细胞培养物的制备方法和细胞培养物及其在药物筛选中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种细胞培养物的制备方法，该细胞培养物包括细胞培养基底和生长在该细胞培养基底上的活细胞，其特征在于，该方法包括：（1）制备杨氏模量为0.1-3000kPa的细胞培养基底；（2）在所述基底上培养活细胞。本发明还公开了如上所述的制备方法制备的细胞培养物以及该细胞培养物在药物筛选中的应用。采用本发明提供的细胞培养物用于药物的筛选，可以在一定程度上缩小体内外药效的差异性，并且，随着所述细胞培养基底的杨氏模量与所培养的细胞来源的组织的杨氏模量的接近，这种差异性得到了进一步缩小。
【专利说明】细胞培养物的制备方法和细胞培养物及其在药物筛选中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种细胞培养物的制备方法，按照该制备方法制备的细胞培养物及其在药物筛选中的应用。
【背景技术】
[0002]体外细胞水平的药物筛选试验是一些疾病如肿瘤、脏器纤维化以及糖尿病等药物研发的关键步骤，传统的药物筛选试验是基于包含塑料基底的多孔细胞培养板而完成的，但是采用这种方法的药物筛选效率较低。以抗肿瘤药物的筛选为例，经临床三期的药物筛选后，平均每一万个候选药物只能产生一到两个临床中真正有效的药物。药物筛选效率的低下造成了时间与资源上的浪费。新一代的体外药物筛选平台如三维组织培养体系以及植入免疫缺陷小鼠的新鲜的人体活检组织样本被用来模拟人体的生理微环境而进行药物的筛选，然而该方法的成本较高，并且技术较不成熟。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于克服采用现有技术进行药物筛选的过程中药物筛选效率较低，并且成本较高以及技术不成熟的缺点，提供一种药物筛选效率较高、成本较低且技术成熟的细胞培养物及其制备方法，以及该细胞培养物在药物筛选中的应用。
[0004]本发明的发明人发现，采用现有技术进行药物筛选的过程中药物筛选效率较低的原因在于，药物筛选体系对人体生理微环境的模拟仅限于化学组成、生物大分子以及微结构层次上，而忽略了生物力学因素。事实上，生理状态下的力学微环境，例如硬度，对细胞行为的影响同样重要。细胞培养基底的硬度不仅影响肿瘤细胞的增殖，而且还调节对抗肿瘤药物的敏感性。因此在体外硬度较大的塑料平板培养体系中所筛选出的有效药物并非能在体内硬度较小的微环境中表现出同样的疗效。因此，我们提出了生物力药理学，它不仅关注药物与生物力作为单一因素的药理学效应，还关注药物与生物力学因素的联合药理学效应。在生物力药理学的基础上，本发明的发明人通过以细胞培养板为载体，在其上修饰不同生理硬度的生物相容性材料，进而在修饰有不同生理硬度的生物相容性材料的细胞培养板中进行细胞的培养，从而对药物进行筛选，取得了良好的效果。所述生物相容性材料是指无生物毒性并为生命体正常功能的正常发挥提供支持，同时在生命体环境中能够保持其原有的物化、材料等特性的材料。
[0005]基于以上发现，一方面，本发明提供了一种细胞培养物的制备方法，该细胞培养物包括细胞培养基底和生长在该细胞培养基底上的活细胞，其中，该方法包括:
[0006](1)制备杨氏模量为0.l-3000kPa的细胞培养基底；
[0007](2)在所述基底上培养活细胞。 [0008]另一方面，提供了根据本发明提供的方法制备的细胞培养物。
[0009]再一方面，本发明提供了所述细胞培养物在药物筛选中的应用。[0010]由实施例和对比例的比较可以看出，采用本发明提供的细胞培养物用于药物的筛选，可以在一定程度上缩小体内外药效的差异性，并且，随着所述细胞培养基底的杨氏模量与所培养的细胞来源的组织的杨氏模量的接近，这种差异性得到了进一步缩小。
[0011]本发明的其他特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明
【具体实施方式】
[0012]以下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的【具体实施方式】仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0013]一方面，本发明提供了一种细胞培养物的制备方法，该细胞培养物包括细胞培养基底和生长在该细胞培养基底上的活细胞，其中，该方法包括:
[0014](I)制备杨氏模量为0.l-3000kPa的细胞培养基底；
[0015](2)在所述基底上培养活细胞。
[0016]根据本发明，术语“杨氏模量(Young’s modulus)”是描述固体材料抵抗形变能力的物理量，此处用于表示细胞培养基底或细胞来源组织的硬度，可以按照 The promotion of neuronal maturation on soft substrates, Biomaterials
(A.1.Teixeira, S.1lkhanizadeh, J.A.ffigenius, J.K.Duckworth, 0.1nganas and
0.Hermanson, 30 (2009 )，4567-4572.)中公开的方法进行测定，具体的，利用压痕仪或原子力显微镜对细胞培养基底或细胞来源组织的硬度进行测定。通过绘制压痕曲线，然后利用赫兹模型计算细胞培养基底的杨氏模量，公式如下:
[001 7] B = JyJP
[0018]其中，E为杨氏模量，F为加载力，U为泊松比，h为压痕深度，R为压痕仪末端或原子力显微镜微悬臂末端小球的半径。
[0019]根据本发明，本发明的目的在于在利用细胞进行药物的筛选时，缩小细胞体内外生长力学微环境，例如，硬度之间的差距，以提高体外药物筛选的效率，从而使筛选的药物成为临床中真正有效的药物。由于细胞来源的组织不同，其所适应生长的力学微环境，例如，硬度也有所不同，通常情况下，细胞来源组织的杨氏模量为0.l-3000kPa，因此，本发明所制备的细胞培养基底的杨氏模量为0.l-3000kPa。
[0020]根据本发明，尽管在本发明提供的细胞培养基底上培养细胞以获得细胞培养物，并利用该细胞培养物进行药物的筛选即可实现本发明的目的，即，提高药物的筛选效率并降低成本。但当制备的细胞培养基底的杨氏模量和所要培养的细胞的来源组织的杨氏模量相同或基本相同时，可以更好的实现本发明的目的。因此，优选的，所述细胞培养基底的杨氏模量为所述细胞的来源组织的杨氏模量的0.9-1.2倍，更优选为0.95-1.05倍，进一步优选为 0.99-1.01 倍。
[0021]根据本发明，细胞培养物基底的制备方法不受特别的限制，例如，可以在用于细胞培养的培养器皿中修饰硬度可调的生物相容性材料，例如，聚丙烯酰胺凝胶和/或聚二甲基硅氧烷(PDMS)凝胶，然后再用细胞外基质蛋白修饰所述凝胶。
[0022]其中，聚丙烯酰胺凝胶和聚二甲基硅氧烷凝胶的制备为本领域技术人员所公知。例如，聚丙烯酰胺凝胶的制备方法为:在引发剂的存在下，将丙烯酰胺单体水溶液和二甲基丙烯酰胺的单体水溶液进行混合并聚合，即可得到聚丙烯酰胺凝胶。其中，所述引发剂的种类和加入量也为本领域技术人员所公知，例如，引发剂可以为过硫酸铵(APS)和四甲基乙=K(TEMED),以上述两种单体水溶液的总体积为基准，质量分数为8-12%的APS水溶液的加入量为0.25-0.35体积％，TEMED的加入量为0.1-0.16体积％。聚二甲基硅氧烷凝胶的制备方法为:将聚二甲基硅氧烷(PDMS)单体(base)与固化剂(curing agent)混合,并在70-900C的温度下聚合，得到聚二甲基硅氧烷凝胶。其中，所述PDMS单体为二甲基乙烯化的和三甲基化的二氧化硅、四(三甲基甲硅烷氧基)硅烷和乙基苯；所述固化剂为二甲基乙烯化的和三甲基化的二氧化硅和八甲基环四硅氧烷。所述PDMS单体和固化剂可以通过商购获得，例如，从道康宁(Dow Corning)公司购买的PDMS试剂盒中即含有上述配制好的PDMS单体和固化剂。
[0023]其中，所述“硬度可调”是指可以调节修饰的生物相容性材料中各成分的比例和/或各成分的浓度以使所制备的生物相容性材料的杨氏模量与所要培养的细胞的来源组织的杨氏模量相同或基本相同。例如，当所述细胞来源组织的杨氏模量为0.1-1kPa时，例如所述组织的来源可以为脑、肺泡，将1-3重量％的丙烯酰胺单体和0.01-0.1重量％的二甲基丙烯酰胺单体的水溶液进行混合并聚合；或者将PDMS单体与固化剂按90-100:1的质量比进行混合并聚合。当所述细胞来源组织的杨氏模量大于IkPa到至多IOkPa时，例如所述组织的来源可以为乳腺、肝脏，将大于3重量％到至多8重量％的丙烯酰胺单体和大于0.1重量％到至多0.3重量％的二甲基丙烯酰胺单体的水溶液进行混合并聚合；或者将PDMS单体与固化剂按70:1到小于90:1的质量比进行混合并聚合。当所述细胞来源组织的杨氏模量大于IOkPa到至多IOOkPa时，例如所述组织来源可以为肌肉、骨胶原，将大于8重量％到至多10重量％的丙烯酰胺单体和大于0.3重量％到至多0.5重量％的二甲基丙烯酰胺单体的水溶液进行聚合；或者将PDMS单体与固化剂按30:1到小于70:1的质量比进行混合并聚合。当所述细胞来源组织的杨氏模量为大于100到至多3000kPa时，例如所述组织的来源可以软骨，将二甲基硅氧烷与固化剂按5:1到小于30:1的质量比进行混合并聚合。需要指出的是，上述描述的配制不同杨氏模量的凝胶的方法仅为本发明优选的实施方式，实际并不限于此。只要通过调节生物相容性材料中各成分的比例和/或各成分的浓度能够配制出上述范围的杨氏模量的凝胶同样为本发明的范围。
[0024]当修饰的生物相容性材料为聚丙烯酰胺凝胶时，根据本发明一种优选的实施方式，所述含有聚丙烯酰胺凝胶的细胞培养基底的制备方法为:将厚度为1.5-2.5mm、长为
12.8-13.2mm,宽为 8.5-8.7mm 的玻璃板 A 与厚度为 1.5-2.5mm、长为 13.8-14.2mm,宽为
8.9-9.1mm玻璃板B泡酸(重铬酸钾63克；浓硫酸1000ml ;蒸馏水200ml。)过夜，依次自来水冲洗8-10次，蒸馏水冲洗3-4次，超纯水冲洗1-2次后烘干；然后使用等离子体清洗仪处理玻璃板A4-6分钟，并在其表面均匀涂抹一层亲和硅烷(购自拜尔迪公司)，静置8-10分钟后再将其浸入0.4-0.6体积％的戊二醛溶液中25-35分钟。在玻璃板B表面均匀涂抹一层二甲基二氯硅烷(DCM)，静置8-10分钟；将玻璃板A从戊二醛溶液中取出，吸去表面残余水分；并将两玻璃板拼合在一起，中间隔一层380-420微米厚的U形塑料垫片，并利用夹子固定；向5-6毫升按照不同比例配制好的丙烯酰胺与二甲基丙烯酰胺水溶液中加入12-14微升 8-12重量％的APS与6-8微升TEMED，混合均匀后迅速加入由玻璃板与垫片组装的模具中直至充满；待聚合后，拆掉模具，聚合的聚丙烯酰胺凝胶附着在玻璃板A上，将玻璃板A浸泡于超纯水中22-26小时后；将细胞培养器皿底面用打孔器打通并倒扣在修饰有聚丙烯酰胺凝胶的玻璃板A上，利用夹子进行固定进而得到本发明的细胞培养基底。其中，超纯水是指25°C下电阻率大于18ΜΩ.αιι或接近18.2ΜΩ.cm极限值的水。
[0025]根据本发明，使用细胞外基质蛋白修饰所述凝胶的方法为本领域技术人员所公知，例如，将所述凝胶与磺化的苯基叠氮化物交联剂(suIfo-SANPAH)接触，得到磺化的苯基叠氮化物交联剂接触的凝胶；将磺化的苯基叠氮化物交联剂接触的凝胶与细胞外基质蛋白接触。
[0026]其中，将所述凝胶与sulfo-SANPAH接触的条件的可选范围较宽，例如，温度可以为20-40°C，紫外光强度可以为180-220W，时间可以为10-20分钟，磺化的苯基叠氮化物交联剂的用量可以为10-20 μ g/平方厘米凝胶^fsulfo-SANPAH接触的凝胶与细胞外基质蛋白接触的条件的可选范围也较宽:例如，温度为可以30-40°C，时间可以为10-20小时，细胞外基质蛋白的用量可以为3-5 μ g/平方厘米凝胶。其中，所述细胞外基质蛋白的种类没有特别的限制，只要在后续细胞培养的过程中可以辅助细胞贴壁即可，所述细胞外基质蛋白可以包括胶原蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白。
[0027]由于本发明的发明点在于制备硬度可调的细胞培养基底，所以在所述基底上培养细胞的方法没有特别的限制，可以根据本领域技术人员公知的方法进行培养，在这里不再详细赘述。
[0028]第二方面，本发明还提供了如上所述的制备方法制备的细胞培养物。
[0029]第三方 面，本发明还提供了如上所述的细胞培养物在药物筛选中的应用。
[0030]以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中和对比例中:
[0031]杨氏模量通过压痕实验测得:仪器为原子力显微镜，(购自安捷伦公司型号为5500)，选择弹性系数为0.lN/m左右的原子力显微镜微悬臂，微悬臂末端粘附有直径15微米左右的玻璃材质微球，在大气中做压痕实验，将所得的力-位移作用曲线通过如下公式计算出杨氏模量。
【权利要求】
1.一种细胞培养物的制备方法，该细胞培养物包括细胞培养基底和生长在该细胞培养基底上的活细胞，其特征在于，该方法包括: (O制备杨氏模量为0.l-3000kPa的细胞培养基底； (2)在所述基底上培养活细胞。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述细胞培养基底的杨氏模量为所述细胞的来源组织的杨氏模量的0.9-1.2倍，优选为0.95-1.05倍，更优选为0.99-1.01倍。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中，所述细胞的来源组织的杨氏模量为.0.1-lkPa，所述细胞培养基底的制备方法包括: (1)在引发剂的存在下，将1-3重量％的丙烯酰胺单体和0.01-0.1重量％的二甲基丙烯酰胺单体的水溶液进行混合并聚合，得到凝胶； 或者，将聚二甲基硅氧烷单体与固化剂按90-100:1的质量比进行混合，并在70-90°C的温度下聚合，得到凝胶；所述单体为二甲基乙烯化的和三甲基化的二氧化硅、四(三甲基甲硅烷氧基)硅烷和乙基苯；所述固化剂为二甲基乙烯化的和三甲基化的二氧化硅和八甲基环四硅氧烷； (2)用细胞外基质蛋白修饰所述凝胶。
4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中，所述细胞来源组织的杨氏模量为大于IkPa到至多IOkPa,所述细胞培养基底的制备方法包括: (1)在引发剂的存在下，将大于3重量％到至多8重量％的丙烯酰胺单体和大于0.1重量％到至多0.3重量％的二甲基丙烯酰胺单体的水溶液进行混合并聚合，得到凝胶； 或者，将聚二甲基硅氧烷单体与固化剂按70:1到小于90:1的质量比进行混合，并在70-90°C的温度下聚合，得到凝胶；所述单体为二甲基乙烯化的和三甲基化的二氧化硅、四(二甲基甲娃烷氧基)硅烷和乙基苯；所述固化剂为二甲基乙稀化的和二甲基化的二氧化娃和八甲基环四硅氧烷； (2)用细胞外基质蛋白修饰所述凝胶。
5.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中，所述细胞来源组织的杨氏模量为大于IOkPa到至多IOOkPa,所述细胞培养基底的制备方法包括: (1)在引发剂的存在下，将大于8重量％到至多10重量％的丙烯酰胺单体和大于0.3重量％到至多0.5重量％的二甲基丙烯酰胺单体的水溶液进行混合并聚合，得到凝胶； 或者，将聚二甲基硅氧烷单体与固化剂按30:1到小于70:1的质量比进行混合，并在70-90°C的温度下聚合，得到凝胶；所述单体为二甲基乙烯化的和三甲基化的二氧化硅、四(二甲基甲娃烷氧基)硅烷和乙基苯；所述固化剂为二甲基乙稀化的和二甲基化的二氧化娃和八甲基环四硅氧烷； (2)用细胞外基质蛋白修饰所述凝胶。
6.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中，所述细胞来源组织的杨氏模量为大于IOOkPa到至多3000kPa，所述细胞培养基底的制备方法包括: (I)将聚二甲基硅氧烷单体与固化剂按5:1到小于30:1的质量比进行混合，并在70-90°C的温度下聚合，得到凝胶；所述单体为二甲基乙烯化的和三甲基化的二氧化硅、四(二甲基甲娃烷氧基)硅烷和乙基苯；所述固化剂为二甲基乙稀化的和二甲基化的二氧化娃和八甲基环四硅氧烷；(2)用细胞外基质蛋白修饰所述凝胶。
7.根据权利要求3-6中任意一项所述的制备方法，其中，用细胞外基质蛋白修饰所述凝胶的方法包括: (1)将所述凝胶与磺化的苯基叠氮化物交联剂接触，得到磺化的苯基叠氮化物交联剂接触的凝胶； (2)将磺化的苯基叠氮化物交联剂接触的凝胶与细胞外基质蛋白接触。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其中，步骤(1)中，将所述凝胶与磺化的苯基叠氮化物交联剂接触的条件包括:温度为20-40°C，紫外光强度为180-220W，时间为10-20分钟，磺化的苯基叠氮化物交联剂的用量为10-20 μ g/平方厘米凝胶；步骤(2)中，将磺化的苯基叠氮化物交联剂接触的凝胶与细胞外基质蛋白接触的条件包括:温度为30-40°C，时间为10-20小时，细胞外基质蛋白的用量为3-5 μ g/平方厘米凝胶；所述细胞外基质蛋白包括胶原蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白。
9.权利要求1-8中任意一项所述的制备方法制备的细胞培养物。
10.权利要求9所 述的细胞培养物在药物筛选中的应用。
【文档编号】C12N5/00GK103966152SQ201310033792
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2013年1月29日 优先权日:2013年1月29日
【发明者】冯建涛, 唐勇, 韩东 申请人:国家纳米科学中心