专利名称：一个基于随机单接头扩增dna文库的方法
技术领域：
本发明涉及一种DNA文库的扩增方法，具体的说，涉及一种只利用单一的接头扩增DNA文库方法，从而减少接头合成的费用，以及减少扩增的非特异性。
背景技术：
随着第二代测序技术的发展及应用，人们能很方便的测出样品DNA序列，从而确定样品。但是目前第二代测序对于原始样品浓度有着比较高的要求，如深圳华大基因公司在进行基因组目标区域测序时，要求样品总量大于6 μ g DNA,浓度大于50ng/ μ L，对于一些微量样品，就比较难达到测序的要求。其中一个解决办法是对样品加上通用接头进行扩增，然后再送去测序。
目前市场上已经有比较成熟的接头试剂盒，如illumina公司就制造了为其公司测序仪测序的接头，目前市场上的接头试剂盒价格较昂贵，切有一定偏向性，比如illumina 公司的接头适合扩增300-500bp的DNA片段，且大部分接头序列在3’末端没有酶切位点， 扩增后的产物比较难去除干净接头序列。发明内容
本发明要解决的技术问题是针对市场接头昂贵、扩增后不易去除接头序列等问题，提供一种新型的接头。
本发明的技术解决方案首先随机生成25_30bpDNA序列最为接头，然后在该接头 3’末端加上平末端的酶切位点，根据随机接头设计引物。具体地说，包括如下步骤
1.随机序列的生成可以用通过写程序也可以在相关网站上随机生成接头序列的一条序列，另一条是其反向互补序列，例如http://bioinformatics· org/sms/index. htm0
2.平末端酶切序列的选择可以自由的选择平末端的限制性酶切酶如MlyI酶切位点见图1，这个酶不仅可以切除接头还能把酶切序列完全切 除干净。
3.接头序列的引物的设计可以直接利用接头的前15_20bpDNA序列作为引物。
4.接头及引物的合成随机序列加上酶切序列便成了接头，要注意接头必须有一条链3’突出T，送出引物合成公司合成即可。
5. DNA末端处理引物接头是T突出，所以用先用Klenow Fragment (3' —5' exo_)处理DNA使用末端突出A。
6. DNA样品纯化纯化上一步DNA样品
7.接头退火把根据两条合成好的接头单链的退火温度(TM)，设置退火程序，使其退火杂交成双链接头。
8.加接头把已经纯化好的DNA样品连接制备好的双链接头。
8. DNA样品纯化纯化上一步的DNA样品。
9. PCR:用接头引物扩增DNA样品。
10. PCR产物纯化纯化扩增产物。
11 :切除接头用相应的限制性内切酶切除接头。
12 =DNA样品纯化纯化上一步产物。
本方法具有如下的优点和效果
1.本方法可以对微量DNA样品进行扩增，与市场上的接头试剂盒相比，容易生产， 造价便宜，无DNA长度偏向性。
2.本方法，具有操作简便、试剂有效期长、成本低廉、反应灵敏等优点。
3.本方法可以比较完全去除接头序列和酶切序列。
图1为MlyI酶切序列图。
图2为随机单接头图。
图3为接头和样品DNA连接图，图左边和右边是全式金公司IOObp DNALadder, 分子量依次是 IOObp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、IOOObp、 1500bp，中间是连接产物。
图4为扩增样品DNA图，图左边和右边是全式金公司IOObp DNA Ladder，中间是扩增产物。
图5为超声打断Hela S3基因组图，图左边是全式金公司IOObp DNA Ladder，右边是金公司 IKbp DNALadder,分子量依次是 Ikbp、2kbp、3kbp、4kbp、5kbp、6kbp、8kbp、IOkbp。
图6为200-600bp文库扩增图，图左边和右边是全式金公司IOObp DNALadder，中间是扩增产物。
具体实施方式
实施实例I
用随机单接头扩增DNA文库的过程
1.接头的序列设计及合成根据需要设计了如图2接头。
2.接头退火取10 μ L，100 μ M/L接头单链加入的80 μ L，ddH20中，按表I的程序杂交。
表1:接头退火杂交程序
权利要求
1.一个基于随机单接头扩增DNA文库的方法，其特征在于用一个随机生成的序列加上一个酶切序列构成一个双链单接头，把双链单接头加到文库DNA两端，用接头引物就能扩增文库DNA。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于用接头引物扩增两端加上接头的文库DNA。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于包括以下步骤(1)随机单接头的设计与合成；(2)文库DNA与随机单接头相连；(3)扩增文库DNA，并切除接头。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于步骤(I)随机单接头的设计与合成 用程序或软件生成随机序列，根据需要在3’末端加入酶切位点，并使双链接头3’ T突出，送引物合成公司合成。根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于步骤(2)文库DNA与随机单接头相连 用 Klenow Fragment (3' —> 5' exo_)处理文库 DNA,用 T4DNA Ligase 连接文库 DNA 与随机单接头。
5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于步骤(3)扩增文库DNA:用随机单接头引物用PCR扩增DNA文库，并用相应的限制性内切酶切除接头。
全文摘要
一个基于随机单接头扩增DNA文库的方法，是将一个随机生成的序列加上一个酶切序列并末端突出T的双链接头加到文库DNA两头，并用接头引物对连接产物扩增，从而达到扩增DNA文库的目的。由于接头制备简单快速，价格便宜，对于快速扩增微量DNA文库提供了一种简单低价的方法。
文档编号C12Q1/68GK103060310SQ201310013630
公开日2013年4月24日 申请日期2013年1月15日 优先权日2013年1月15日
发明者张玉祥, 邹斌斌 申请人:首都医科大学