猪流行性腹泻病毒rt-pcr鉴别诊断试剂盒及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种猪流行性腹泻病毒RT-PCR鉴别诊断试剂盒，所述试剂盒包含：针对PEDV弱毒疫苗株ORF3基因第245～294位核苷酸序列缺失区设计的一对引物，该对引物的上下游引物分别位于所述ORF3基因缺失区两端的保守区。本发明基于ORF3基因的猪流行性腹泻病毒RT-PCR鉴别诊断试剂盒，具有特异性强、灵敏性高的特点，不仅能快速检测出仔猪腹泻腹泻样品中是否存在PEDV，而且还能快速、准确地区分自然感染野毒株和弱毒疫苗毒株，对于猪流行性腹泻病的早期快速诊断和防控具有重要意义。
【专利说明】猪流行性腹泻病毒RT-PCR鉴别诊断试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及猪流行性腹泻病毒感染检测【技术领域】，具体涉及一种猪流行性腹泻病 毒RT-PCR鉴别诊断试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002] 猪流行性腹泻病（Porcine epidemic diarrhea, PED)在欧洲和亚洲一些养猪业 发达的国家都曾有相关报道，是一种危害较为严重的传染病。最近两年来在我国部分养猪 场再度爆发了以未断奶仔猪发生水样腹泻、呕吐和高死亡率为特征仔猪腹泻疫情，该病以 7日龄内仔猪发病为主，病程急、传播迅速、仔猪死亡率高，而且在同一猪场易呈反复发作， 曾一度造成部分猪场出现阶段性产房无仔的严重局面，给养猪业带来了重大的经济损失。 在对发生仔猪腹泻疫情的临床样品检测时发现猪流行性腹泻病毒（PEDV)的阳性检出率很 高，推测PEDV是此次腹泻疫情主要病因之一。疫苗免疫是控制疫情的首选，韩国、日本等已 经将弱毒疫苗用于该病的预防控制，国内也有一些猪场在使用弱毒疫苗，在临床上如何区 分疫苗免疫与自然感染毒株，对仔猪腹泻疫情进行有效地预警具有重要意义。
[0003] 对于PEDV感染的诊断方法已有多种，如对采集的临床样品进行处理后，利用病毒 适应性细胞进行病毒分离的方法；利用免疫胶体金试纸条直接检测样品中的病毒抗原；根 据PEDV病毒的保守性内部基因设计引物，利用RT-PCR的方法对病毒的基因进行检测等方 法。其中，病毒分离不仅耗时耗力，而且由于该病毒的特性难于细胞上进行分离培养，因此 不利于对疫情的及时诊断，后两种方法可以实现对病毒的及时、快速诊断，但是却不能很好 的满足对自然感染与疫苗免疫毒株进行鉴别诊断的需求。PEDV的0RF3基因位于S基因与 E基因之间，有研究认为冠状病毒0RF3编码的辅助蛋白具有离子通道的特性与病毒的释放 有关，0RF3基因沉默可以降低病毒在Vero细胞上的滴度。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决目前诊断PEDV感染的方法，不能实现对自然感染与疫苗免疫毒株 进行鉴别诊断的技术问题，提供一种猪流行性腹泻病毒RT-PCR鉴别诊断试剂盒，该试剂盒 特异性强、灵敏性高，可快速、准确地区分自然感染的野毒和弱毒疫苗免疫毒株，对于猪流 行性腹泻病毒疫情的早期快速诊断、防控、以及流行病学的全面监测具有重要意义。
[0005] 为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：
[0006] 在本发明的一个方面，提供了一种一种猪流行性腹泻病毒RT-PCR鉴别诊断试剂 盒，所述试剂盒包含：
[0007] 针对PEDV弱毒疫苗株0RF3基因第245?294位核苷酸序列缺失区设计的一对引 物，该对引物的上下游引物分别位于所述0RF3基因缺失区两端的保守区。
[0008] 优选的，所述上下游引物的序列如SEQ ID N0 :3和SEQ ID N0 :4所示。
[0009] 更优选的，所述引物的使用浓度为25mmol/L。
[0010] 所述试剂盒还包含：〇RF3基因第245?294位核苷酸序列没有发生缺失的PEDV野 毒株对照。
[0011] 所述试剂盒还包含：〇RF3基因第245?294位核苷酸序列发生缺失的PEDV弱毒 疫苗株对照。
[0012] 所述试剂盒还包含：RT-PCR反应缓冲液、反转录酶、聚合酶。
[0013] 优选的，所述试剂盒用于检测样品时的PCR退火温度为50°C。
[0014] 在本发明的另一方面，还提供了上述猪流行性腹泻病毒RT-PCR鉴别诊断试剂盒 在制备诊断猪流行性腹泻病的产品中的应用。
[0015] 在本发明的另一方面，还提供了上述猪流行性腹泻病毒RT-PCR鉴别诊断试剂盒 在制备区分PEDV弱毒疫苗株与自然感染野毒株的产品中的应用。
[0016] 本发明基于PEDV 0RF3基因的猪流行性腹泻病毒RT-PCR鉴别诊断试剂盒，具有特 异性强、灵敏性高的特点，不仅能快速检测出仔猪腹泻腹泻样品中是否存在PEDV，而且还能 快速、准确地区分自然感染野毒株和弱毒疫苗免疫毒株，可应用于猪流行性腹泻病的临床 诊断、分子流行病学调查等方面，对于猪流行性腹泻病的早期快速诊断和防控具有重要意 义。
【专利附图】
【附图说明】
[0017] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明。
[0018] 图1是本发明实施例1的PEDV流行毒株0RF3基因缺失区域核苷酸序列比较图；
[0019] 图2是本发明实施例1的基于0RF3基因序列建立的进化树图；
[0020] 图3是本发明实施例2确定RT-PCR最佳Tm值的结果图；
[0021] 图4是本发明实施例2确定RT-PCR最佳引物浓度的结果图；
[0022] 图5是本发明实施例3的RT-PCR特异性试验结果图；
[0023] 图6是本发明实施例4的RT-PCR方法敏感性鉴定结果图；
[0024] 图7是本发明实施例5临床样品的RT-PCR检测结果图。
【具体实施方式】
[0025] 下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验 指南》（萨姆布鲁克J，拉塞尔D W，著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础，等译.分子克隆实验指南， 第3版，北京：科学出版社，2002)中所述的方法进行。
[0026] 为了建立一种在临床上便于区分猪流行性腹泻病毒（PEDV)自然感染与疫苗免疫 毒株的方法。本发明根据目前使用的PEDV弱毒疫苗均为0RF3基因存在缺失的毒株，而能 引起自然感染发病的毒株0RF3基因没有发生缺失，研发出一种基于0RF3基因缺失区域的 猪流行性腹泻病毒RT-PCR鉴别诊断方法与试剂盒。本发明根据GenBank公布的PEDV 0RF3 基因序列，在其存在基因缺失区两端的保守区域设计特异性引物，对近两年采集的仔猪腹 泻样品进行检测，分析流行毒株的0RF3基因，选择部分阳性样品利用鉴定引物进行RT-PCR 扩增，优化其反应体系、Tm值等条件，进行鉴别诊断方法的特异性、敏感性试验，并对大量临 床样品进行检测验证。结果是，从新发仔猪腹泻临床样品中克隆获得了 11株PEDV的0RF3 基因，序列分析显示新分离的9株0RF3基因不存在缺失，属于自然感染野毒，其与疫苗株的 核苷酸同源性为95. 8%?97. 1%。建立的鉴别诊断方法可以特异性扩增PEDV的0RF3基 因，其中获得的PEDV自然感染毒株基因片段大小约300bp，而弱毒疫苗株则为250bp左右； 该鉴别诊断方法与其他猪源病毒无交叉扩增，其敏感性可达到l〇〇TCID5(l/0. lmL，对仔猪腹 泻临床样品检测结果显示，PEDV自然感染的阳性率为65.4%。因此，本发明基于PEDV0RF3 基因的RT-PCR鉴别诊断方法和试剂盒，可以用于区分自然感染的野毒和弱毒疫苗免疫毒 株，为PEDV的疫情诊断和流行病学监测提供了一种特异、快速、实用的检测方法和检测试 剂盒。
[0027] 下面通过具体实施例阐述本发明。
[0028] 材料：
[0029] 1.毒株与样品来源
[0030] PEDV毒株HLJ-1株和ZJCZ4株以及猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV HuN4株）、 猪传染性胃肠炎病毒（TGEV)、猪轮状病毒（PoRV)、猪瘟病毒（CFSV)由中国农业科学院上海 兽医研究所猪传染病研究室分离保存，11份已知PEDV阳性仔猪腹泻样品由中国农业科学 院上海兽医研究所猪传染病研究室鉴定并保存，26份未知仔猪腹泻样品2013年初采集自 上海。
[0031] 2.主要试剂
[0032] Taq DNA 聚合酶、DNA Marker、dNTP、pMD18-T 载体购自 TaKaRa 公司；RNA 提取试 剂盒 RNeasy Plus Mini Kit 购自 QIAGEN 公司；单链 cDNA 合成试剂盒 RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit购自Fermentas公司；感受态菌种DH5a由中国农业科学院 上海兽医研究所猪传染病研究室保存。
[0033] 实施例1仔猪腹泻样品的检测与流行毒株0RF3基因序列的分析
[0034] (1)引物设计
[0035] 根据PEDV ZJCZ-4(GenBank序列号JX524137)设计并合成一对扩增0RF3全基 因引物 0RF3-P1/0RF3-P2。参考 PEDV CV777(GenBank 序列号：AF353511)、ZJCZ-4 及疫 苗株DR13 (GenBank序列号：EU054930)的0RF3基因序列，设计并合成了 一对鉴定引物 0RF3-JD1/0RF3-JD2,鉴定引物位于0RF3缺失区（245nt?294nt)两端的保守区，其扩增范 围覆盖整个缺失区域。以上两对引物如表1所示，所有引物由上海英骏生物技术有限公司 合成。
[0036] 表1扩增PEDV 0RF3基因引物及鉴定引物
[0037]
【权利要求】
1. 一种猪流行性腹泻病毒RT-PCR鉴别诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含： 针对PEDV弱毒疫苗株0RF3基因第245?294位核苷酸序列缺失区设计的一对引物， 该对引物的上下游引物分别位于所述0RF3基因缺失区两端的保守区。
2. 根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒RT-PCR鉴别诊断试剂盒，其特征在于，所 述上下游引物的序列如SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4所示。
3. 根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒RT-PCR鉴别诊断试剂盒，其特征在于，所 述试剂盒还包含：〇RF3基因第245?294位核苷酸序列没有发生缺失的PEDV野毒株对照。
4. 根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒RT-PCR鉴别诊断试剂盒，其特征在于，所 述试剂盒还包含：〇RF3基因第245?294位核苷酸序列发生缺失的PEDV弱毒疫苗株对照。
5. 根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒RT-PCR鉴别诊断试剂盒，其特征在于，所 述试剂盒还包含：RT-PCR反应缓冲液、反转录酶、聚合酶。
6. 根据权利要求2所述的猪流行性腹泻病毒RT-PCR鉴别诊断试剂盒，其特征在于，所 述引物的使用浓度为25mmol/L。
7. 根据权利要求2所述的猪流行性腹泻病毒RT-PCR鉴别诊断试剂盒，其特征在于，所 述试剂盒用于检测样品时的PCR退火温度为50°C。
8. 权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒RT-PCR鉴别诊断试剂盒在制备诊断猪流行性 腹泻病的产品中的应用。
9. 权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒RT-PCR鉴别诊断试剂盒在制备区分PEDV弱毒 疫苗株与自然感染野毒株的产品中的应用。
【文档编号】C12Q1/70GK104152578SQ201310217682
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2013年6月3日 优先权日:2013年6月3日
【发明者】童光志, 周艳君, 吴玉璐 申请人:中国农业科学院上海兽医研究所