促进微藻生长的基因及促进微藻生长的方法
【专利摘要】本案提供促进微藻生长的基因及促进微藻生长的方法。更具体地，本案提供促进微藻生长的新颖核苷酸序列，选自SEQ?ID?NO.1、SEQ?ID?NO.2、SEQ?ID?NO.3、及前述一种以上的组合，以及包含该核苷酸序列的表达载体与包含该表达载体的微藻。
【专利说明】促进微藻生长的基因及促进微藻生长的方法
【技术领域】
[0001]本发明关于一种促进微藻生长的核苷酸序列，以及包含该核苷酸序列的表达载体与包含该表达载体的微藻。
【背景技术】
[0002]为了抑制全球暖化的问题，世界各国无不积极投入温室气体减量之相关议题。在生质能源的料源中，微藻类能将二氧化碳吸收固定，并将太阳能转换成化学能，微藻的生物量，除了含有油或淀粉可被用来制造或转化为生物燃料之外，也含有高附加价值的产物，例如长链未饱和脂肪酸、天然色素以及维他命等。相较于植物，微藻具有高光合效率、较短的生长周期且生长速率快等特性，并且生长环境不受地域之影响。
【发明内容】
[0003]为了进一步提升微藻的生产力及缩短生产时程以提高微藻的产业利用性，发明人等积极地研究促进微藻生长的相关基因群及其特性，进而完成本案发明。
[0004]本发明一实施形态，提供一种促进微藻生长的核苷酸序列，选自由下列所述核苷酸序列所组成的群组:SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、及前述一种以上的组合。
[0005]本发明另一实施形态，提供一种表达载体，包括SEQ ID N0.K SEQ ID N0.2、SEQID N0.3、或前述一种以上的组合的促进微藻生长的核苷酸序列，以及与前述核苷酸序列操作性连结(operable linked)的启动子。
[0006]本发明的另一实施形态，提供一种转基因微藻，包含上述的表达载体。
[0007]本发明的再一实施形态，提供一种促进微藻生长的方法，包括将上述表达载体转基因于微藻中，以及培养该微藻使该表达载体表达。
【专利附图】
【附图说明】
[0008]图1为本发明一实施型态之质粒示意图。
[0009]图2显示含ictB、AtHSDl及VHb的转基因微藻各别的基因表达(Λ Ct)。
[0010]图3显示含ictB、AtHSDl、VHb的转基因微藻及野生型绿藻各别的有效量子产率。
[0011]图4显示含ictB、AtHSDl、VHb的转基因微藻及野生型绿藻各别的电子传递速率。
【具体实施方式】
[0012]本发明一实施形态，提供新颖的核苷酸序列，包括SEQ ID N0.K SEQ ID N0.2及SEQ ID N0.3。本发明所述的核苷酸序列分别来自已知的细菌性血红蛋白(Vitreoscillahemoglobin; VHb) (SEQ ID N0.16)、果糖-1，6/景天庚酮糖-1，7-二憐酸酶(fructose-1, 6/sedoheptulose-1, 7-bisphosphatase; ictB) (SEQ ID N0.17)、及羟基类固醇脱氧酶基因(hydroxysteroid dehydrogenase gene;AtHSDl)(SEQ ID N0.18)的核苷酸序列。已知细菌性血红蛋白(VHb)及果糖-1,6/景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶(ictB)在植物中可提升氧气的代谢速率、促进光合效率(Hoy A J, Robinson H, Kakar S, SmaggheJB, Hargrove S.2007.Plant Hemoglobins:A Molecular Fossil Recordfor the Evolutionof Oxygen Transport.Journal of Molecular Biology371, 168-179.;MiyagawaY,Tamoi M, Shigeoka S2001.0verexpression of cyanobacterial fructose-1, 6/sedoheptulose-1, 7—bisphosphate phosphatase in tobacco enhances photosynthesisand growth.Nature Biotechl9, 965-969.),羟基类固醇脱氧酶基因(AtHSDl)可提升植物的生物质量及种子产率(Li F., Asami T., Wu X.z., Tsang ff.T.and Cutler J.2007.APutative Hydroxysteroid Dehydrogenase Involved in Regulating Plant Growth andDevelopment.PlantPhysiologyl45:87-97.)。然而，这些蛋白并未存在于微藻体内。
[0013]为了促进微藻生长，发明人等基于小球藻(Chlorella)的遗传密码，将上述核苷酸序列优化编码，得到适合于微藻体内表达的核苷酸序列，即本案SEQ ID NOs.1~3.[0014]经优化编码的核苷酸序列SEQ ID N0.1表达细菌性血红蛋白(VHb)，如SEQ IDN0.19所示的氨基酸序列。核苷酸序列SEQ ID N0.2表达果糖-1，6/景天庚酮糖-1，7- 二磷酸酶(ictB)，如SEQ ID N0.20所示的氨基酸序列。核苷酸序列SEQ ID N0.3表达羟基类固醇脱氢酶基因(AtHSDl)，如SEQ ID N0.21所示的氨基酸序列。
[0015]根据本发明所揭示的核苷酸序列，经过适当的表达载体转基因到微藻体内而表现时，可有效地促进微藻的生长。
[0016]本发明的另一实施形态，提供包含上述促进微藻生长的表达载体。本发明所述的表达载体，除了包括上述的核苷酸序列以外，可还包含与该核苷酸序列操作性连结(operable linked)的启动子(promoter)、与该核苷酸序列及该启动子构成表达盒(expression cassette)的筛选标记、以及位于该表达盒两侧的同源重组DNA片段(homologous recombinant DNA fragment)。
[0017]本发明所述的启动子为基因表达时容许RNA聚合酶连接的核苷酸序列，是转录作用(transcription)的开始。本案的启动子设计，可考量欲表达的核苷酸序列及表达载体的性质，采用单启动子、双启动子或多启动子的模式，以提高欲表达基因的表达量。在本发明中，可使用的启动子包括psbA、腺嘌呤甲基转移酶(AMT)启动子、花椰菜叶病毒(CaMV) 35S启动子、1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小单位(RBCs)启动子、SV40、或前述的组合，但不限于此。
[0018]本发明所述的筛选标记包括用于特定基因的克隆及报导的基因，例如卡那霉素(Kanamycin)抗生素基因、遗传霉素(Geneticin)抗生素基因、氨节青霉素(Ampicillin)抗生素基因、博莱霉素抗生素基因(Zeocin)、潮霉素抗生素基因(Hygromycin)、编码红色荧光蛋白(DsRed)基因、编码增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因、编码蓝色荧光蛋白(BFP)基因、或类似的基因。筛选标记可根据表达载体的特性及克隆的基因性质适当设计，没有特别的限制。
[0019]本发明所述的表达盒至少由上述的核苷酸序列、启动子、筛选标记所构成，以表达本案所述促进微藻生长的核苷酸序列。但表达盒也可视需要地包含可读框(open readingframe)、上述核苷酸序列表达所需的核苷酸序列、或转化于宿主细胞所需的核苷酸序列等。 [0020]本发明所述的同源重组DNA片段表示可与同源DNA序列配对进行交换之序列片段，透过同源交换的方式，使得欲表达的核苷酸序列得以嵌入宿主细胞的遗传物质中而表达。可与植物细胞的遗传物质同源交换的序列，例如T-DNA序列中的左端(left border ；LB)及右端(right border ;RB),但没有特别限定。同源重组DNA片段可根据表达载体或宿主细胞的特性等条件以习知的DNA重组技术适当设计、合成。
[0021]为了基因的表达，本发明所述的表达载体可进一步包括多克隆位点(multiplecloning site ；MCS);调控序列(regulatory sequence),例如增强子(enhancer);报导基因(reporter gene),例如编码突光蛋白质的核苷酸序列等。
[0022]本发明一实施例如图1所示,此实施例所建构的表达载体包括由欲表达的核苷酸序列、启动子及作为筛选标记的遗传霉素抗生素基因(Geneticin)所构成的表达盒、位于表达盒两侧的同源重组DNA (LB、RB)、RNA复制起始点(IncW or1、pMBlori)、以及另一个筛选标记氨苄青霉素抗生素基因(AmpK)，其中，启动子与欲表达的基因具有多克隆位点(MCS)，以克隆于该表达载体内。
[0023]本发明另一实施形态为具有上述表达载体的转基因微藻。由于表达载体具有上述促进微藻生长的核苷酸序列并于转基因微藻体中表现，因此可促进该转基因微藻的生长，提高该微藻的生产力。
[0024]本发明再一实施形态，提供一种促进微藻生长的方法，包含使上述表达载体转基因于微藻中，以及培养该转基因微藻以表达上述促进微藻生长的核苷酸序列，藉此达到促进微藻生长的目的。将表达载体转基因于微藻的方法，可使用电穿孔(electroporation)、转染法(transfection)、脂转染(Iipofection)、或类似的方法。
[0025]培养微藻的培养基组成、培养条件等没有特别限制，可依转基因微藻的生长特性来决定，例如可使用习知的TAP培养基、F/2培养基等，或者视需要改良培养基组成。
[0026]本案所述之“微·藻”泛指微型生物，更具体地说，包括小球藻(Chlorella sp.)、微星藻(Micractinium sp.)、群星藻(Actinastrum sp.)、空星藻(Didymogenes sp.)、杜氏藻(Dunaliella sp.)、拟球藻(Nannochloropsis sp.)、雨生血红藻(Haematococcus sp.)、栅藻(Scenedesmussp.)、或这些藻类的组合。
[0027]本发明之具体实施详细说明如下，然而以下的实施例仅用于进一步揭露本发明之技术内容，不应藉以限制本案的发明范畴。
[0028]实施例
[0029][实施例1]质粒的建构及微藻的转基因
[0030]基因的选择与基因全合成
[0031]选取果糖-1，6/景天庚酮糖-1，7- 二磷酸酶(ictB) (SEQ ID N0.17)、血红蛋白基因(VHb) (SEQ ID N0.16)及羟基类固醇脱氢酶基因(AtHSDl) (SEQ ID N0.18)，以小球藻(Chlorella)常用的遗传密码为主，进行基因全编码，得到相同于小球藻(Chlorella)的氨基酸序列，以增加ictB、VHb及AtHSDl基因于藻类中之辨识度。
[0032]基因全编码合成具体实施方法，分别根据VHb、ictB、AtHSDl的基因序列利用剪接重叠延伸聚合酶链式反应(Splicing by overlapping extension polymerase chainreaction, S0E-PCR)的方式，每次分段各合成长度50个核苷酸的引物，再将前20个核酸与前段重迭，后20个核酸与后段重迭，重复此步骤数次，最终分别利用合成整段的VHb、ictB、AtHSDl 基因(SEQ ID NO s.1~3)的顺向与反向引物(VHb, SEQ ID N0.10-11) (ictB, SEQ IDN0.12-13) (AtHSDl, SEQ ID N0.14-15)，进行聚合酶链式反应(PCR)，利用DNA体外扩增技术，在体外利用模板DNA、特定的寡聚核苷酸引物和DNA聚合酶，通过DNA变性、复性和延伸过程合成一条互补的DNA链。反复重复这一过程，模板DNA就可得到大量扩增，即可将全长的基因全部包含在内，完成ictB、VHb及AtHSDl等基因全合成。
[0033]质粒的律构
[0034]取卡那霉素(Kanamycin)抗生素基因，以I~5 μ g/ml的pPIC9K (Novagen)作为模板，进行聚合酶链式反应(PCR) (PCR条件:95°C /30sec ；56°C /30sec ；72°C /lmin ;循环次数 30 次(GeneAmp PCR System9700))。
[0035]另一方面，将pUC195y g/ml与上述扩增的卡那霉素抗生素基因2~10 μ g/ml分别与KasI限制酶(New England Biolabs, NEB) IU混合反应6小时后，将经KasI限制酶切割的pUC19及卡那霉素抗生素基因混合5~10分钟，使卡那霉素抗生素基因接合至PUC19的KasI限制酶切位上。
[0036]之后，根据文献(Lei Young and Qihan Dong, Two-step total gene synthesismethod, Nucleic Acids Research, 2004, Vol.32, N0.7p59)以基因合成法合成土壤杆菌属的种(Agrobacterim sp.)的基因复制起点IncW ori基因2~10 μ g/ml。将IncW ori基因及上述接合卡那霉素抗生素基因的PUC19分别以DraII限制酶切割后混合，使IncW ori基因接合至上述接合卡那霉素抗生素基因的PUC19的DraII限制酶切位上。
[0037]之后将基因合成法合成腺嘌呤甲基转移酶(AMT)启动子(2_10yg/ml)与上述pUC19质粒5 μ g/ml与NarI限制酶混合5~10分钟,使合成启动子接合至上述pUC19质粒。
[0038]之后将基因合成法合成左端(left border;LB)或右端(right border;RB)的序列。之后，使LB或RB的序列2-10μ g与上述重组pUC195y g以IU的NdeI或AlfIII限制酶切割，使该LB或RB的序列接合至上述pUC19，`完成如图1所示之表现质粒之构筑。
[0039]之后针对遗传密码子优化基因VHb (SEQ ID N0.1)、ictB (SEQ ID N0.2)、及AtHSDl (SEQ ID N0.3)，分别利用EcoRI限切酶切割，以及下述之PCR反应条件，完成基因过表达质粒之构筑。
[0040]PCR反应溶液
【权利要求】
1.一种促进微藻生长的核苷酸序列，其为选自由下列所述核苷酸序列所组成的群组:SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、及前述一种以上的组合。
2.—种表达载体,包括: 促进微藻生长的核苷酸序列，其选自由下列所述核苷酸序列所组成的群组:SEQ IDN0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、及前述一种以上的组合；及 与前述核苷酸序列操作性连结的启动子。
3.如权利要求2所述的表达载体,还包括筛选标记,与前述核苷酸序列及启动子构成表达盒，以及位于上述表达盒两侧的同源重组的DNA片段。
4.如权利要求2所述的表达载体，其中该启动子包括psbA、腺嘌呤甲基转移酶(AMT)启动子、花椰菜叶病毒(CaMV) 35S启动子、1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小单位(RBCs)启动子、SV40、或前述的组合。
5.一种转基因微藻，包括如权利要求2~4任一项所述的表达载体。
6.—种促进微藻生长的方法,包括: 将一表达载体转基因于微藻中，以及培养该微藻使该表达载体表达，其中，该表达载体包括选自由下列所述核苷酸序列所组成的群组中的核苷酸序列:SEQ ID N0.1、SEQ IDN0.2、SEQ ID N0.3、及前述一种以上的组合。
7.如权利要求6所述的促进微藻生长的方法，其中，该表达载体还包括与该核苷酸序列操作性连结的启动子。·
8.如权利要求7所述的促进微藻生长的方法，其中，该启动子包括psbA、腺嘌呤甲基转移酶(AMT)启动子、花椰菜叶病毒(CaMV) 35S启动子、1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小单位(RBCs)启动子、SV40、或前述的组合。
9.如权利要求61任一项所述的促进微藻生长的方法，其中，该表达载体还包括筛选标记及至少两个同源重组的DNA片段，该筛选标记与前述核苷酸序列及启动子构成表达盒，该同源重组的DNA片段位于上述表达盒的两侧。
10.如权利要求6所述的促进微藻生长的方法,其中，该微藻包括小球藻(Chlorellasp.)、微星藻(Micractinium sp.)、群星藻(Actinastrum sp.)、空星藻(Didymogenessp.)、杜氏藻(Dunaliella sp.)、拟球藻(Nannochloropsis sp.)、雨生血红藻(Haematococcus sp.)、棚藻(Scenedesmus sp.)。
【文档编号】C12N1/13GK103849628SQ201210506246
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2012年11月30日 优先权日:2012年11月30日
【发明者】简良荣, 谢欣如 申请人:财团法人工业技术研究院