玉米转基因检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明是检测用品领域内的一种玉米转基因检测试剂盒，由引物组合和膜芯片组成，其特征在于引物组合为7重PCR引物组合，各对引物为Pat、Bar、Cry1Ab、Cry105、EPSPS、P35S和玉米内源基因序列Zein，膜芯片为顺序固定在支持膜表面的7组探针序列和一组阳性对照探针序列，分别为Pat探针、Bar探针、Cry1Ab探针、Cry105探针、EPSPS探针、P35S探针、Zein探针和Positive探针，引物组合中有非对称PCR扩增引物，为5’端带生物素标志（biotin）的Tag引物。本发明克服了现有技术费时费力成本高的缺陷，提供的玉米转基因检测试剂盒操作简单，快速灵敏，检测通量大，检测结果可视化，成本低廉。
【专利说明】玉米转基因检测试剂盒
所属【技术领域】
[0001]本发明涉及检测用品领域，具体为一种玉米转基因检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]转基因玉米和转基因大豆是目前全球最主要的转基因粮食作物。从1996年开始，抗虫和耐除草剂玉米开始在美国商业化种植，根据国际农业生物技术应用服务组织(ISAAA)资料显示，到2011年已有16个国家种植转基因玉米，其中5个国家种植面积超过100万公顷。2011年全球转基因玉米总种植面积已达到5100万公顷，占玉米总种植面积的32%。由于转基因产品在全球市场中的大量涌现，其环境和食品安全问题也引起国际性的高度关注。各国相继制定并出台了相应的法律法规，对转基因作物的环境释放和产品销售采取严格的管理措施。目前已有超过40个国家要求对转基因生物及其产品实施标识管理。我国于2001年5月23日发布了国务院第304号令《农业转基因生物安全管理条例》，实现了对转基因生物的规范管理，并于2002年3月20日起施行《农业转基因生物标识管理办法》，要求对包括转基因玉米和转基因大豆在内的5类转基因生物及其产品进行标识。因此，快速、准确、灵敏、廉价和相应通量的转基因产品检测技术是非常关键的。转基因产品的检测技术主要包括基于蛋白的检测方法和基于核酸的检测方法。酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫试纸条和Western杂交等方法是目前主要的基于蛋白的检测方法，其共同特点是需要通过一定的处理步骤从样品中释放出目标蛋白(抗原)，然后利用抗体特异性的结合抗原蛋白，最后通过酶标或金属标偶联抗体与抗原抗体复合物结合，从而产生可检测的信号，该类方法的缺点是检测灵敏度相对较低，并且需要制备高特异性抗体，同时检测容易受到多种因素的影响，出现假阳性。而基于核酸的检测方法是目前最普遍、最准确的转基因检测技术，检测方法主要包括PCR (聚合酶链式反应)技术和基于分子杂交的基因芯片技术。目前仍以PCR技术应用最为广泛，·其常用的技术方法包括普通定性PCR、巢式PCR、多重PCR、荧光定量PCR等方法。普通定性PCR方法检测效率低，尤其检测多基因对象时更加费时费力；巢式PCR虽然提高了检测的灵敏度，但同样存在检测效率的问题；多重PCR方法可以在一个反应中同时检测多个基因，但常规的电泳检测结果很难判断，容易出现假阳性和假阴性结果；荧光定量PCR方法灵敏度高，但其成本高，并且需要特殊检测仪器。基因芯片也是常用的转基因产品检测技术，目前一般采用玻璃片作为固相支持物，实验过程需要相应的点样仪和芯片识读仪，同样成本较高。因此研发一种快速、方便、灵敏、廉价、可视化和高通量的检测方法将具有非常好的应用前景。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是为了克服现有技术费时费力成本高的缺陷，提供一种操作简单，快速灵敏，检测通量大，检测结果可视化，成本低廉的玉米转基因检测试剂盒。
[0004]本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
本发明的玉米转基因检测试剂盒由引物组合和膜芯片组成，其特征在于引物组合为7重PCR引物组合，各对引物的碱基序列5’ -3’如下:
【权利要求】
1.一种玉米转基因检测试剂盒由引物组合和膜芯片组成，其特征在于引物组合为7重聚合酶链式反应(PCR)引物组合，各对引物的碱基序列5’ -3’如下:
2.根据权利要求1所述的玉米转基因检测试剂盒，其特征在于所述引物组合中有非对称PCR扩增引物，为5’端带生物素标志(biotin)的Tag引物，其碱基顺序如下所示: Tag 引物:biotin-5，-AGACGCCACCGCCAGCGTATTATCCGAGC C-3，。
3.根据权利要求1或2所述的玉米转基因检测试剂盒，其特征在于所述玉米转基因检测试剂盒由引物组合、膜芯片和辅料组成，辅料为脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、EX-Taq聚合酶(Polymerase)和5’端带生物素标志的阳性寡核苷酸单链DNA，5’端带生物素标志的阳性寡核苷酸单链DNA的碱基顺序为biotin-5’ -CTGGTACTTTGGAC
ACTCGTTCTTCTCGCACTGCTCATTATTGCTTCTGATCTGGATGC-3，。
4.根据权利要求3所述的玉米转基因检测试剂盒，其特征在于所述玉米转基因检测试剂盒由引物组合、膜芯片、辅料和配液组成，配液为IOXPCR缓冲液、预杂交液、杂交液、洗液、封闭液、链酶亲和素标记辣根过氧化物酶和四甲基联苯胺(TMB)显色液。
5.根据权利要求4所述的玉米转基因检测试剂盒，其特征在于所述预杂交液为5XSSC,0.1%重量百分比十二烷基磺酸钠和10XDenhardtJ s液，其中，SSC为0.75M氯化钠，0.075M柠檬酸钠，DenhardtJ s液为1% Ficoll聚蔗糖，1%聚乙烯吡咯烷酮，1%牛血清白蛋白；杂交液为5XSSC，0.1%重量百分比十二烷基磺酸钠，5XDenhardt’ s液，50%重量百分比去离子甲酰胺和100ug/ml酵母tRNA ;洗液分别为洗液1、洗液2、洗液3和洗液4，其中，洗液I为2XSSC和0.1%重量百分比十二烷基磺酸钠，洗液2为0.5XSSC和 0.1%重量百分比十二烷基磺酸钠，洗液3为100 mM(毫摩尔/升)Tris-HCl，PH7.5，150 mMNaCl,洗液 4 为 100 mMTris-HCl, PH9.5，100 mMNaCl 和 100 mM MgCl2 ;封闭液为 3% 重量百分比牛血清白蛋白，100 mMTris-HCl,PH7.5,150 mMNaCl ;四甲基联苯胺显色液由四甲基联苯胺显色液A液和四甲基联苯胺显色液B液使用前等量混合配成，其中，四甲基联苯胺显色液A液为200mM柠檬酸钠，PH5.4,0.2mg/ml四甲基联苯胺，四甲基联苯胺显色液B液为3%重量百分比的H2O2用800体积的双蒸水稀释液。
6.根据权利要求1所述的玉米转基因检测试剂盒，其特征在于所述支持膜为硝酸纤维素膜或尼龙膜。
【文档编号】C12Q1/68GK103589781SQ201310271719
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年7月2日 优先权日:2013年7月2日
【发明者】黄广平, 王勇强, 秦子苏 申请人:黄广平