一种红曲霉液态发酵曲的生产方法
【专利摘要】本发明公开了一种红曲霉液态发酵曲的生产方法，该方法涉及一株高产色素和桔霉素的红曲霉菌株L，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCC?M2013039。在本发明技术条件下生产的液态发酵曲，其色价水平为110～120U/mL，发酵周期为5～7d，糖化酶活力为630～740U/mL，同时桔霉素含量仅为2～3mg/L，低于日本厚生省在1999年颁布、2003年修订的《日本食品添加剂标准》中对红曲色素的桔霉素含量限量指标0.2mg/kg（色价基准为5u/g，1%），该液态发酵曲不存在安全上的隐患，可应用于红曲黄酒酿造体系。
【专利说明】一种红曲霉液态发酵曲的生产方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物发酵领域，尤其涉及一种红曲霉液态发酵曲的生产方法。
【背景技术】
[0002]红曲霉是一种腐生丝状真菌，属红曲科。将红曲霉应用于酿酒已有相当长的历史，主要是利用红曲霉代谢产生的红曲色素、各种酶以及多种生理活性物质，如麦角固醇、Monacolin K和Y -氨基丁酸等,不仅营养丰富,而且具有抗氧化、抗衰老、降血压、降胆固醇、参与机体代谢和免疫调节等生理功效。此外，红曲霉在代谢过程中还会产生一种真菌毒素一一桔霉素，桔霉素主要作用的靶器官是肾脏，它不仅可以致畸、导致肿瘤的发生，而且可以诱发突变，使得红曲产品的食用安全性受到严重挑战，生产无桔霉素或低桔霉素含量的红曲产品具有重要的现实意义。
[0003]福建红曲黄酒作为我国黄酒产业的一朵奇葩，因添加了红曲进行发酵而有与众不同的功效。红曲是以大米为主要原料，经红曲霉固态发酵而成的一种紫红色米曲，在福建红曲黄酒酿造中有着举足轻重的作用，赋予红曲黄酒独特的风味和药用保健价值。固态发酵作为传统红曲的生产方式，具有培养基简单、成本低、对环境污染少、能耗低等优点，但是其抗微生物污染能力低、劳动强度大，操作繁琐，生长速度慢、生产周期长且产品质量稳定性不高而不适宜大规模机械化生产。
【发明内容】
[0004]为了克服现有红曲制备技术的缺点与不足，本发明提供了一种红曲霉液态发酵曲的生产方法，该方法是一种高产糖化酶、低产桔霉素的红曲霉液态发酵曲的生产方法，以期应用于红曲黄酒酿造。液态发酵是工业化生产的前提，相比于固态发酵具有可操控强、能实现液态发酵生产红曲，对红曲黄酒工艺稳定性、机械化生产都有很大的促进作用。
[0005] 为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下:
本发明的一种红曲霉液态发酵曲的生产方法，所述红曲霉名称为红曲霉菌株L(Monascus kaoliang Strains L)，于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏日期为2013年I月22日，保藏编号为=CCTCC M 2013039。
[0006]所述生产方法包含以下的步骤:
①菌株活化:取权利要求1所述的红曲霉菌株L保藏菌种，在无菌条件下，挑取少许菌种转接到PDA培养基上，活化培养；
②挑取活化好的菌种转接到种子培养基中，培养发酵种子，得到发酵种子液；
③在发酵培养基中接入上述发酵种子液，进行液态发酵；
④发酵完毕，测定发酵液的糖化酶活力、色价和桔霉素含量。
[0007]所述液态发酵的具体步骤如下:取发酵培养基30~50mL于250mL三角瓶装中，按3~8%接种量移取种子培养液于发酵培养基中，在32~36°C培养箱中，200-250 rpm/min旋转振荡培养5~7天。[0008]更优选的，所述生产方法包括以下具体步骤:
①取权利要求1所述的红曲霉菌株L保藏菌种，在无菌条件下，挑少许菌种，转接于含PDA培养基的培养皿中，30°C活化培养8天；
②用打孔器打取PDA平板上的红曲霉菌落转接到种子培养基中，摇床转速200rpm/min，温度30°C培养60h，制得种子培养液；
③250mL三角瓶装发酵培养基30mL，以体积比计，按5%的接种量移取种子培养液于发酵培养基中，在32°C恒温培养箱中，250rpm/min旋转振荡培养6天；
④发酵液匀浆后，测定发酵液糖化酶活力、色价和桔霉素含量。
[0009]所述PDA培养基的配方如下:称取200g去皮切块的马铃薯，加入20g琼脂，20g葡萄糖，1000 mL去离子水,煮沸20~30 min,八层纱布过滤,混匀、分装、121°C灭菌30min。
[0010]所述种子培养基的配方如下(g. 1):籼米粉35，葡萄糖12，黄豆粉12，NaNO3 1，KH2PO4 I, MgSO4.7H20 0.5, pH 自然，121°C灭菌 20min。
[0011]所述发酵培养基的配方如下(g.L—1):米粉30~50，葡萄糖10~20，味精20~30，硫酸铵10~15，磷酸二氢钾2~3，七水合 硫酸镁0.4~0.7，一水合硫酸锰0.05~0.07，pH 6.5，121°C 灭菌 20min。
[0012]所述液态发酵的具体步骤如下:取发酵培养基30~50mL于250mL三角瓶装中，按3~8%接种量移取种子培养液于发酵培养基中，在32~36°C培养箱中，200-250 rpm/min旋转振荡培养5~7天。
[0013]所述的米粉为籼米粉、粳米粉、糯米粉、小米粉中的一种或几种。
[0014]本发明中红曲霉液态发酵物指标(糖化酶活力、色价和桔霉素)的测定方法如下:
1.糖化酶活力的测定方法:
取两根25mL比色管，分别加入事先(40°C)下预热的2.5mL 2%可溶性淀粉溶液和0.5mL稀释15倍的发酵液，在40°C反应lOmin，立即加入2mL DNS试剂，在沸水浴中加热5min，用水冷却，最后定容至25mL，在540nm处测定吸光度。以加入事先40°C下预热的2.5mL2%可溶性淀粉溶液和0.5mL适量稀释的酶液，立即加入2mL DNS试剂做空白。酶活力单位的定义=ImL酶液于40°C，pH4.6的条件下，Ih分解可溶性淀粉，产生Img葡萄糖，即为I个酶活力单位，以U/g表示。
[0015]2.色价的测定方法:
将发酵液匀浆后，取0.2g发酵匀浆液到25ml离心管中，添加13%乙醇溶液10mL，60°C水浴浸提Ih后用8000r/min离心,取离心上清液稀释10倍后测定410nm、465nm、505nm处吸光值，以水调零。色价=(OD410+ OD465+ OD505 ) X稀释倍数。
[0016]3.桔霉素的测定方法:
采用国家标准(GB / T 5009.222-2008)方法测定。将带有菌丝体的液态发酵红曲样品匀浆后用吸管吸取IOmL,置于50mL具塞试管中，加入20mL无水乙醇，60°C水浴加热I小时(期间不停地振荡)，冷却 至室温后转入塑料离心管中，3000r/min离心15分钟，上清液经0.22um滤膜过滤后进行HPLC分析。
[0017]本发明的显著优点:本发明成功建立了一种红曲霉液态发酵曲的生产方法，该液态曲可用于红曲黄酒的酿造生产。红曲霉菌株L液态发酵生产的发酵曲色价水平为115.58~123.17U/mL，发酵周期为5~7d，糖化酶活力为632.32~738.84 U/mL,同时桔霉素含量仅为1.18~3.0Omg/L，低于日本厚生省在1999年颁布、2003年修订的《日本食品添加剂标准》中对红曲色素的桔霉素含量限量指标0.2mg/kg (色价基准为5u/g，1%)。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1为红曲霉菌株L在实施例1、实施例2和实施例3的发酵结果。
【具体实施方式】
[0019]本发明的PDA培养基的配方如下:称取200g去皮切块的马铃薯，加入20g琼脂，20g葡萄糖，1000 mL去离子水，煮沸20-30 min，八层纱布过滤，混匀、分装、121 °C灭菌30mino
[0020]本发明的种子培养基的配方如下:籼米粉35 g，葡萄糖12 g，黄豆粉12 g，NaNO3 I g，KH2PO4 I g，MgSO4.7H20 0.5 g，去离子水定容到 1000 mL，pH 自然，121°C灭菌 20min。
[0021]本发明的发酵培养基的配方如下:米粉30~50 g，葡萄糖10~20 g，味精20~30 g，硫酸铵10~15 g，磷酸二氢钾2~3 g，七水合硫酸镁0.4~0.7 g，一水合硫酸锰
0.05 ~0.07 g，去离子水定容到 1000 mL，pH 6.5，121°C灭菌 20min。
[0022]本发明的液态发酵的具体步骤如下:取发酵培养基30~50mL于250mL三角瓶装中，按3~8%接种量移取种子培养液于发酵培养基中，在32~36 °C培养箱中，200-250rpm/min旋转振荡培养5~7天。
[0023]下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不限于此。
[0024]实施例1:
本发明的PDA培养基的配方如下:称取200g去皮切块的马铃薯，加入20g琼脂，20g葡萄糖，1000 mL去离子水,煮沸30 min,八层纱布过滤,混匀、分装、121°C灭菌30min。
[0025]本发明的种子培养基的配方如下:籼米粉35 g，葡萄糖12 g，黄豆粉12 g，NaNO3 I g，KH2PO4 I g，MgSO4.7H20 0.5 g，去离子水定容到 1000 mL，pH 自然，121°C灭菌 20min。
[0026]本发明的发酵培养基的配方如下:米粉50 g，葡萄糖20 g，味精30 g，硫酸铵15 g，磷酸二氢钾3 g，七水合硫酸镁0.7 g，一水合硫酸锰0.07 g，去离子水定容到1000 mL，pH 6.5，121。。灭菌 20min。
[0027]—种红曲霉液态发酵曲的生产方法具体如下:取红曲霉菌株L保藏菌种，在无菌条件下，挑少许菌种，转接于含PDA的培养皿中，30°C活化培养。取活化后的红曲霉菌株L以同样的方式接种到种子培养基中，30°C 200rpm/min培养60h。制备种子液。按5%接种量分别移取种子培养液于发酵培养基中，培养条件为250mL三角瓶装发酵培养基30mL，在32°C培养箱中，250 r/min旋转振荡培养6天。所得发酵液分别测定发酵产物的色价、糖化酶活力和桔霉素含量。
[0028]本发明中所涉及的红曲霉菌株L在上述方法下生产的液态发酵曲色价可达115.58U/mL，糖化酶活力达到738.84 U/mL，桔霉素含量仅为2.87 mg/L。
[0029]实施例2:
本发明的PDA培养基的配方如下:称取200g去皮切块的马铃薯，加入20g琼脂，20g葡萄糖，1000 mL去离子水，煮沸20 min，八层纱布过滤，混匀、分装、121°C灭菌30min。
[0030]本发明的种子培养基的配方如下:籼米粉35 g，葡萄糖12 g，黄豆粉12 g，NaNO3 I g，KH2PO4 I g，MgSO4.7H20 0.5 g，去离子水定容到 1000 mL，pH 自然，121°C灭菌 20min。
[0031]本发明的发酵培养基的配方如下:米粉30g，葡萄糖10 g，味精20 g，硫酸铵10g，磷酸二氢钾2 g，七水合硫酸镁0.4 g，一水合硫酸锰0.05 g，去离子水定容到1000 mL，pH 6.5，121。。灭菌 20min。
[0032]一种红曲霉液态发酵曲的生产方法具体如下:取红曲霉菌株L保藏菌种，在无菌条件下，挑少许菌种，转接于含PDA的培养皿中，30°C活化培养。取活化后的红曲霉菌株L以同样的方式接种到种子培养基中，30°C 200rpm/min培养60h。制备种子液。按3%接种量分别移取种子培养液于发酵培养基中，培养条件为250mL三角瓶装发酵培养基40mL，在32°C培养箱中，200 r/min旋转振荡培养7天。所得发酵液分别测定发酵产物的色价、糖化酶活力和桔霉素含量。
[0033]本发明中所涉及的红曲霉菌株L在上述方法下生产的液态发酵曲色价可达123.17U/mL，糖化酶活力达到691.14 U/mL，桔霉素含量仅为3.00 mg/L。
[0034]实施例3:
本发明的PDA培养基的配方如下:称取200g去皮切块的马铃薯，加入20g琼脂，20g葡萄糖，1000 mL去离子水，煮沸25 min，八层纱布过滤，混匀、分装、121°C灭菌30min。
[0035]本发明的种子培养基的配方如下:籼米粉35 g，葡萄糖12 g，黄豆粉12 g，NaNO3 I g，KH2PO4 I g，MgSO4.7H20 0.5 g，去离子水定容到 1000 mL，pH 自然，121°C灭菌 20min。
[0036]本发明的发酵培养基的配方如下:米粉35 g，葡萄糖15 g，味精25 g，硫酸铵12g，磷酸二氢钾2.5 g，七水合硫酸镁0.5 g，一水合硫酸锰0.06 g，去离子水定容到1000mL ，pH 6.5,121°C灭菌 20min。
[0037]—种红曲霉液态发酵曲的生产方法具体如下:取红曲霉菌株L保藏菌种，在无菌条件下，挑少许菌种，转接于含PDA的培养皿中，30°C活化培养。取活化后的红曲霉菌株L以同样的方式接种到种子培养基中，30°C 200rpm/min培养60h。制备种子液。按8%接种量分别移取种子培养液于发酵培养基中，培养条件为250mL三角瓶装发酵培养基50mL，在36°C培养箱中，240 r/min旋转振荡培养5天。所得发酵液分别测定发酵产物的色价、糖化酶活力和桔霉素含量。
[0038]本发明中所涉及的红曲霉菌株L在上述方法下生产的液态发酵曲色价可达118.32U/mL，糖化酶活力达到632.32 U/mL，桔霉素含量仅为1.18mg/L。
【权利要求】
1.一种红曲霉液态发酵曲的生产方法，其特征在于:所述红曲霉名称为红曲霉菌株L{Monascus kaoliang Strains L),于中国典型培养物保藏中心保藏,保藏编号为:CCTCC M2013039。
2.根据权利要求1所述的一种红曲霉液态发酵曲的生产方法，其特征在于:所述生产方法包含以下的步骤: ①取权利要求1所述的红曲霉菌株L保藏菌种，在无菌条件下，挑取少许菌种转接到PDA培养基上，活化培养； ②挑取活化好的菌种转接到种子培养基中，培养发酵种子，得到发酵种子液； ③在发酵培养基中接入上述发酵种子液，进行液态发酵； ④发酵完毕，测定发酵液的糖化酶活力、色价和桔霉素含量。
3.根据权利要求2所述的一种红曲霉液态发酵曲的生产方法，其特征在于:所述液态发酵的具体步骤如下:取发酵培养基30~50mL于250mL三角瓶装中，按3~8%接种量移取种子培养液于发酵培养基中，在32~36°C培养箱中，200-250 rpm/min旋转振荡培养5~7天。
4.根据权利要求2所述一种红曲霉液态发酵曲的生产方法，其特征在于:所述生产方法包括以下具体步骤: ①取权利要求1所述的红曲霉菌株L保藏菌种，在无菌条件下，挑少许菌种，转接于含PDA培养基的培养皿中，30°C活化培养8天； ②用打孔器打取PDA平板 上的红曲霉菌落转接到种子培养基中，摇床转速200rpm/min，温度30°C培养60h，制得种子培养液； ③250mL三角瓶装发酵培养基30mL，以体积比计，按5%的接种量移取种子培养液于发酵培养基中，在32°C恒温培养箱中，250rpm/min旋转振荡培养6天； ④发酵液匀浆后，测定发酵液糖化酶活力、色价和桔霉素含量。
5.根据权利要求3或4所述的一种红曲霉液态发酵曲的生产方法，其特征在于:所述PDA培养基的配方如下:称取200g去皮切块的马铃薯，加入20g琼脂，20g葡萄糖，1000 mL去离子水,煮沸20-30 min,八层纱布过滤,混匀、分装、121°C灭菌30min。
6.根据权利要求3或4所述的一种红曲霉液态发酵曲的生产方法，其特征在于:所述种子培养基的配方如下:籼米粉35 g，葡萄糖12 g，黄豆粉12 g，NaNO3 I g，KH2PO4 Ig，MgSO4.7H20 0.5 g，去离子水定容到 1000 mL，pH 自然，121°C灭菌 20min。
7.根据权利要求3或4所述的一种红曲霉液态发酵曲的生产方法，其特征在于:所述发酵培养基的配方如下:米粉30~50 g，葡萄糖10~20 g，味精20~30 g，硫酸铵10~15 g，磷酸二氢钾2~3 g，七水合硫酸镁0.4~0.7 g，一水合硫酸锰0.05~0.07 g，去离子水定容到1000 mL，pH 6.5，121°C灭菌20min。
8.根据权利要求6所述的一种红曲霉液态发酵曲的生产方法，其特征在于:所述的米粉为籼米粉、粳米粉、糯米粉、小米粉中的一种或几种。
【文档编号】C12G3/02GK103468463SQ201310034337
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年1月30日 优先权日:2013年1月30日
【发明者】倪莉, 梁爽 申请人:福州大学