专利名称：基于液相芯片检测传染性造血器官坏死病毒的方法
技术领域：
本发明涉及辅助鉴定传染性造血器官坏死病毒的引物对、引物探针组合物以及它们的应用，具体涉及基于液相芯片检测传染性造血器官坏死病毒的方法。
背景技术：
传染性造血器官坏死症(IHN)是被列为《中华人民共和国进境动物一、二类传染病、寄生虫病名录》的二类传染病，是《中华人民共和国动物防疫法》规定的三类疫病，是国际兽疫局OIE名录中的重要疫病。
鱼传染性造血器官坏死症是由传染性造血器官坏死病毒(IHNV)引起的。IHNV为RNA病毒，是弹状病毒科成员，大约120-180nm长。IHNV可侵害多种海水和淡水养殖鱼类，在欧、美、日、韩及部分亚洲国家流行，可通过鱼体及所产卵、精液、尿、粪便以及污染的饲料、水等传播，对养殖场造成致命打击，危害非常严重。
目前鱼类病毒的检测方法主要包括细胞学诊断技术、免疫学诊断技术、分子生物学诊断技术三大类。细胞学诊断技术主要包括采用细胞培养分离病毒、组织病理切片及电镜观察，其操作繁琐、检测周期长、且灵敏度低。免疫学诊断技术主要包括免疫荧光检测、免疫点杂交，具有特异性强、敏感性高的优点，但步骤相当繁琐，不适宜对大量样品进行检测。分子生物学诊断技术主要包括聚合酶链式反应(PCR)，快速、灵敏，但是需要进行琼脂糖凝胶电泳并通过溴化乙锭染色观察结果，溴化乙锭是致癌物，对人体和环境有危害，交叉污染问题比较严重。发明内容
本发明的目的是提供辅助鉴定传染性造血器官坏死症病毒的引物对、引物探针组合物以及它们的应用，具体涉及基于液相芯片检测传染性造血器官坏死病毒的方法。
本发明提供的辅助鉴定传染性造血器官坏死病毒的特异引物对，由序列表的序列I所示的单链DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA分子组成。
本发明还提供了辅助鉴定传染性造血器官坏死病毒的引物探针组合物，由所述特异引物对和探针Tl组成；所述探针Tl的核苷酸序列如序列表的序列3所示。
所述特异引物对或所述引物探针组合物可用于制备辅助鉴定传染性造血器官坏死病毒的试剂盒。
所述特异引物 对或所述引物探针组合物可用于辅助鉴定传染性造血器官坏死病毒。
本发明还保护一种辅助鉴定传染性造血器官坏死病毒的试剂盒，包括所述特异引物对或所述弓I物探针组合物。
本发明还保护一种辅助鉴定传染性造血器官坏死病毒的方法，包括如下步骤:以待测病毒的总RNA为模板，用所述特异引物对进行RT-PCR扩增；如果所述RT-PCR扩增得到了扩增产物，待测病毒为候选的传染性造血器官坏死病毒；如果所述RT-PCR扩增没有得到扩增产物，待测病毒为候选的非传染性造血器官坏死病毒。所述扩增产物的大小可为100-250bp之间，具体可为126bp。所述待测病毒可为传染性造血器官坏死病毒、病毒性出血性败血症病毒、鲤春病毒血症病毒、传染性胰脏坏死病病毒或病毒性神经坏死病病毒。本发明还保护另一种辅助鉴定传染性造血器官坏死病毒的方法，包括如下步骤:以待测病毒的总RNA为模板，用所述特异引物对进行RT-PCR扩增后与所述探针Tl进行杂交，如果杂交结果为阳性待测病毒为候选的传染性造血器官坏死病毒，如果杂交结果为阴性待测病毒为候选的非传染性造血器官坏死病毒。所述待测病毒可为传染性造血器官坏死病毒、病毒性出血性败血症病毒、鲤春病毒血症病毒、传染性胰脏坏死病病毒或病毒性神经坏死病病毒。所述辅助鉴定传染性造血器官坏死病毒的方法具体包括如下步骤(液相芯片法):(1)以待测病毒的总RNA为模板，用所述特异引物对进行RT-PCR扩增；(2)制备微球悬液①将表面羧基化的荧光编码微球漩涡振荡20s，取75 μ L (约含3 X 1O6个微球)置于1.5mL离心管中，1OOOOg离心1min,弃上清；②在步骤①的离心管中加入50 μ L0.lmol/L N-甲基咪唑水溶液(ρΗ4.5)，漩涡混合，超声波处理30-60秒(400W的功率，每超声9秒停6秒)；③在步骤②的离心管中加入1.0nmol所述探针Tl，漩涡混合；④在步骤③的离心管中加入2.5 μ L碳二亚胺溶液(碳二亚胺溶液的制备方法:将IOmg碳二亚胺粉末加入1.0mL的灭菌纯水，现用现配)充分混匀，室温避光孵育30min ；⑤在步骤④的离心管中加入2.5μ L碳二亚胺溶液(碳二亚胺溶液的制备方法同上)充分混匀，室温避光孵育30min ；⑥在步骤⑤的离心管中加入1.0mL0.02g/100mL Tween-20水溶液，混匀，1OOOOg离心1min,弃上清；⑦在步骤⑥的离心管中加入1.0mL0.1g/1OOmL SDS水溶液，混匀，1OOOOg离心1min,弃上清；⑧在步骤⑦的离心管中加入100 μ L0.lmol/L N-甲基咪唑水溶液(pH4.5)，重悬，得到微球悬液；(3)将步骤(1)的产物和步骤(2)得到的微球悬液进行杂交即为实验组，用TE缓冲液代替步骤(1)的产物即为对照组；将杂交体系混合均匀后于98°C变性lOmin，然后在与杂交温度相同的温度下孵育15min，18000g离心2min，弃上清；然后加入50 μ L用1 X TMAC杂交液稀释至500倍体积的SA-PE，48°C -54°C (优选为52°C)杂交15min，18000g离心2min，弃上清；然后加入50 μ L1 X TMAC杂交液，漩涡混合使微球重悬，置于BD FACSArray液相芯片仪中进行分析；如果LQRR ≥ 3，检测结果为阳性；如果LQRR < 2，检测结果为阴性；LQRR=MFIS/MFIB, MFIS为实验组的荧光强度中位值，MFIB为对照组的荧光强度中位值。RT-PCR 扩增的反应程序:50 °C 30min ；94 °C 2min ；94 °C 30sec、58 °C 30sec、72°C 30sec,30 个循环；72°C延伸 5min ;4°C保温。液相芯片是一种新型快速检测技术，集流式细胞术、纳米荧光微球、荧光信号数字处理和传统化学发光技术为一体，具有所需样本量少、检测周期短的优点。采用本发明提供的特异引物对鉴定传染性造血器官坏死病毒具有良好的特异性。采用本发明提供的引物探针组合物结合液相芯片鉴定传染性造血器官坏死病毒，除了良好的特异性外，还具有灵敏度高、操作简便、所需时间短、不污染环境、不存在对人的健康威胁，可以进行高通量检测的优点。本发明非常适合对进出境水生动物进行检测。
图1为实施例2中的电泳图。
图2为杂交温度为52°C时，BD FACSArray液相芯片仪的输出图谱。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
N-甲基咪唑(TE)、碳二亚胺购置美国BD公司。DL2000marker购于大连宝生物公司。RNA 提取试剂盒(TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver4.0):大连宝生物公司，货号为DV819A。RT-PCR试剂盒(PrimeScript RT-PCR Kit):大连宝生物公司，货号为DRR014S。表面羧基化的荧光编码微球:美国BD公司，货号为558578。TMAC(temtrameihyl-ammdnium chloride):美国Sigma公司，货号为87718 ;按照产品说明书配制1父丁祖(:杂交液和1.5\丁祖(:杂交液。SA-PE (链霉菌抗生物素蛋白一藻红蛋白):美国Sigma公司，货号为S6940。Alphamager 2200凝胶成像系统:美国AP公司。梯度PCR扩增仪(Eppendorf Mastercycler Gradi ent):德国 Eppendorf 公司。BD FACSArray 液相芯片仪:美国BD公司。
传染性造血器官坏死病毒(IHNV)，RNA病毒:参考文献:岳志芹；刘荭；梁成珠等实时定量RT-PCR检测鱼类传染性造血器官坏死病毒方法的建立与应用[J].水生生物学报.2008 (01)。
病毒性出血性败血症病毒(VHSV)，RNA病毒，参考文献:悅穗；余晓巍；王建平等；应用巢式逆转录聚合酶链反应检测鱼类病毒性出血性败血症病毒(VHSV) [J]海洋与湖沼2009(07)。
鲤春病毒血症病毒(SVCV)，RNA病毒，参考文献:付峰；刘荭；黄佳；蔡生力鲤春病毒血症病毒(SVCV)的研究进展[J]中国水产科学.2006 (02)。
传染性胰脏坏死病病毒(IPNV)，RNA病毒，参考文献:徐晔；段宏安；周毅实时荧光定量RT-PCR检测鱼类传染性胰脏坏死病病毒方法的建立安徽农业科学2011 (11)。
病毒性神经坏死病病毒(VNNV)，RNA病毒，参考文献:刘荭；史秀杰；高隆英等.鱼病毒性神经坏死病病毒(VNNV)不同基因型鉴别方法的建立及在VNN检疫和监测中的应用.[J]水产学报2004(06)。
实施例1、特异引物对和特异探针的设计
通过大量序列比对和扩增效果比较，设计用于扩增传染性造血器官坏死症病毒的特异引物对和特异探针。
特异引物对如下(靶序列为126bp):
Fl (序列表的序列 I):5’ -ACGGAGTATCGTCCCAGTA-3’ ；Rl (序列表的序列 2):5’ -GAGGCTCAATGCCTTTCT-3’。特异探针的核苷酸序列(序列表的序列3)如下:5’ -TCCTCCGACTTGACTCACCGC-3’。实施例2、应用特异引物对辅助鉴定传染性造血器官坏死症病毒分别将传染性造血器官坏死病毒、病毒性出血性败血症病毒、鲤春病毒血症病毒、传染性胰脏坏死病病毒和病毒性神经坏死病病毒作为待测病毒进行如下实验:1、采用RNA提取试剂盒提取待测病毒的总RNA。2、以步骤I得到的总RNA为模板，采用Fl和Rl组成的引物对，采用RT-PCR试剂盒，在梯度PCR扩增仪上进行RT-PCR扩增，得到RT-PCR扩增产物。RT-PCR扩增的反应体系:在0.2mL PCR反应管中，依次加入10 X RT-PCRbuffer2.5 μ L、dNTP(各 2.5mmol/L)2.5 μ L、IOpmoI / μ L F10.5 μ L、IOpmoI / μ L RI0.5 μ L、Inhibiter0.5μ L、AMV XL0.5μ L, AMV Taq (5U/μ L) 0.5 μ L、25mmol/L MgCl25.0 μ L、总RNA3.0μ L (约300ng)，加入双蒸水使反应体积达到25 μ L。以上反应体系中，除了引物、总RNA和双蒸水，其它组分均为RT-PCR试剂盒的组分。RT-PCR 扩增的反应程序:50 °C 30min ；94 °C 2min ；94 °C 30sec、58 °C 30sec、72°C 30sec,30 个循环；72°C延伸 5min ;4°C保温。3、将步骤2得到的RT-PCR扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳。电泳图见图1，泳道I至泳道5依次为病毒性出血性败血症病毒、鲤春病毒血症病毒、传染性胰脏坏死病病毒、传染性造血器官坏死病毒和病毒性神经坏死病病毒，泳道M为DL2000markero以传染性造血器官坏死病毒的总RNA为模板，采用Fl和Rl组成的引物对进行RT-PCR，得到了大小在100-250bp之间扩增产物，其它四种病毒均未得到任何扩增产物。将传染性造血器官坏死病毒的扩增产物进行测序，测序结果表明，扩增产物的大小为126bp。实施例3、应用引物探针组合物辅助鉴定传染性造血器官坏死病毒一、引物和探针的制备制备如下引物和探针:F2:5’ -biotin-ACGGAGTATCGTCCCAGTA-3’ ；R2:5’ -biotin-GAGGCTCAATGCCTTTCT-3’。探针T1: 5，-NH2-TCCTCCGACTTGACTCACCGC-3 ’。F2是在Fl的5’末端进行生物素标记得到的，R2是在Rl的5’末端进行生物素标记得到的。探针Tl是在序列表的序列3所示单链DNA片段的5’末端进行氨基化修饰得到的。二、液相芯片检测体系的建立1、采用RNA提取试剂盒提取传染性造血器官坏死病毒的总RNA。2、以步骤I得到的总RNA为模板，采用F2和R2组成的引物对，采用RT-PCR试剂盒，在梯度PCR扩增仪上进行RT-PCR扩增，得到RT-PCR扩增产物。RT-PCR扩增的反应体系:在0.2mL PCR反应管中，依次加入10 X RT-PCRbuffer2.5 μ L、dNTP(各 2.5mmol/L)2.5 μ L、IOpmoI / μ L F20.5 μ L、IOpmoI / μ L R20.5 μ L、Inhibiter0.5μ L、AMV XL0.5 μ L、AMV Taq (5U/μ L) 0.5 μ L、25mmol/L MgCl25.0 μ L、总RNA3.Ομ L (约300ng)，加入双蒸水使反应体积达到25 μ L。以上反应体系中，除了引物、总RNA和双蒸水，其它组分均为RT-PCR试剂盒的组分。
RT-PCR 扩增的反应程序:50 °C 30min ；94 °C 2min ；94 °C 30sec、58 °C 30sec、72°C 30sec,30 个循环；72°C延伸 5min ;4°C保温。
3、寡核苷酸探针与微球共价偶联
①将表面羧基化的荧光编码微球漩涡振荡20s以使其充分分散，取75 μ L (约含3 X IO6个微球)置于1.5mL离心管中，IOOOOg离心lmin，弃上清。
②在步骤①的离心管中加入50 μ L0.lmol/L N-甲基咪唑水溶液(pH4.5)，漩涡混合，超声波处理30-60秒(400W的功率，每超声9秒停6秒)。
③在步骤②的离心管中加入1.0nmol探针Tl，漩涡混合。
④在步骤③的离心管中加入2.5 μ L碳二亚胺溶液(碳二亚胺溶液的制备方法:将IOmg碳二亚胺粉末加入1.0mL的灭菌纯水，现用现配)充分混匀，室温避光孵育30min。
⑤在步骤④的离心管中加入2.5μ L碳二亚胺溶液(碳二亚胺溶液的制备方法同上)充分混匀，室温避光孵育30min。
⑥在步骤⑥的离心管中加入1.0mL0.02g/100mL Tween-20水溶液，混匀，IOOOOg离心lmin,弃上清。
⑦在步骤⑤的离心管中加入1.0mL0.1g/1OOmL SDS水溶液，混匀，IOOOOg离心lmin,弃上清。
⑧在步骤⑦的离心管中加入100 μ L0.lmol/L N-甲基咪唑水溶液(pH4.5)，重悬微球(探针已偶联至微球表面)，得到微球悬液，2-8°C避光保存，待用。
4、杂交
实验组的杂交体系:由1.5 μ L步骤3得到的微球悬液、33 μ L1.5 X TMAC杂交液、9 μ L TE缓冲液和8 μ L步骤2得到的RT-PCR扩增产物(即25微升RT-PCR扩增产物的二十五分之八)组成。
空白对照组的杂交体系:用等体积的TE缓冲液代替RT-PCR扩增产物，其它同实验组的杂交体系。
将杂交体系混合均匀后于98°C变性lOmin，然后在与杂交温度相同的温度下孵育15min，18000g离心2mi n，弃上清；然后加入50 μ L用IXTMAC杂交液稀释至500倍体积的SA-PE，选定温度下杂交15min (分别采用481:、501:、521:、541:或561:的杂交温度)，18000g离心2min，弃上清；然后加入50 μ LI X TMAC杂交液，漩涡混合使微球重悬，置于BDFACSArray液相芯片仪中进行分析。
每个杂交温度的实验组设置三个重复处理，每个杂交温度的空白对照组设置三个重复处理。
每个重复处理中:参与计数的荧光编码微球均在100个以上，表明用于计算的荧光编码微球数量有效，所产生的荧光强度中位值(MFI)可信；3个空白对照组的荧光编码微球的MFI值均小于500，试验可进行结果判断。
采用48 °C的杂交温度，对照组处理的MFI为258，实验组处理的MFI为3167±11.7。
采用50 °C的杂交温度，对照组处理的MFI为269，实验组处理的MFI为3193±15.9。采用52 °C的杂交温度，对照组处理的MFI为263，实验组处理的MFI为3306±26.1。采用54 °C的杂交温度，对照组处理的MFI为267，实验组处理的MFI为2891±19.9。采用56 °C的杂交温度，对照组处理的MFI为266，实验组处理的MFI为1287±28.6。结果表明:采用48°C _54°C的杂交温度，实验组处理的MFI变动幅度不大，采用高于54°C的杂交温度时，实验组处理的MFI下降剧烈，最佳杂交温度为52°C。杂交温度为52°C时，BD FACSArray液相芯片仪的输出图谱见图2。图2中:A:荧光编码微球的数量及范围:采用52°C的杂交温度，实验处理组在Red-A、YelloW-A通道下的相对荧光强度； C:采用52°C的杂交温度，实验处理组在Red-A通道下相对荧光强度；D:采用52°C的杂交温度，实验处理组在Yellow-A通道下相对荧光强度。从图2可以观察到，偶联在微球上的探针Tl与传染性造血器官坏死病毒的RT-PCR扩增产物在Red-A、Yel1w-A检测通道下均有荧光信号，表明液相芯片构建成功。三、液相芯片检测体系重复性验证重复进行三次步骤二，杂交温度均采用52°C，计算各批次间检测得到的MFI的变异系数。结果显示，变异系数在6.7%以内，表明步骤二的方法具有良好的可重复性。四、液相芯片检测体系的特异性验证分别将传染性造血器官坏死病毒、病毒性出血性败血症病毒、鲤春病毒血症病毒、传染性胰脏坏死病病毒和病毒性神经坏死病病毒作为待测病毒进行步骤二，杂交温度均采用52°C，结果见表I。表I特异性检测结果
Imfi~
IHNV 3291+21.5+
IPNV 99 + 4.8~
VHSV 190 + 5.7~
SVCV 205 + 9.4~
VNNV 186 + 3.7~
MFIB 264~结果表明，步骤二的方法对传染性造血器官坏死病毒的检测结果为阳性，而对其它四种病毒的检测结果均为阴性，具有很好的特异性。五、液相芯片检测体系灵敏度验证
1、采用RNA提取试剂盒提取传染性造血器官坏死病毒的总RNA。
2、以步骤I得到的总RNA为模板，采用F2和R2组成的弓I物对，采用RT-PCR试剂盒，在梯度PCR扩增仪上进行RT-PCR扩增，得到RT-PCR扩增产物。
RT-PCR扩增的反应体系:在0.2mL PCR反应管中，依次加入10 X RT-PCRbuffer2.5 μ L、dNTP(各 2.5mmol/L)2.5 μ L、IOpmoI / μ L F20.5 μ L、IOpmoI / μ L R20.5 μ L、Inhibiter0.5μ L、AMV XL0.5 μ L、AMV Taq (5U/μ L) 0.5 μ L、25mmol/L MgCl25.0 μ L、总RNA3.0 μ L (含约 31.25ng、3.125ng、312.5pg、31.25pg、3.125pg、312.5fg、31.25fg 或3.125fg RNA)，加入双蒸水使反应体积达到25 μ L。以上反应体系中，除了引物、总RNA和双蒸水，其它组分均为RT-PCR试剂盒的组分。
RT-PCR 扩增的反应程序:50 °C 30min ；94 °C 2min ；94 °C 30sec、58 °C 30sec、72°C 30sec,30 个循环；72°C延伸 5min ;4°C保温。
3、寡核苷酸探针与微球共价偶联
同步骤二的3。
4、杂交
同步骤二的4。杂交温度采用52°C。
结果见表2,最低检测限为lOOpg。
表2灵敏度检测结果
权利要求
1.辅助鉴定传染性造血器官坏死病毒的特异引物对，由序列表的序列I所示的单链DNA分子和序列表的序列2所不的单链DNA分子组成。
2.辅助鉴定传染性造血器官坏死病毒的引物探针组合物，由权利要求1所述特异引物对和探针Tl组成；所述探针Tl的核苷酸序列如序列表的序列3所示。
3.权利要求1所述特异引物对或权利要求2所述引物探针组合物在制备辅助鉴定传染性造血器官坏死病毒的试剂盒中的应用。
4.权利要求1所述特异引物对或权利要求2所述引物探针组合物在辅助鉴定传染性造血器官坏死病毒中的应用。
5.辅助鉴定传染性造血器官坏死病毒的试剂盒，包括权利要求1所述特异引物对或权利要求2所述引物探针组合物。
6.一种辅助鉴定传染性造血器官坏死病毒的方法，包括如下步骤:以待测病毒的总RNA为模板，用权利要求1所述特异引物对进行RT-PCR扩增；如果所述RT-PCR扩增得到了扩增产物，待测病毒为候选的传染性造血器官坏死病毒；如果所述RT-PCR扩增没有得到扩增产物，待测病毒为候选的非传染性造血器官坏死病毒。
7.一种辅助鉴定传染性造血器官坏死病毒的方法，包括如下步骤:以待测病毒的总RNA为模板，用权利要求1所述特异引物对进行RT-PCR扩增后与权利要求2所述引物探针组合物中的探针Tl进 行杂交，如果杂交结果为阳性待测病毒为候选的传染性造血器官坏死病毒，如果杂交结果为阴性待测病毒为候选的非传染性造血器官坏死病毒。
全文摘要
本发明公开了一种基于液相芯片检测传染性造血器官坏死病毒的方法。本发明提供了辅助鉴定传染性造血器官坏死病毒的特异引物对，由序列表的序列1所示的单链DNA分子和序列表的序列2所示的单链DNA分子组成。本发明还保护辅助鉴定传染性造血器官坏死病毒的引物探针组合物，由所述特异引物对和探针T1组成；所述探针T1的核苷酸序列如序列表的序列3所示。采用本发明提供的特异引物对鉴定传染性造血器官坏死病毒具有良好的特异性。采用本发明提供的引物探针组合物结合液相芯片鉴定传染性造血器官坏死病毒，具有特异性好、灵敏度高、操作简便、所需时间短、不污染环境、不存在对人的健康威胁，可以进行高通量检测的优点。
文档编号C12Q1/70GK103173569SQ201310116510
公开日2013年6月26日 申请日期2013年4月3日 优先权日2013年4月3日
发明者尹伟力, 郑小龙, 方绍庆, 贾鹏, 刘宁, 王颖 申请人:山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心