专利名称：一种原产酸性蛋白酶的宇佐美曲霉诱导发酵产角蛋白酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种原来产酸性蛋白酶的宇佐美曲霉发酵产角蛋白酶的方法，属微生物工程技术领域。
背景技术：
角蛋白酶是一种可专一地降解角蛋白的蛋白酶类，角蛋白酶可由多种微生物产生，能特异性地降解角蛋白，在饲料、皮革、医药业、食品等工业及环境治理方面具有广阔的应用前景。角蛋白酶是一种诱导酶，只有当环境中出现诱导子(角蛋白)时才会合成。目前已发现30余种微生物可分泌角蛋白酶，这些微生物主要来自于真菌、放线菌和细菌。人们对分泌角蛋白酶的真菌研究较早，其中多数为皮肤类真菌，包括须癣毛癣菌(Trichophyton men tagrophytes)lif {Dora tomyces microsporus )、会工@毛癖菌(Trichophyton rubrum)等；丝状真菌如拟青霉Fl和Al等。宇佐美曲霉菌株usamii M1223在工业上用于生产酸性蛋白酶,通过添加诱导剂可发酵生产角蛋白酶。
发明内容
本发明的目的是提供一种产角蛋白酶的宇佐美曲霉及其发酵产酶方法。该菌株分类命名为宇佐美曲霉，现保藏在位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号的中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC N0.5335，保藏日期为2011年10月12日。
与其他方法相比，用该方法发酵生产角蛋白酶的原料更廉价易得，发酵方法简单。通过本发明的方法生产的角蛋白酶最适温度为50°C，最适pH为6，酶活可达到4.4U/mL。通过添加诱导剂产角蛋白酶的宇佐美曲霉菌株usamii M1223发酵产酶方法如下:
1.斜面种子培养:
将宇佐美曲霉接种到察氏斜面培养基上，于25-35°C培养48-240小时，收集斜面表面的孢子制成甘油管悬液-20°C保存并计数。察氏斜面培养基成分为:蔗糖30g, NaNO3 2g，K2HPO4 lg，MgSO4.7H20 0.5g，KCl0.5g，FeSO4.7H20 0.0lg，琼脂 20g，加水至 IOOOmL ;调节 pH 至 7.0-7.2。2.摇瓶发酵培养:将孢子悬液以10(Γ2000个/mL发酵培养基的终浓度接种发酵培养基；将发酵摇瓶在26-37°C，200rpm条件下培养2-7天。发酵液离心，取上清即为粗酶液。发酵培养基成分如下:每IOOOmL培养基中含有羽毛10_20g，玉米粉10_20g，热豆饼粉10-20g，磷酸氢二钠2-4g，氯化铵5-10g，氯化钙5-10g。3.粗酶性质:(I)以角蛋白为作用底物，该酶最适作用温度为50°c，最适作用pH为6.0。(2)最适作用条件下,酶活性达到4.4 U/ml。
有益效果
1.本发明能够通过添加诱导底物将原先产酸性蛋白酶的宇佐美曲霉诱导产生角蛋白酶，具有生产过程简单、成本低，无污染的优点；
2.扩大了角蛋白废弃物的生物降解范围，为多种角蛋白废弃物的降解提供了一种优良菌株；
3.本发明的发酵过程中利用环境废弃物的各种羽毛作为底物，在生产过程中不仅能产生角蛋白酶，还能环保，降解产物还能作为生物资源再次利用，既经济又环保；
4.本发明中的菌株所产角蛋白酶活性高且稳定，适合应用于工业生产。
具体实施方式
实施例1:诱导发酵产角蛋白酶及角蛋白酶的酶活测定
1.将宇佐美曲霉接种到察氏斜面培养基上，于30°C培养7天，收集斜面表面的孢子制成甘油管悬液-20°C保存并计数。察氏斜面培养基成分为:蔗糖30g, NaNO3 2g，K2HPO4 lg, MgSO4.7H20 0.5g，KCl
0.5g，FeSO4.7H20 0.0lg，琼脂 20g，水 IOOOmL ;调节 pH 至 7.0。2.将孢子悬液以1000个/mL发酵培养基的终浓度接种发酵培养基。发酵培养基成分如下:羽毛20g，玉米粉10g，热豆饼粉20g，磷酸氢二钠4g，氯化铵IOg,氯化|丐5g。3.将发酵摇瓶在30°C，200rpm条件下培养7天。4.发酵液离心，取上清即为粗酶液。5.角蛋白酶测定方法:取200μ L适当稀释的粗酶液，加入300μ L的1%角蛋白溶液底物，50°C反应30min，加入500 μ L4M TCA溶液终止反应，离心取200 μ L上清，依次加入ImL 0.5Μ Na2CO3和200 μ L福林酚试剂使用液后于40°C水浴显色20min，在680nm处检测
吸光值。角蛋白酶酶活定义为:lmL粗酶液在上述条件下，每分钟降解底物释放I μ g酪氨酸定义为一个酶活单位，以U/mL表示。6.酸性蛋白酶酶活的测定采用国标工业用蛋白酶制剂测定方法(QB1805.3-93)。酸性蛋白酶酶活单位的定义:1 mL液体酶，于40°C、pH3.0的条件下，每分钟水解酪蛋白产生I微克酪氨酸，即为I个酶活力单位，以U/mL表示。经分析原产酸性蛋白酶发酵液的酸性蛋白酶酶活为5000U/mL，角蛋白酶活力为
1.2 U/mL，使用本方法所用培养基后发酵液对酪蛋白底物降解活性为670U/mL，而角蛋白酶活可以达到4.4U/mL。实施例2:角蛋白酶酶学性质
在4(T60°C条件下测定酶活，得到最适作用温度为50°C，在pH2-lI条件下测定酶活，得到最适作用pH为6.0。SDS-凝胶电泳分析，角蛋白酶分子量大小为45KD。
权利要求
1.一种产角蛋白酶的宇佐美曲霉突变菌株,分类命名为Α5/76 Τ^777 5.5/7.，现保藏在位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号的中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC N0.5335，保藏日期为2011年10月12日。
2.一种利用原产酸性蛋白酶的宇佐美曲霉菌株通过诱导产角蛋白酶的发酵方法，其特征在于: (I)将孢子悬液以10(Γ2000个/mL发酵培养基的终浓度接种发酵培养基,发酵培养基成分如下:每IOOOmL培养基中含有羽毛10-20g，玉米粉10_20g，热豆饼粉10_20g，磷酸氢二钠2-4g，氯化铵5-10g，氯化钙5-10g ； (2 )将发酵摇瓶在26-37 °C，200rpm条件下培养2 7天。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:通过本发明的方法生产的角蛋白酶最适温度为50°C，最适pH为6.0，酶活`可达到4.4U/mL。
全文摘要
本发明的目的是提供一种产角蛋白酶的宇佐美曲霉及其发酵产酶方法。与其他方法相比，用该方法发酵生产角蛋白酶的原料更廉价易得，发酵方法简单。
文档编号C12N1/14GK103146587SQ20131009349
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月22日 优先权日2013年3月22日 公开号201310093491.发明者史劲松, 张旦旦, 王月, 李恒, 钱建瑛, 许正宏 申请人:江南大学