人羊膜间充质干细胞的分离方法
【专利摘要】本发明提供一种酶消化法联合表皮生长因子(EGF)培养人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)的过程中的hAMSCs的分离方法，所述培养过程包括如下步骤：hAMSCs的分离，hAMSCs的原代培养，hAMSCs的传代培养与扩增，hAMSCs的冻存和复苏，以及hAMSCs细胞免疫表型的检测。本发明采用胰蛋白酶和胶原酶分步多次消化来收集羊膜细胞，通过加入4ng/mlEGF，将贴壁培养和消化时间控制相结合，获得纯度和活性较高人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)。本发明的酶消化法联合联合EGF具有操作简单，快速实用等优点，是一种较为有效的分离纯化hAMSCs的方法。
【专利说明】人羊膜间充质干细胞的分离方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】的一种培养人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)的方法，特别涉及一种采用酶消化法联合表皮生长因子(EGF)来培养人羊膜间充质干细胞的过程中的人羊膜间充质干细胞的分离方法。
【背景技术】
[0002]正常人羊膜组织结构分为上皮细胞层、基底膜、致密层、纤维细胞层及海绵层，其中人羊膜间充质干细胞(human amnion membranemesenchymal stem cells, hAMSCs)位于羊膜的最内层，是在受精后第8天从外胚叶发育而来，使其可能维持原肠胚形成前期胚胎干细胞的可塑性，拥有更大的多向分化潜能，hAMSCs理论上可以分化成各种组织细胞，同时因羊膜获得方便且回避了伦理学争议，有潜力成为未来临床应用的干细胞来源之一。hAMSCs原代培养分为组织块培养和酶消化法培养，组织块培养由于不是每个组织块都能培养成功，且容易混杂有成纤维细胞污染，培养形成单层的时间较长，不利于快速大量获取细胞，难以满足干细胞研究的需要；酶消化法鉴于羊膜组织结构致密，结构致密，用酶一次消化时间过长对细胞损伤较大，时间太短得到的细胞数量太少。因此有必要建立一种在体外分离、纯化并大量扩增和诱导分化hAMSCs的方法。
【发明内容】
[0003]为建立一种在体外分离、纯化并大量扩增和诱导分化hAMSCs的方法，本发明提供一种采用酶消化法联合表皮生长因子(EGF)培养人羊膜间充质干细胞的方法，通过采用胰蛋白酶和胶原酶分步多次消化来收集羊膜细胞，此时的羊膜细胞是上皮细胞、间质干细胞、成纤维细胞等多种细胞的混合物，加入表皮生长因子(EGF)，将贴壁培养和消化时间控制相结合，可获得纯度和活性较高人羊膜间充质干细胞。
[0004]具体的，本发明的酶消化法联合EGF培养人羊膜间充质干细胞的方法包括如下步骤:hAMSCs的分离，hAMSCs的原代培养，hAMSCs的传代培养与扩增，hAMSCs的冻存和复苏，以及hAMSCs细胞免疫表型的检测。
[0005]其中，所述hAMSCs的分离步骤包括:无菌条件下取产后弃置的新鲜胎盘，采用机械法将羊膜从胎盘组织上剥离，用D-Hanks液冲洗数次以清除残留血迹，将漂洗后的羊膜用眼科剪剪成约1mm3碎块，加入胰蛋白酶37°C消化10分钟；加入含小牛血清的DMEM终止消化，并轻柔吹打混匀后200目细胞筛过滤；过滤后的羊膜组织中加入II型胶原酶消化液， 37°C消化30分钟；加入含小牛血清的DMEM终止消化，轻柔吹打混匀后200目细胞筛过滤，收集细胞；1000转/分钟离心5分钟；台盼兰染色计数活细胞，调整细胞密度为IX 106/ml，接种至培养瓶，加入含bFGF和FBS的DMEM培养基；置37°C、饱和湿度、体积分数5%的CO2培养箱内培养，倒置相差显微镜下每日观察原代和传代细胞的生长情况和形态特征，隔天换液1次，并摄片记录；待细胞汇合度达80%后，用0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA溶液于 37°C消化2-3分钟，加入培养基终止胰蛋白酶作用，1000转/分钟离心5分钟，弃上清，细胞沉淀用培养基重新悬浮后，以IXlOVml的细胞密度传代；传代过程中，隔日换液I次，待细胞长满70%瓶底重复以上步骤。
[0006]所述hAMSCs的原代培养步骤包括:将羊膜细胞悬液移入离心管，配平，2000rpm离心15分钟，弃上清，收集细胞；将收集的细胞用PBS吹打成均匀悬液，1500转/分钟进行15分钟洗涤，收集细胞；接种细胞前吸取FBS加入细胞培养瓶，置37°C，5% CO2，饱和湿度培养箱孵育30分钟，对培养瓶进行包被；弃包被液，用含20% FBS,4ng/ml表皮生长因子(EGF)的DMEM/F12完全培养液重悬消化分离所得细胞，吹打均匀，计数细胞；调整细胞浓度为1.0XlO6细胞/ml，接种于包被后的细胞培养瓶中，置于37°C，5% CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养，相差显微镜动态观察；培养4-5天后全量换液,弃去未贴壁细胞，以后每3-4天半量换液一次。观察细胞贴壁生长至80-90%汇合时，以0.25%胰蛋白酶-0.01% EDTA消化，所得细胞为原代细胞。
[0007]所述hAMSCs的传代培养与扩增步骤包括:观察原代hAMSCs细胞贴壁生长至80-90%汇合时，吸弃培养瓶内原有培养液，吸取PBS缓冲液轻轻加入培养瓶内洗涤，弃去洗液；加入0.25%胰蛋白酶-0.01% EDTA消化液浸漫覆盖瓶底，倒置显微镜下观察，见细胞间隙增大，胞质回缩，摇动吹打后见细胞呈圆形漂起时加入FBS中止胰酶消化；加入PBS反复吹打冲洗，在室温下900转/分钟离心10分钟；弃去上清液，加入DMEM/F12重悬细胞，按1: 2-1: 3比例传代培养；培养体系为20% FBS,4ng/ml EGF的DMEM/F12完全培养液15ml/瓶；置37°C，5% CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养，计为第I代hAMSCs，待细胞生长至80-90%汇合时，重复上述操作进行多代细胞培养扩增。
[0008]所述hAMSCs细胞免疫表型的检测步骤包括:取培养第2或第3代细胞，首先用胰蛋白酶消化后，然后用含小牛血清白蛋白的PBS调整细胞浓度至IXlOVml ;分别加入鼠抗人单克隆抗体，置4°C孵育半小时，PBS洗I次，进行流式细胞仪检测分析。
[0009]优选的，所述的hAMSCs的冻存和复`苏步骤中，所述的hAMSCs的冻存操作如下:取出所需试剂，配制冻存液，每个冻存管中加入人AB血清350ul和DMS0150ul，置于冰上预冷；取出需要冻存的细胞，吸弃培养瓶中原有的培养基，用PBS缓冲液轻轻清洗后，吸弃洗液；每瓶中加入胰酶-EDTA工作液，浸漫覆盖瓶底，放入37°C孵箱中2-3分钟；在倒置显微镜下观察见细胞呈圆形飘起时，加入胎牛血清中止胰蛋白酶消化；每瓶中加入完全培养液，反复吹打，用微量加样枪吸出少许用做细胞计数；将细胞悬液移入离心管中，1000转/分钟离心5分钟，离心结束，吸弃上清；向离心管中加入人AB血清，充分混匀，待用；将上述脐带源间充质干细胞悬液加入到冻存管中，封盖，震荡，充分混匀，放置在4°C冰箱30分钟后迅速移入到-80°C，24小时后，移入液氮中，进行长期保存。
[0010]再优选的，所述的hAMSCs的冻存和复苏步骤中，所述hAMSCs的复苏的操作包括:取出所需试剂，平衡至室温，准备370C水浴备用；从液氮中迅速取出需要复苏的冻存管，立即于37°C水浴中迅速融化；用酒精棉球擦拭冻存管盖周围，旋开管盖；在超净台内将冻存管内的细胞移入到无菌离心管内，缓慢逐滴加入DMEM/F12培养液，轻轻混匀；1000转/分钟离心5分钟，弃上清；加入DMEM/F12完全培养液重悬细胞后接种，每个培养瓶中补加新的完全培养液；置5% C02，饱和湿度，37°C培养箱重新培养。
[0011]本发明的酶消化法联合联合EGF，将贴壁培养和消化时间控制相结合，具有操作简单快速，实用稳定等优点，不失为一种较为有效的分离纯化方法。【专利附图】
【附图说明】
[0012]通过下面结合附图的详细描述，本发明前述的和其他的目的、特征和优点将变得显而易见。其中:
[0013]图1所示为本发明的酶消化法联合表皮生长因子(EGF)培养人羊膜间充质干细胞的过程的步骤流程图；
[0014]图2所示为酶消化法联合EGF培养人羊膜间充质干细胞的过程中人羊膜间充质干细胞的分离方法步骤流程图。
【具体实施方式】
[0015]如图1所示，本发明的一实施例的酶消化法联合表皮生长因子(EGF)培养人羊膜间充质干细胞的方法包括如下步骤:
[0016]S1、人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)的分离:
[0017]参见图2所示，本步骤具体为:无菌条件下取产后弃置的新鲜胎盘(经家属同意)，采用机械法将羊膜从胎盘组织上剥离，用D-Hank’s液冲洗数次以清除残留血迹，将漂洗后的羊膜用眼科剪剪成约lmm3碎块，加入2.5g/L胰蛋白酶370C消化IOmin ;加入含5%小牛血清的DMEM终止消化，并轻柔吹打混匀后200目细胞筛过滤；过滤后的羊膜组织中加入1.0g/L II型胶原酶消化液，370C消化0.5h ;加入含5%小牛血清的DMEM终止消化，轻柔吹打混匀后200目细胞筛过滤，收集细胞；1000r/min，离心5min ;台盼兰染色计数活细胞，调整细胞密度为1父106/1111，接种至250112培养瓶，加入含10ng/ml bFGF和10% FBS的DMEM培养基；置370C、饱和湿度、体积分数5%的C02培养箱内培养，倒置相差显微镜下每日观察原代和传代细胞的生长情况和形态特征，隔天换液I次，并摄片记录；待细胞汇合度达80 %后，用0.25 %胰蛋白`酶-0.02 % EDTA溶液于37°C消化2_3min，加入培养基终止胰蛋白酶作用，1000r/min,离心5min,弃上清,细胞沉淀用培养基重新悬浮后，以IX 107/ml的细胞密度传代。传代过程中，隔日换液I次，待细胞长满70%瓶底重复以上步骤。
[0018]S2、hAMSCs 的原代培养:
[0019]将羊膜细胞悬液移入离心管，配平，2000rpmX15分钟离心，弃上清，收集细胞；将收集的细胞用0.01M PBS30mL吹打成均匀悬液，1500rpmX15分钟洗涤2次，收集细胞；接种细胞前吸取FBS3mL加入T75cm2型细胞培养瓶，置37°C ,5% CO2，饱和湿度培养箱孵育30分钟，对培养瓶进行包被；弃包被液，用含20%FBS,4ng/ml表皮生长因子(epidermal growthfactor, EGF)的DMEM/F12完全培养液重悬消化分离所得细胞，吹打均匀，计数细胞；调整细胞浓度为1.0X IO6细胞/ml，接种于包被后的T75cm2型细胞培养瓶中，置于37°C，5% CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养，相差显微镜动态观察；培养4-5天后全量换液，弃去未贴壁细胞，以后每3-4天半量换液一次。观察细胞贴壁生长至80-90%汇合时，以0.25%胰蛋白酶-0.01% EDTA消化，所得细胞为原代细胞。
[0020]首先应用高密度贴壁细胞培养I XlOVml，原代细胞聚集成团块状，团块中可形成少量克隆球，但克隆球生长缓慢。原代培养24-48小时后，可见细胞从组织块中爬出，围绕在组织块周围，呈放射状向外生长。UC-MSC呈贴壁生长，悬浮细胞可经过多次换液去除，细胞逐渐得以纯化。培养5d后后吸出部分细胞改为I X 106/ml培养，克隆球形成和生长明显增快。首次换液发现，每高倍镜视野(倒置显微镜X 100倍)下大约有200个细胞贴壁，其中处于有丝分裂期的极强折光性大细胞平均大约有5个，少数散在的贴壁细胞出现分化现象；培养I周时倒置显微镜可见贴壁细胞呈梭形、多角形，增长速度较快。2周时极强折光性大细胞数量增多，至每高倍视野下大约有20个，成为形态相对均一的梭形细胞，呈放射状排列生长或旋涡状生长，多数贴壁未分裂的原代细胞和分化细胞开始脱落死亡，此时经多次换液去除悬浮细胞，细胞密度由IXlOVml降至IXioVml左右，无细胞聚集现象；第2_3周可形成80%融合的的单层贴壁细胞层，3周时已经有极强折光性大细胞开始形成紧密小克隆球(大约5~20个细胞组成，直径约40~60 μ m) ;4周时已有大量大小不等的克隆球形成，许多大克隆球(直径大于200 μ m)已脱壁悬浮生长。
[0021 ] S3、hAMSCs的传代培养与扩增:
[0022]观察原代hAMSCs细胞贴壁生长至80-90 %汇合时，吸弃培养瓶内原有培养液，吸取IOml 0.01M PBS缓冲液轻轻加入培养瓶内洗涤，弃去洗液；加入0.25%胰蛋白酶-0.01% EDTA消化液1.0ml，浸漫覆盖瓶底，倒置显微镜下观察，见细胞间隙增大，胞质回缩，摇动吹打后见细胞呈圆形漂起；加入1.0ml FBS中止胰酶消化；加入IOml0.01MPBS反复吹打冲洗，在室温下900rpmX 10分钟离心；弃去上清液，加入IOml DMEM/F12重悬细胞，按1: 2-1: 3比例传代培养；培养体系为20% FBS，4ng/ml EGF的DMEM/F12完全培养液15ml/瓶。置37°C，5% CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养，计为第I代(passagel，Pl)hAMSCs，待细胞生长至80-90%汇合时，重复上述操作进行P2、P3、P4…代细胞培养扩增。
[0023]当细胞贴壁生长至80-90%融合时，用0.25%胰蛋白酶-0.01% EDTA消化，按1:2-1: 3的比例传代。传代细胞于接种后3-6小时迅速贴壁，最初为短粗的梭形或卵圆形。在接种的第2天，细胞伸展为长梭形或多角状，体积较大，细胞均匀分布。传代后细胞增殖速度明显加快，在接种后第2-3天增长趋势最为显著，数量明显增多，生长较均匀一致。传代后3-4天时，细胞 长满培养瓶底，融合成片状，低倍镜下细胞排列紧密，整齐有序，出现漩涡样结构，杂质细胞已明显少见。
[0024]S4、hAMSCs的冻存和复苏:
[0025]其中，所述的hAMSCs的冻存操作如下:
[0026]I)取出所需试剂，配制冻存液。每个冻存管中加入人AB血清350ul和DMS0150ul，置于冰上预冷。在冻存管上详细标记细胞情况，如种类、代数以及冻存时间等；
[0027]2)取出需要冻存的细胞，吸弃培养瓶中原有的培养基。用20ml PBS缓冲液轻轻清洗两次后，吸弃洗液:
[0028]3)每瓶中加入0.25%胰酶-0.04% EDTA工作液1ml，浸漫覆盖瓶底，放入37°C孵箱中2-3分钟；
[0029]4)在倒置显微镜下观察见细胞呈圆形飘起时，加入1.0ml胎牛血清中止胰蛋白酶消化。如果细胞不易飘起，可用手掌轻轻拍打培养瓶确保细胞完全消化下来；
[0030]5)每瓶中加入完全培养液20ml，反复吹打。用微量加样枪吸出少许用做细胞计数。
[0031]6)将细胞悬液移入50ml离心管中，离心1000rpmX5分钟，离心结束，吸弃上清。
[0032]7)向离心管中加入1.0ml人AB血清，充分混匀，待用。
[0033]8)将上述脐带源间充质干细胞悬液加入到冻存管中，封盖，震荡，充分混匀，放置在4°C冰箱30分钟后迅速移入到_80°C。
[0034]9)24小时后，移入液氮中，进行长期保存。
[0035]所述hAMSCs的复苏的操作包括:
[0036]I)取出所需试剂，平衡至室温。准备370C水浴备用；
[0037]2)从液氮中迅速取出需要复苏的冻存管，确认后立即于37°C水浴中迅速融化；
[0038]3)用酒精棉球擦拭冻存管盖周围，旋开管盖； [0039]4)在超净台内将冻存管内的细胞移入到50ml无菌离心管内。缓慢逐滴加入20mlDMEM/F12培养液，轻轻混匀，尽量不要产生气泡；
[0040]5)离心，1000rpmX 5分钟，弃上清；
[0041]6)加入IOml DMEM/F12完全培养液重悬细胞后接种，每个培养瓶中补加新的完全培养液至15ml。置5% C02，饱和湿度，37°C培养箱重新培养；
[0042]7)在培养瓶上标记细胞相关信息，如种类、代数以及复苏时间等。
[0043]S5、hAMSCs细胞免疫表型的检测:
[0044]取培养第2或第3代细胞，首先用0.25%的胰蛋白酶消化后，然后用含1%小牛血清白蛋白的PBS调整细胞浓度至I X 107/ml。分别加入下列鼠抗人单克隆抗体:⑶34-FITC、CD45-PE、CD19-FITC、CD29-FITC、CD44-PE、CD105-FITC、CD106-FITC、HLA-DR-FITC，置 4°C孵育半小时，PBS洗I次，进行流式细胞仪检测分析。流式细胞仪检测显示，hAMSCs表达CD29、CD44 和 CD105,不表达 CD34、CD45、CD19、HLA-DR 和 CD106。。
[0045]本实施例采用采用胰蛋白酶和胶原酶分步多次消化来收集羊膜细胞，此时的羊膜细胞是上皮细胞、间质干细胞、成纤维细胞等多种细胞的混合物，但在加入4ng/ml表皮生长因子(EGF)，将贴壁培养和消化时间控制相结合，获得纯度和活性较高人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)。根据hAMSCs贴壁生长的特点，培养2_3天后可见hAMSCs基本贴壁，因此在原代培养末期即可以获得均一性较好的hAMSCs。同时发现，尽管使用了贴壁密度梯度法，在原代培养体系中仍然存在一些造血系细胞，这些细胞在加入4ng/ml EGF后大部分不能贴壁，随换液而被去除，hAMSCs具有成纤维细胞生长的特点，体积小，呈梭形，核浆比大，体外增殖迅速，生长状态稳定，而且随着换液次数和传代次数的不断增加，细胞纯度不断增加，均质性不断提高，细胞呈均匀有序的成纤维细胞样，随着传代次数的增加，细胞的增殖速度未见明显下降，细胞的均一性经过传代培养明显提高。酶消化法联合联合EGF，将贴壁培养和消化时间控制相结合，具有操作简单快速，实用稳定等优点，不失为一种较为有效的分离纯化方法。
[0046]本发明并不局限于所述的实施例，本领域的技术人员在不脱离本发明的精神即公开范围内，仍可作一些修正或改变，故本发明的权利保护范围以权利要求书限定的范围为准。
【权利要求】
1.一种人羊膜间充质干细胞的分离方法，其应用于酶消化法联合EGF培养人羊膜间充质干细胞的过程，所述培养过程包括如下步骤:hAMSCs的分离，hAMSCs的原代培养，hAMSCs的传代培养与扩增，hAMSCs的冻存和复苏，以及hAMSCs细胞免疫表型的检测；其特征在于，所述hAMSCs的分离步骤包括: 无菌条件下取产后弃置的新鲜胎盘，采用机械法将羊膜从胎盘组织上剥离，用D-Hanks液冲洗数次以清除残留血迹，将漂洗后的羊膜用眼科剪剪成约Imm3碎块，加入胰蛋白酶37°C消化10分钟； 加入含小牛血清的DMEM终止消化，并轻柔吹打混匀后200目细胞筛过滤； 过滤后的羊膜组织中加入II型胶原酶消化液，37°C消化30分钟；加入含小牛血清的DMEM终止消化，轻柔吹打混匀后200目细胞筛过滤，收集细胞；1000转/分钟离心5分钟；台盼兰染色计数活细胞，调整细胞密度为I X 106/ml，接种至培养瓶，加入含bFGF和FBS的DMEM培养基；置37°C、饱和湿度、体积分数5%的CO2培养箱内培养； 倒置相差显微镜下每日观察原代和传代细胞的生长情况和形态特征，隔天换液I次，并摄片记录； 待细胞汇合度达80 %后，用0.25 %胰蛋白酶-0.02 % EDTA溶液于37 °C消化2_3分钟，加入培养基终止胰蛋白酶作用，1000转/分钟离心5分钟，弃上清，细胞沉淀用培养基重新悬浮后，以I X IOVml的细胞密度传代；以及 传代过程中，隔日换液I次，待细胞长满70%瓶底重复以上步骤。
【文档编号】C12N5/0775GK103789258SQ201210506430
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2012年11月30日 优先权日:2012年11月30日
【发明者】陆华 申请人:陆华