专利名称：山羊卵丘细胞体外培养抗凋亡处理方法
技术领域：
本发明涉及一种山羊卵丘细胞体外培养抗凋亡处理方法。
背景技术：
卵母细胞又称为卵子，是一个新的生命个体发生发育的前提和基础。随着现代生命科学的发展，卵母细胞是家畜新品种培育、转基因育种和品种改良等方面的重要的材料。对于人类生殖健康而言，卵母细胞的体外成熟培养是试管婴儿诞生的基础。因此，卵母细胞的体外培养技术是现代生殖发育的核心技术。卵母细胞在体内存在于卵巢上，出生后的动物卵巢上存在的卵母细胞停滞于生发泡(germinal vesicle, GV)期，不再增殖且数量有限，伴随着年龄的增长，数量不断减少，并最终枯竭，卵母细胞的体内发生发育特点也就决定了卵子的稀有珍贵。在正常生长发育的情况下，卵母细胞外周包裹有大量的卵丘细胞，卵丘细胞在卵母细胞开始形成时就已颗粒细胞的形式存在，伴随着卵母细胞的生长和发育，其数量逐步增多，并且在卵母细胞生长发育的过程中，分泌各种物质，同卵母细胞进行物质和信息的交换，从而调控卵母细胞的发生发育，因此，卵丘细胞在卵母细胞外围的存在质量将直接影响卵母细胞发育的状态和结果。维甲酸(retinoic acid, RA)是体内维生素A的代谢中间产物，主要影响骨的生长和促进上皮细胞增生、分化、角质溶解等代谢作用，在临床实践中常用于治疗寻常痤疮、银屑病、鱼鳞病、扁平苔癣、毛发红糠疹、毛囊角化病、鳞状细胞癌及黑色素瘤等疾病。凋亡是细胞对环境的生理性病理性刺激信号，环境条件的变化或缓和性损伤产生的应答有序变化的死亡过程，细胞过度凋亡会引起机体组成的组织或器官退化。在卵母细胞的体外成熟培养过程中，一定浓度的RA能够抑制卵母细胞外周卵丘细胞的凋亡，将为卵丘细胞的体外发育调控奠定基础，也为卵母细胞的高质量生产提供平台
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种山羊卵丘细胞体外培养抗凋亡处理方法。为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是:山羊卵丘细胞体外培养抗凋亡处理方法，包括以下步骤:
(I)卵丘卵母细胞复合物体外成熟培养
卵巢采集于屠宰场宰杀后的山羊，分离出2 8_卵泡中的卵丘卵母细胞复合物；挑取有3 5层致密卵丘包裹的卵母细胞用于成熟培养；挑取的卵丘卵母细胞复合物经操作液清洗后，置于成熟液中，培养时，将维甲酸(retinoic acid, RA)添加到成熟液中，50 80个卵丘卵母细胞复合物/孔，覆盖矿物油，于饱和湿度下，38.5° C培养；所述操作液组分为TCMl99 + 5% FBS + 100 IU/ml青霉素+ 0.1 mg/ml链霉素；所述成熟液组分为TCM199+10% FBS + 10 IU/ml PMSG + 5 IU/ml hCG + 0.1 mg/ml L-半胱氨酸 + 10ng/ml EGF ；(2)卵丘细胞凋亡相关基因表达检测
成熟培养后的卵丘卵母细胞复合物经透明质酸酶液滴中脱去卵丘细胞；收集卵丘细胞置于1.5ml离心管中，离心去上清后，提取卵丘细胞总RNA ;将总RNA反转录至cDNA ;经荧光定量PCR分析凋亡相关基因表达水平；
(3)卵丘细胞凋亡末端标记检测
成熟培养的卵丘卵母细胞复合物经4%多聚甲醛固定，0.5% Triton X-100通透；经原位末端转移酶标记技术进行标记，Hoechst细胞核染液孵育；荧光显微镜下检测；对于单个卵丘细胞凋亡的检测，成熟培养的卵丘卵母细胞复合物经透明质酸酶消化后，收集卵丘细胞；卵丘细胞离心洗涤后用4%多聚甲醛固定，0.5% Triton X-100通透；经原位末端转移酶标记技术进行标记，Hoechst细胞核染液孵育；荧光显微镜下检测。作为优选，步骤(I)中添加到成熟液中的维甲酸为10 nM 1000 nM。作为进一步优选，步骤(I)中添加到成熟液中的维甲酸为10 nM。作为进一步优选，步骤(I)中添加到成熟液中的维甲酸为100 nM。作为进一步优选，步骤(I)中添加到成熟液中的维甲酸为1000 nM。本发明的有益效果是:
在山羊卵丘卵母细胞复合物体外成熟培养过程中，添加维甲酸(retinoic acid,RA)能够有效地抑制卵母细胞外周卵丘细胞的凋亡，进而促进山羊卵母细胞细胞核与细胞质的成熟。本发明为通过抑制卵丘 细胞凋亡促进山羊卵母细胞发育能力提供了新的研究途径。
具体实施例方式一、材料与方法
(I)山羊卵丘卵母细胞复合物体外成熟培养
卵巢采集于屠宰场宰杀的山羊，利用精细镊和手术刀片分离出2 8mm卵泡中的卵丘卵母细胞复合物；挑取有3 5层致密卵丘包裹的卵母细胞用于成熟培养；挑取的卵丘卵母细胞复合物经操作液(TCM199 + 5% FBS + 100 IU/ml青霉素+ 0.1 mg/ml链霉素)清洗后，置于成熟液(TCM199+ 10% FBS + 10 IU/ml PMSG + 5 IU/ml hCG + 0.1 mg/mlL-半胱氨酸+ 10ng/ml EGF)中，培养时，将维甲酸(下简称RA)分次以10 nM, 100 nM和1000 nM添加到成熟液中，50 80个卵丘卵母细胞复合物/孔，覆盖矿物油，于饱和湿度下，38.5° C 培养。(2)山羊卵丘细胞凋亡相关基因表达检测
成熟培养后的卵丘卵母细胞复合物经500 μ I lmg/ml透明质酸酶液滴中脱去卵丘；收集卵丘细胞置于1.5ml离心管中，离心去上清后，提取卵丘细胞总RNA ;将总RNA反转录至cDNA ;经荧光定量PCR分析凋亡相关基因表达水平；15 μ I反应体系:0.9 μ I山羊特异性引物，7.5μ1 SYBR Green Supermix 1.5 μ I稀释的cDNA及5.I μ I水；每个反应至少设3个生物学重复。(3)山羊卵丘细胞凋亡末端标记检测
成熟培养的卵丘卵母细胞复合物经4%多聚甲醛固定，0.5% Triton X-100通透；经原位末端转移酶标记技术进行标记，Hoechst细胞核染液孵育；荧光显微镜下检测；对于单个卵丘细胞凋亡的检测，成熟培养的卵丘卵母细胞复合物经透明质酸酶消化后，收集卵丘细胞；卵丘细胞离心洗涤后用4%多聚甲醛固定，0.5% Triton X-100通透；经原位末端转移酶标记技术进行标记，Hoechst细胞核染液孵育；荧光显微镜下检测。(4)统计与分析
所有结果均以平均值土标准差表示；使用SPSS软件中的t-test对数据进行统计学分析。P〈0.05表不差异显著。二、结果
(I)RA促进山羊卵母细胞的成熟
在山羊卵母细胞成熟培养液中，添加RA能够显著促进卵母细胞的成熟(p〈0.05)，分次添加10 nM或100 nM或1000 nM RA的山羊成熟培养液中卵母细胞的成熟率分别达到78.68%、76.83%和73.59%,显著高于未添加RA的对照组65.33%。(2) RA减少山羊卵丘细胞的凋亡
经原位末端转移酶标记检测显示，未经RA培养的卵丘卵母细胞复合物中，卵母细胞外周卵丘细胞呈现大量凋亡，经过RA培养后，卵母细胞外周卵丘细胞呈现凋亡现象明显减少；通过把卵母细胞外围卵丘细胞消化收集检测统计后显示，在成熟培养期间添加RA处理后，分次添加10 nM或100 nM或1000 nM RA的山羊成熟培养液中卵丘细胞的凋亡率分别为5.98%,4.27%和5.26%,显著低于未添加RA的对照组9.31%(ρ〈0.01)。(3 ) RA促进山羊卵丘细胞抗凋亡基因的表达
实时荧光定量PCR检测显示，相对于未添加RA的对照组，卵母细胞在成熟培养期间经RA处理2(T22h后，凋亡基因Caspase-8表达水平显著下调(10 nM, p<0.05 ；100 nM,p<0.05 ；1000 nM p〈0.01)。抗凋亡基因BAX表达水平均显著上调(10 nM, p<0.05 ；100nM, p<0.01 ；1000 nM p〈0.05)、抗凋亡基因CAT基因表达水平均显著上调(10 ηΜ, ρ〈0.05 ;100 nM, p<0.01 ；1000 nM p〈0.01)，及抗凋亡基因BCL-2基因表达水平均显著上调(10 nM,p〈0.01 ；100 nM, p〈0.01 ；1000 nM p〈0.05)。以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的权利要求保护范围之内。
权利要求
1.山羊卵丘细胞体外培养抗凋亡处理方法，包括以下步骤: (1)卵丘卵母细胞复合物体外成熟培养 卵巢采集于屠宰场宰杀后的山羊，分离出2 8mm卵泡中的卵丘卵母细胞复合物；挑取有3 5层致密卵丘包裹的卵母细胞用于成熟培养；挑取的卵丘卵母细胞复合物经操作液清洗后，置于成熟液中，培养时，将维甲酸添加到成熟液中，50 80个卵丘卵母细胞复合物/孔，覆盖矿物油，于饱和湿度下，38.5° C培养；所述操作液组分为TCM199 + 5% FBS +100 IU/ml青霉素+ 0.1 mg/ml链霉素；所述成熟液组分为TCM199+ 10% FBS + 10 IU/ml PMSG + 5 I U/ml hCG + 0.1 mg/ml L-半胱;氛酸 + 10ng/ml EGF ； (2)卵丘细胞凋亡相关基因表达检测 成熟培养后的卵丘卵母细胞复合物经透明质酸酶液滴中脱去卵丘细胞；收集卵丘细胞置于1.5mI离心管中，离心去上清后，提取卵丘细胞总RNA ;将总RNA反转录至cDNA ;经荧光定量PCR分析凋亡相关基因表达水平； (3)卵丘细胞凋亡末端标记检测 成熟培养的卵丘卵母细胞复合物经4%多聚甲醛固定，0.5% Triton X-100通透；经原位末端转移酶标记技术进行标记，Hoechst细胞核染液孵育；荧光显微镜下检测；对于单个卵丘细胞凋亡的检测，成熟培养的卵丘卵母细胞复合物经透明质酸酶消化后，收集卵丘细胞；卵丘细胞离心洗涤后用4%多聚甲醛固定，0.5% Triton X-100通透；经原位末端转移酶标记技术进行标记，Hoechst细胞核染液孵育；荧光显微镜下检测。
2.根据权利要求1所述的山羊卵丘细胞体外培养抗凋亡处理方法，其特征在于:所述步骤(I)中添加到成熟液中的维甲酸为10 nM 1000 nM。
3.根据权利要求1所述的山羊卵丘细胞体外培养抗凋亡处理方法，其特征在于:所述步骤(I)中添加到成熟液中的维甲酸为10 nM。
4.根据权利要求1所述的山羊卵丘细胞体外培养抗凋亡处理方法，其特征在于:所述步骤(I)中添加到成熟液中的维甲酸为100 nM。
5.根据权利要求1所述的山羊卵丘细胞体外培养抗凋亡处理方法，其特征在于:所述步骤(I)中添加到成熟液中的维甲酸为1000 nM。
全文摘要
本发明公开了山羊卵丘细胞体外培养抗凋亡处理方法，包括以下步骤(1)卵丘卵母细胞复合物体外成熟培养挑取的卵丘卵母细胞复合物经操作液清洗后，置于成熟液中，培养时，将维甲酸添加到成熟液中，50～80个卵丘卵母细胞复合物/孔，覆盖矿物油，于饱和湿度下，38.5°C培养；所述操作液组分为TCM199+5%FBS+100IU/ml青霉素+0.1mg/ml链霉素；所述成熟液组分为TCM199+10%FBS+10IU/mlPMSG+5IU/mlhCG +0.1mg/mlL-半胱氨酸+10ng/mlEGF；(2)卵丘细胞凋亡相关基因表达检测(3)卵丘细胞凋亡末端标记检测。本发明在山羊卵丘卵母细胞复合物体外成熟培养过程中，添加维甲酸(RA)能够有效地抑制卵母细胞外周卵丘细胞的凋亡，进而促进山羊卵母细胞细胞核与细胞质的成熟。
文档编号C12N5/075GK103215221SQ201310071009
公开日2013年7月24日 申请日期2013年3月6日 优先权日2013年3月6日
发明者蒲勇, 曹鸿国, 章孝荣, 王张帆, 卞雅尼, 张运海, 刘亚, 李运生, 方富贵, 陶勇 申请人:安徽农业大学