一种枯草芽孢杆菌基因文库的构建方法
【专利摘要】一种枯草芽孢杆菌基因文库的构建方法。它涉及一种一种微生物基因文库的构建方法。它利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B29提供了一种枯草芽孢杆菌基因文库的构建方法。构建方法：一、提取枯草芽孢杆菌B29基因组DNA；二、提取pUC19质粒；三、基因组不完全酶切及不完全酶切产物回收；四、载体去磷酸化；五、连接和转化；六、文库扩增和保存。本发明利用枯草芽孢杆菌B29和pUC19质粒构建了枯草芽孢杆菌基因文库，可用于生物领域。
【专利说明】一种枯草芽孢杆菌基因文库的构建方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种微生物基因文库的构建方法。
【背景技术】
[0002]目前真菌病害危害严重，全球范围内每年因真菌引起的作物病害导致粮食减产
1.25亿吨，造成上千亿美元的经济损失。如果能控制真菌病害在大豆、小麦、水稻、玉米和马铃薯这五大粮食作物中的传播，全球每年可以多养活六亿人。化学农药一直是植物病害防治的主要方式，长期无度使用化学农药造成了严重的后果，如:高毒高残留，对人畜的健康造成了危害，对土壤、水体、大气造成了严重污染，破坏了生态平衡；病原菌和害虫抗药性的不断增强，农药的使用量和使用频度不断加大，出现了用药量与病虫害相互递增的恶性循环。
[0003]枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一类能够形成具有较强抗逆性芽孢的革兰氏阳性根际细菌，目前广泛应用于实际农业生产防治作物真菌病害。自1945年Johnson等报道枯草芽孢杆菌分泌抗菌物质以来，人们已从枯草芽孢杆菌的不同菌株中发现多种抗菌物质，包括抗生素及抗菌蛋白。这类次生代谢产物除了对病原真菌、细菌、病毒有抑制作用夕卜，还对芽孢杆菌生物膜形成、诱导植株产生抗病性均有影响。Afima等发现枯草芽孢杆菌所产生的表面活性剂，具有很强的溶血活性，表现出抗病毒、抗肿瘤、抗支原体和一定程度的抗细菌活性。伊枯草菌素是芽孢杆菌代谢产生的一类具有抗真菌活性的两性化合物，属于环脂类化合物，能够强烈抑制真菌生长。TasA是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)在芽孢的形成过程中产生的蛋白质，对革兰氏阳性细菌和阴性细菌均具有广谱抗菌活性。因此，建立枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的基因文库将是筛选功能基因的有效方法，是未来发展枯草芽孢杆菌生物农药，以及生物防治病害的基础和关键。
[0004]但是现有文库构建多采用粘粒或商品化的质粒进行基因工程操作，商品化的文库构建载体价格昂贵，给微生物功能基因的挖掘带来极大弊端。
【发明内容】
[0005]本发明利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B29提供了一种枯草芽孢杆菌基因文库的构建方法。
[0006]枯草芽孢杆菌基因文库按以下步骤构建:
[0007]—、将活化好的枯草芽孢杆菌B29接种至LB固体培养基，30°C过夜培养，然后挑取单菌落转接于LB液体培养基中，再30°C、150r/min条件下培养6?8小时，再提取枯草芽孢杆菌B29基因组DNA ；
[0008]二、培养含有pUC19质粒DNA的大肠杆菌，然后提取pUC19质粒；
[0009]三、基因组不完全酶切及不完全酶切产物回收
[0010]将Sau3A原酶液以100倍稀释后加入不完全酶切反应体系，然后37°C水浴lOmin、再65°C、20min灭活Sau3A活性，用1%琼脂糖凝胶电泳检测；并回收3?5kb的DNA片段，保存备用；
[0011]四、载体去磷酸化
[0012]用BamHI酶酶切pUC19质粒DNA，然后向回收的pUC19质粒DNA大片段中加入10倍体积的去磷酸化缓冲液，5’端突出的DNA，按每100pmol5’磷酸基团加入I个单位的牛小肠碱性磷酸酶，37 V反应30分钟；然后再加入十二烷基磺酸钠至终浓度0.5%、加入pH值为
8.0的EDTA至终浓度5mmol/L、加入蛋白酶K至终浓度50 μ g/ml，混匀后56°C反应30分钟，再10分钟灭活牛小肠碱性磷酸酶，冷却至室温后加入等体积酚/氯仿、氯仿分别抽提一次；加入冰乙醇沉淀，离心，抽干，溶于无菌去离子水，-20°C保存备用；
[0013]五、连接和转化
[0014]将步骤四PUC19去磷酸化质粒大片段和步骤三回收的不完全酶切产物放入混合连接体系，然后16°C连接过夜，再放入50 μ I冰浴上融化的感受态细胞E.coli DH5a中，轻轻混匀后冰浴中放置30min ;之后42°C水浴中热激45s，再立即转移到冰浴中2min，而后加Λ 500 μ I不含抗生素的LB培养基，混匀后置于37°C、200r/min条件下培养Ih ;然后将已转化的感受态细胞E.coli DH5a加到含氨苄抗性的LB琼脂培养基上，倒置平板、置于37°C环境中培养8?12h ；
[0015]六、文库扩增和保存
[0016]将步骤五培养出的菌落用灭菌牙签接种于含20mg/mL氨苄的LB液体中，在37°C、200r/min条件下振荡培养过夜，然后加入等体积已灭菌、浓度为40%的甘油，混匀，置于_80°C冰箱中保存，即完成枯草芽孢杆菌基因文库的构建；
[0017]步骤三中不完全酶切反应体系为20 μ 1，由3.3μ I枯草芽孢杆菌Β29基因组DNA、14 μ I H2O,0.5 μ I稀释Sau3A酶液、0.2 μ I牛血清白蛋白和2 μ I缓冲液组成；
[0018]步骤四中去磷酸化缓冲液pH值为8.0,去磷酸化缓冲液中ZnCl2浓度为1mmol/L、MgCl2 浓度为 10mmol /T,.Tris.HCl 浓度为 100mmol/L ；
[0019]步骤五中混合连接体系总体积为10 μ 1，由1X连接酶bufferly 1、不完全酶切产物I μ 1、pUC19去磷酸化质粒大片段2 μ 1、T4DNA连接酶0.1 μ I和Η205.9 μ I组成。
[0020]枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B29对尖孢镰刀菌、立枯丝核菌、腐霉菌等多种土传病原菌具有强烈的拮抗作用，在微生物防治领域被广泛使用，黑龙江省科学院微生物研究所对该菌株具有多项自主知识产权。
[0021]pUC19质粒是微生物领域常用载体，应用广泛，价格低廉。本发明采用PUC19质粒构建枯草芽孢杆菌基因组文库经济适用；而且PUC19质粒载体适合于DNA片段的克隆、进行DNA测序、对外源基因进行表达等，特别是pUC19质粒的库容量小，分子量过大的DNA片段不能与载体有效连接，因此抗性基因片段大小基本在3Kb以下的枯草芽孢杆菌，其基因文库完全可以利用pUC19质粒进行构建。
[0022]枯草芽孢杆菌基因组大小约为4.0X 106bp，试验中所插入的平均片段长度为5?10kb，按以99.99%的概率筛选到某个外源片段来计算，文库中应含有的克隆数为3684?7368个。本发明共获得11090个粘粒克隆，覆盖了基因组1.5?3.01次，符合文库构建标准。
[0023]本发明为枯草芽孢杆菌抗性基因的筛选，为之后的生物防害药物的生产奠定了基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1是实施例1步骤三琼脂糖凝胶电泳检测结果图，图1中“I”泳道标样为DNAMarker,图1中“2”泳道标样为Sau3AI原酶浓度酶切枯草芽孢杆菌B29基因组DNA产物，图1中“3”泳道标样为Sau3AI酶稀释10倍酶切枯草芽孢杆菌B29基因组DNA产物，图1中“4”泳道标样为Sau3AI酶稀释100倍酶切枯草芽孢杆菌B29基因组DNA产物，图1中“5”泳道标样为Sau3AI酶稀释1000倍酶切枯草芽孢杆菌B29基因组DNA产物。
【具体实施方式】
[0025]本发明技术方案不局限于以下所列举【具体实施方式】，还包括各【具体实施方式】间的任意组合。
[0026]【具体实施方式】一:本实施方式枯草芽孢杆菌基因文库按以下步骤构建:
[0027]—、将活化好的枯草芽孢杆菌B29接种至LB固体培养基，30°C过夜培养，然后挑取单菌落转接于LB液体培养基中，再30°C、150r/min条件下培养6?8小时，再提取枯草芽孢杆菌B29基因组DNA ；
[0028]二、培养含有pUC19质粒DNA的大肠杆菌，然后提取pUC19质粒；
[0029]三、基因组不完全酶切及不完全酶切产物回收
[0030]将Sau3A原酶液以100倍稀释后加入不完全酶切反应体系，然后37°C水浴lOmin、再65°C、20min灭活Sau3A活性，用1%琼脂糖凝胶电泳检测；并回收3?5kb的DNA片段，
保存备用；
[0031]四、载体去磷酸化
[0032]用BamHI酶酶切pUC19质粒DNA，然后向回收的pUC19质粒DNA大片段中加入10倍体积的去磷酸化缓冲液，5’端突出的DNA，按每100pmol5’磷酸基团加入I个单位的牛小肠碱性磷酸酶，37 V反应30分钟；然后再加入十二烷基磺酸钠至终浓度0.5%、加入pH值为
8.0的EDTA至终浓度5mmol/L、加入蛋白酶K至终浓度50 μ g/ml，混匀后56°C反应30分钟，再10分钟灭活牛小肠碱性磷酸酶，冷却至室温后加入等体积酚/氯仿、氯仿分别抽提一次；加入冰乙醇沉淀，离心，抽干，溶于无菌去离子水，-20°C保存备用；
[0033]五、连接和转化
[0034]将步骤四PUC19去磷酸化质粒大片段和步骤三回收的不完全酶切产物放入混合连接体系，然后16°C连接过夜，再放入50 μ I冰浴上融化的感受态细胞E.coli DH5a中，轻轻混匀后冰浴中放置30min ;之后42°C水浴中热激45s，再立即转移到冰浴中2min，而后加Λ 500 μ I不含抗生素的LB培养基，混匀后置于37°C、200r/min条件下培养Ih ;然后将已转化的感受态细胞E.coli DH5a加到含氨苄抗性的LB琼脂培养基上，倒置平板、置于37°C环境中培养8?12h ；
[0035]六、文库扩增和保存
[0036]将步骤五培养出的菌落用灭菌牙签接种于含20mg/mL氨苄的LB液体中，在37°C、200r/min条件下振荡培养过夜，然后加入等体积已灭菌、浓度为40%的甘油，混匀，置于_80°C冰箱中保存，即完成枯草芽孢杆菌基因文库的构建；
[0037]步骤三中不完全酶切反应体系为20 μ 1，由3.3 μ I枯草芽孢杆菌Β29基因组DNA、14 μ I H2O,0.5 μ I稀释Sau3A酶液、0.2 μ I牛血清白蛋白和2 μ I缓冲液组成；
[0038]步骤四中去磷酸化缓冲液pH值为8.0,去磷酸化缓冲液中ZnCl2浓度为1mmol/L、MgCl2 浓度为 10mmol /T,.Tris.HCl 浓度为 100mmol/L ；
[0039]步骤五中混合连接体系总体积为10 μ 1，由1X连接酶bufferly 1、不完全酶切产物(1ng) I μ 1、pUC19去磷酸化质粒大片段(1ng) 2 μ 1、T4DNA连接酶0.1μ I和Η205.9 μ I 组成。
[0040]本实施方式步骤二按基因组提取试剂盒方法提取生防菌基因组DNA ;按质粒试剂盒提取方法进行pUC19质粒提取。
[0041]本实施方式步骤四中pUC19质粒片段经BamHI酶切，获得线性酶切片段，回收的PUC19质粒DNA大片段的分子量为2686bp。
[0042]本实施方式所构建的基因文库主要用于筛选枯草芽孢杆菌的抗性基因，pUC19质粒的库容量小，过大的DNA片段不能与载体有效连接，因此抗性基因片段大小基本在3Kb以下的枯草芽孢杆菌，其基因文库特别适合用PUC19进行构建。另外pUC19质粒在菌株内多以多拷贝形式存在便于保存。由于本实施方式利用PUC19构建的基因文库中基因片段小，也便于用M13通用引物进行测序。
[0043]质粒提取方法获得了完整的pUC19质粒片段，再经BamHI酶切后获得线性酶切片段。
[0044]【具体实施方式】二:本实施方式与【具体实施方式】一的不同点是:步骤六中待步骤五培养的菌落全部长出后用灭菌牙签将每10个菌落接种于ImL含20mg/mL氨苄的LB液体中。其它步骤及参数与实施方式一相同。
[0045]实施例1
[0046]枯草芽孢杆菌基因文库按以下步骤构建:
[0047]一、将活化好的枯草芽孢杆菌B29接种至LB固体培养基，30°C过夜培养，然后挑取单菌落转接于LB液体培养基中，再30°C、150r/min条件下培养6?8小时，再提取枯草芽孢杆菌B29基因组DNA ；
[0048]二、培养含有pUC19质粒DNA的大肠杆菌，然后提取pUC19质粒；
[0049]三、基因组不完全酶切及不完全酶切产物回收
[0050]将Sau3A原酶液以I倍、10倍、100倍和1000倍梯度稀释后分别加入不完全酶切反应体系，然后37°C水浴lOmin、再65°C、20min灭活Sau3A活性，用1%琼脂糖凝胶电泳检测(如图1所示)；并回收3?5kb的DNA片段，保存备用；
[0051]四、载体去磷酸化
[0052]用BamHI酶酶切pUC19质粒DNA，然后向回收的pUC19质粒DNA大片段中加入10倍体积的去磷酸化缓冲液，5’端突出的DNA，按每100pmol5’磷酸基团加入I个单位的牛小肠碱性磷酸酶，37 V反应30分钟；然后再加入十二烷基磺酸钠至终浓度0.5%、加入pH值为
8.0的EDTA至终浓度5mmol/L、加入蛋白酶K至终浓度50 μ g/ml，混匀后56°C反应30分钟，再10分钟灭活牛小肠碱性磷酸酶，冷却至室温后加入等体积酚/氯仿、氯仿分别抽提一次；加入冰乙醇沉淀，离心，抽干，溶于无菌去离子水，-20°C保存备用；
[0053]五、连接和转化
[0054]将步骤四PUC19去磷酸化质粒大片段和步骤三回收的不完全酶切产物放入混合连接体系，然后16°C连接过夜，再放入50 μ I冰浴上融化的感受态细胞E.coli DH5a中，轻轻混匀后冰浴中放置30min ;之后42°C水浴中热激45s，再立即转移到冰浴中2min，而后加Λ 500 μ I不含抗生素的LB培养基，混匀后置于37°C、200r/min条件下培养Ih ;然后将已转化的感受态细胞E.coli DH5a加到含氨苄抗性的LB琼脂培养基上，倒置平板、置于37°C环境中培养8?12h ；
[0055]六、文库扩增和保存
[0056]将步骤五培养出的菌落用灭菌牙签接种于含20mg/mL氨苄的LB液体中，在37°C、200r/min条件下振荡培养过夜，然后加入等体积已灭菌、浓度为40%的甘油，混匀，编号后置于_80°C冰箱中保存，即完成枯草芽孢杆菌基因文库的构建；
[0057]步骤三中不完全酶切反应体系为20 μ 1，由3.3 μ I枯草芽孢杆菌Β29基因组DNA、14 μ I H2O,0.5 μ I稀释Sau3A酶液、0.2 μ I牛血清白蛋白和2 μ I缓冲液组成；
[0058]步骤四中去磷酸化缓冲液pH值为8.0,去磷酸化缓冲液中ZnCl2浓度为1mmol/L、MgCl2 浓度为 10mmol /T,.Tris.HCl 浓度为 100mmol/L ；
[0059]步骤五中混合连接体系总体积为10 μ 1，由1X连接酶bufferly 1、不完全酶切产物(1ng) I μ 1、pUC19去磷酸化质粒大片段(1ng) 2 μ 1、T4DNA连接酶0.1μ I和Η205.9 μ I 组成；
[0060]步骤六中待步骤五培养的菌落全部长出后用灭菌牙签将每10个菌落接种于ImL含20mg/mL氨苄的LB液体中。
[0061]经步骤三过酶切的基因组DNA在泳道内形成弥散条带，弥散条带的宽度，随着限制性内切酶稀释倍数不同呈梯度变化；Sau3A切割基因组作用明显，以原酶液浓度很难控制酶切效果，因此本实施方式中将酶液依次10倍浓度稀释后，其中稀释100倍酶切效果最好，结果有利用进一步文库构建要求。
[0062]根据Clark等的理论公式计算，基因组文库覆盖整个基因组所需的重组克隆数:N=In (1-P)/In (Ι-f)，式中P为期望概率，f为平均插入片断大小与该生物基因组大小之比。枯草芽孢杆菌基因组大小约为4.0X 106bp，试验中所插入的平均片段长度为5?10kb，按以99.99%的概率筛选到某个外源片段来计算，文库中应含有的克隆数为3684?7368个。经过反复清点核查，实施例共获得11090个粘粒克隆。本实施例所获得的11090个粘粒克隆，覆盖了基因组1.5?3.01次，符合文库构建标准。
【权利要求】
1.一种枯草芽孢杆菌基因文库的构建方法，其特征在于枯草芽孢杆菌基因文库按以下步骤构建: 一、将活化好的枯草芽孢杆菌B29接种至LB固体培养基，30°C过夜培养，然后挑取单菌落转接于LB液体培养基中，再30°C、150r/min条件下培养6?8小时，再提取枯草芽孢杆菌B29基因组DNA ； 二、培养含有PUC19质粒DNA的大肠杆菌，然后提取pUC19质粒； 三、基因组不完全酶切及不完全酶切产物回收 将Sau3A原酶液以100倍稀释后加入不完全酶切反应体系，然后37°C水浴lOmin、再65°C、20min灭活Sau3A活性，用1%琼脂糖凝胶电泳检测；并回收3?5kb的DNA片段，保存备用； 四、载体去磷酸化 用BamHI酶酶切pUC19质粒DNA，然后向回收的pUC19质粒DNA大片段中加入10倍体积的去磷酸化缓冲液，5’端突出的DNA，按每100pmol5’磷酸基团加入I个单位的牛小肠碱性磷酸酶，37°C反应30分钟；然后再加入十二烷基磺酸钠至终浓度0.5%、加入pH值为8.0的EDTA至终浓度5mmol/L、加入蛋白酶K至终浓度50 μ g/ml，混匀后56°C反应30分钟，再10分钟灭活牛小肠碱性磷酸酶，冷却至室温后加入等体积酚/氯仿、氯仿分别抽提一次；力口入冰乙醇沉淀，离心，抽干，溶于无菌去离子水，-20°C保存备用； 五、连接和转化 将步骤四PUC19去磷酸化质粒大片段和步骤三回收的不完全酶切产物放入混合连接体系，然后16°C连接过夜，再放入50 μ I冰浴上融化的感受态细胞E.coli DH5a中，轻轻混匀后冰浴中放置30min ;之后42°C水浴中热激45s，再立即转移到冰浴中2min，而后加入500μ I不含抗生素的LB培养基，混匀后置于37°C、200r/min条件下培养Ih ;然后将已转化的感受态细胞E.coli DH5a加到含氨苄抗性的LB琼脂培养基上，倒置平板、置于37°C环境中培养8?12h ； 六、文库扩增和保存 将步骤五培养出的菌落用灭菌牙签接种于含20mg/mL氨苄的LB液体中，在37°C、200r/min条件下振荡培养过夜，然后加入等体积已灭菌、浓度为40%的甘油，混匀，置于_80°C冰箱中保存，即完成枯草芽孢杆菌基因文库的构建； 步骤三中不完全酶切反应体系为20 μ 1，由3.3 μ I枯草芽孢杆菌B29基因组DNA、14y IH2O,0.5 μ I稀释Sau3A酶液、0.2 μ I牛血清白蛋白和2 μ I缓冲液组成； 步骤四中去磷酸化缓冲液pH值为8.0，去磷酸化缓冲液中ZnCl2浓度为lOmmol/L、MgCl2 浓度为 10mmol /I,、Tris.HCl 浓度为 100mmol/L ； 步骤五中混合连接体系总体积为10 μ 1，由10Χ连接酶bufferly 1、不完全酶切产物I μ 1、pUC19去磷酸化质粒大片段2 μ 1、T4DNA连接酶0.1 μ I和Η205.9 μ I组成。
2.根据权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌基因文库的构建方法，其特征在于步骤六中待步骤五培养的菌落全部长出后用灭菌牙签将每10个菌落接种于ImL含20mg/mL氨苄的LB液体中。
【文档编号】C12N15/31GK104233475SQ201310413350
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年9月12日 优先权日:2013年9月12日
【发明者】赵晓宇, 孟立强, 曹旭, 张淑梅, 李晶, 王佳龙, 陈静宇, 姜威 申请人:黑龙江省科学院微生物研究所