位置对齐的位置处，丙氨酸之外的氨基酸；以及 (j)在与SEQ ID NO:4中显示的氨基酸序列的1571位置对齐的位置处，色氨酸之外的氨基酸。
29.权利要求27或28的分离的突变体AROM多肽，其中所述突变体AROM多肽包含下述突变中的一个或多个: (a)在与SEQ ID NO:4中显示的氨基酸序列的1349位置对齐的位置处的甘氨酸残基；(b)在与SEQID NO:4中显示的氨基酸序列的1366位置对齐的位置处的甘氨酸残基； (c)在与SEQID NO:4中显示的氨基酸序列的1370位置对齐的位置处的亮氨酸残基； (d)在与SEQID NO:4中显示的氨基酸序列的1387位置对齐的位置处的组氨酸残基； (e)在与SEQID NO:4中显示的氨基酸序列的1392位置对齐的位置处的赖氨酸残基； (f)在与SEQID NO:4中显示的氨基酸序列的1441位置对齐的位置处的脯氨酸残基； (g)在与SEQID NO:4中显示的氨基酸序列的1458位置对齐的位置处的色氨酸残基； (h)在与SEQID NO:4中显示的氨基酸序列的1500位置对齐的位置处的赖氨酸残基； (i)在与SEQID NO:4中显示的氨基酸序列的1533位置对齐的位置处的脯氨酸残基；以及 (j)在与SEQ ID NO:4中显示的氨基酸序列的1571位置对齐的位置处的缬氨酸残基.
30.权利要求27的分离的突变体AROM多肽，其中所述突变体AROM多肽缺失结构域5的至少一部分。
31.权利要求27或30的分离的突变体AROM多肽，其中所述突变体AROM多肽缺少结构域5。
32.权利要求27、30或31的分离的突变体AROM多肽，其中所述突变体AROM多肽是融合多肽，其包含: (i)缺失结构域5的至少一部分；并且 (ii)具有3-脱氢莽草酸脱水酶(3DSD)活性。
33.权利要求27的分离的突变体COMT多肽，其中所述突变体COMT多肽具有在SEQIDNO:27的整个长度上确定的与SEQ ID NO:27享有至少80%序列同一性的氨基酸序列；并且其具有的氨基酸序列与SEQ ID NO ,21的差别为至少一个氨基酸残基。
34.权利要求27或33的分离的突变体COMT多肽，其在SEQID NO:27中显示的氨基酸序列中包含I至10个氨基酸置换。
35.权利要求27、33或34任一项的分离的突变体COMT多肽，其中所述突变体COMT多肽在SEQ ID NO ,21的198位置处包含具有比亮氨酸更低的亲水指数的氨基酸。
36.权利要求27或33-35任一项的分离的突变体COMT多肽，其中所述突变体COMT多肽在 SEQ ID NO:27 的 198 位置处包含 Ala、Arg、Asn、Asp、Cys, Glu、Gin、Gly、His、Lys,Met、Phe> Pro、Ser> Thr> Trp 和 Tyr。
37.权利要求27或33-36任一项的分离的突变体COMT多肽，其中所述突变体COMT多肽在SEQ ID NO:27的199位置处包含在pH7.4下具有中性或正的侧链电荷的氨基酸。
38.权利要求27或33-37任一项的分离的突变体COMT多肽，其中所述突变体COMT多肽在 SEQ ID NO:27 的 199 位置处包含 Ala、Arg、Asn、Cys, Gin、Gly、His、lie、Leu、Lys,Met、Phe> Pro、Ser、Thr、Trp> Tyr 和 Val。
39.权利要求27-38任一项的分离的突变体多肽，其中所述突变体AROM多肽和/或突变体COMT多肽还在所述多肽的N-端或C-端包含纯化标签、叶绿体转运肽、线粒体转运肽、造粉体肽、信号肽或分泌标签。
40.一种分离的核酸，其编码权利要求27-39任一项的突变体AROM多肽和/或突变体COMT多肽。
41.一种重组宿主，其包含编码权利要求27-39任一项的突变体AROM多肽和/或突变体COMT多肽的异源核酸。
42.权利要求41的重组宿主，其中所述重组宿主还包含编码3-脱氢莽草酸脱水酶(3DSD)多肽的核酸、编码芳香族羧酸还原酶(ACAR)多肽的核酸、编码磷酸泛酰巯基乙胺转移酶(PPTase)多肽的核酸、编码尿苷5’ - 二磷酸葡萄糖基转移酶(UGT)多肽的核酸和/或编码香草醇氧化酶(VAO)的核酸。
43.权利要求41或42的重组宿主，其中所述宿主带有编码突变体COMT多肽的异源核酸，并且还包含编码野生型AROM多肽的基因。
44.权利要求41或42的重组宿主，其中所述宿主带有编码突变体AROM多肽的异源核酸，并且还包含编码野生型O-甲基转移酶(OMT)的基因。
45.权利要求41-44任一项的重组宿主，其中所述重组宿主是微生物。
46.权利要求41-45任一项的重组宿主，其中所述重组宿主是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)或大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)。
47.权利要求41-44任一项的重组宿主，其中所述宿主是植物或植物细胞。
48.权利要求41-44或47任一项的重组宿主，其中所述宿主是小立碗鲜属(Physcomitrella)植物或植物细胞、或烟草植物或植物细胞。
【文档编号】C12P1/04GK103987840SQ201280048260
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2012年8月7日 优先权日:2011年8月8日
【发明者】于尔根·汉森, 埃斯本·哈尔克耶尔·汉森, 霍尼·泊卢尔, 约瑟夫·M·谢里登, 乔纳森·R·希尔, 威廉·D.O.·汉密尔顿 申请人:国际香料香精公司, 伊沃华公司