进行凡纳滨对虾家系鉴定的多重微卫星鉴定体系及应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种快速高效进行凡纳滨对虾家系鉴定的多重微卫星鉴定体系，属于遗传育种中的分子辅助育种领域，具体地说，通过筛选多态性高的15个微卫星位点进行引物设计，根据引物退火温度和扩增产物长度分成两个引物体系，每一组内根据片段大小对引物进行不同的荧光标记，通过体系优化获得最佳扩增体系，进而通过该多重微卫星鉴定体系对候选父母本和子代进行微卫星分型，利用15个位点的分型数据进行家系鉴定，效率快，结果准确可靠,并且对于亲缘关系较近的家系也有很好的鉴定效果。
【专利说明】进行凡纳滨对虾家系鉴定的多重微卫星鉴定体系及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及遗传育种的分子辅助育种技术，具体的说是一种快速高效进行凡纳滨对虾家系鉴定的多重微卫星鉴定体系。
【背景技术】
[0002]凡纳滨对虾是我国乃至世界上养殖规模最大的虾类，其产量占世界对虾产量的60%,占我国对虾产量的80%，为了获得具有优异生产性状的养殖品种，各国科研人员纷纷开展凡纳滨对虾的选育工作，在选育过程中，了解准确的系谱信息对于减少近交、加快育种进程具有重要意义，因此，家系鉴定的工作引起科研人员的重视，王鸿霞等从10对多态性高的微卫星引物中选取6对引物对混养的家系进行鉴定，发现从20个候选雌虾中找到真正母亲的概率为88%，从30个候选雄虾中找到真正父亲的概率为78%，低于理论预测值(王鸿霞，吴长功，张留所，相建海，微卫星标记应用于凡纳滨对虾家系鉴别的研究.遗传2006，28(2):179-183)。王霞等使用7对多态性位点对选择育种过程中的6个家系进行鉴定，在不存在其他亲本干扰的情况下可以获得大于99%的鉴定准确率，若存在亲缘关系较近的亲本干扰，使用该7对微卫星进行家系鉴定的准确率将降低(王霞，刘小林，张继泉，张成松，黄皓，相建海，微卫星用于凡纳滨对虾育种过程中亲权分析及遗传多样性的变化监测.水产学报 2009，33 (5):832-839.)。
[0003]多重PCR是在同一体系中同时进行多个片段扩增的反应，使用多重PCR技术，多个微卫星位点可以在同一个反应中扩增，通过对不同长度的微卫星产物标记不同的荧光颜色，便可以同时对多个微卫星位点进行分型。这种高效、准确而成本低廉的微卫星分型体系在多种陆生生物和水产生物中均有使用(苗贵东，杜民，杨景峰，徐营，樊廷俊，陈松林:大菱鲆亲子鉴定的微卫星多重PCR技术建立及应用.中国海洋大学学报(自然科学版)2011(Z1):97-106.聂鸿涛，李琪，孔令锋:皱纹盘鲍微卫星多重PCR体系构建及其在家系鉴定中的应用.水产学报2013(02):207-215)，但是在凡纳滨对虾的家系鉴定中未见报道，同时由于可以对多个微卫星位点进行分析，多个位点的累计鉴定准确率提高，可以有效地提高鉴定准确率。因此本研究通过筛选高多态性的微卫星标记、构建多重PCR扩增引物组合、优化多重微卫星扩增体系、摸索多重微卫星扩增条件的方式建立用于快速高效进行凡纳滨对虾家系鉴定的多重微卫星扩增体系。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种快速高效进行凡纳滨对虾家系鉴定的多重微卫星鉴定体系，实现凡纳滨对虾家系的快速准确鉴定。
[0005]为实现以上目的，本发明采用的方案为:
[0006]一种快速高效进行凡纳滨对虾家系鉴定的多重微卫星鉴定体系，具体包括筛选高多态性微卫星位点组成多重微卫星扩增引物的组合和荧光标记，多重微卫星扩增体系和扩增温度的优化和确立。[0007]高多态微卫星位点的筛选，具体包括:根据文章ShrimpMap:A low-density,microsatellite-based linkage map of the pacific whiteleg shrimp, Litopenaeusvanname1:1dentification of sex-linked markers in linkage group4 和 A geneticlinkage map of Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei):sex~linkedmicrosatellite markers and high recombination rates 中公布的微卫星序列结合微卫星位点所属的连锁群，选择在不同连锁群上的具有较高多态性的位点27个。使用MFEprimer在线软件评价27个位点的引物相互之间是否产生二聚体或者发卡结构，同时考虑引物的最佳退火温度，根据上述两个因素可将15对引物分成体系I和体系2两个引物体系O[0008]所述的两个多重微卫星引物体系如下:[0009]多重微卫星引物体系I引物组合和荧光标记如下:[0010]LvMlF:6-FAM(羧基荧光素)_5’ -GATGACCTGCCTTTCTCTGC-3 ’[0011 ] LvMlR:5，-GGGAGAGATGATGGGAAGAAG-3，
[0012]LvM2F:R0X (羧基 X 罗丹明)~5，-ATGGCACAAATAGGATCTTG-3 ’
[0013]LvM2R: 5，-GACTGGAAGAGCACTGATTC-3，
[0014]LvM3F:HEX (六氯荧光素)~5，-ATACGAAACACCCCATCCC-3 ’
[0015]LvM3R: 5，-GTGGTCTTACCTCGTGGCTC-3，
[0016]LvM4F:TAMRA(羧基四甲基罗丹明)_5’ -AGCACCTAGCACTTGCTGAAC-3’
[0017]LvM4R: 5，-AGAGACTCACATCCTCATCCTC-3，
[0018]LvM5F:6_FAM (羧基荧光素)~5，-CATTGAAAACGGAATCCTCG-3 ’
[0019]LvM5R: 5，-GATATTCCCATCAACACAGCG-3，
[0020]LvM6F:ROX (羧基 X 罗丹明)_5 ’ -CACCAAAACGAACGAAACG-3 ’
[0021]LvM6R:5，-GGATAAAAACGAATTGTATACCG-3，LvM7F:HEX (六氯荧光素)-5，-GAGAGCAAATAAGAAAGGGC-3，
[0022]LvM7R:5’ -AGGATGCAAATGATAACGAG-3’
[0023]LvM8F:TAMRA (羧基四甲基罗丹明)-5’ -GGCACACTGTTTAGTCCTCG-3’
[0024]LvM8R:5， -CGAACAGAATGGCAGAGGAG-3，
[0025]LvM9F:6_FAM (羧基荧光素)~5，-CCCGACTTGGCTTTTAGTTG-3 ’
[0026]LvM9R:5， -GAGATTGCTATCCTCGGCTG-3，
[0027]LvMlOF:R0X (羧基 X 罗丹明)-5’ -GATCCTGCGAGTCACTTTATCTC-3 ’
[0028]LvMlOR:5’ -TTTATTGCGTATCCCAGAAGC-3’
[0029]引物体系I中10对引物的引物摩尔比例为:
[0030]LvMl: LvM2: LvM3: LvM4: LvM5: LvM6: LvM7: LvM8: LvM9: LvMlO =1:2:1:2:1:4:4:2:1:4[0031]多重微卫星引物体系2引物组合和荧光标记如下:[0032]LvMl IF:6_FAM (羧基荧光素)~5，-CCGCCATCATCATCAACA-3 ’[0033]LvMllR:5，-TCATTCGGGTTCGAGACTC-3，[0034]LvMl2F:R0X (羧基 X 罗丹明)_5’ -GATCATTCGCCCCTCTTTTT-3 ’[0035]LvM12R:5’ -ATCTACGGTTCGAGAGCAGA-3’[0036]LvMl3F:HEX (六氯荧光素)_5’ -GGACTCACACTTCTGGTTC-3 ’
[0037]LvM13R:5， -GGCTGCACCTTGTAAGTC-3’
[0038]LvM14F:TAMRA(羧基四甲基罗丹明)_5’ -TATGCTCGTTCCCTTTGCTT-3’
[0039]LvM14R:5， -TTGAAGGAAAAGTGTTGGGG-3’
[0040]LvMl5F:6_FAM(羧基荧光素)-5，-ACTAGTGGATCTGTCTATTCAT-3，
[0041]LvM15R:5’ -ATACCCACCCATGCATGTTA-3’
[0042]弓丨物体系2中5对引物的引物摩尔比例为
[0043]LvMll: LvMl2: LvMl3: LvM14: LvMl5 =1:2:1:1:2
[0044]所述的多重微卫星扩增体系如下:
[0045]多重微卫星引物体系I对应的扩增体系包括:3.125mM dNTP,4.375XHotstartBuffer (Takara),0.55 μ M引物体系I按比例混合后的正向引物，0.55 μ M引物体系I按比例混合后的反向引物，0.05U/ μ IHotstart Taq(Takara), 0.125 μ g/ μ I BSA, 5ng/ μ I 模板DNA。
[0046]多重微卫星引物体系2对应的扩增体系包括:3.125mM dNTP，4.375 XHotstartBuffer (Takara), 0.35 μ M引物体系2按比例混合后的正向引物，0.35 μ M引物体系2按比例混合后的反向引物,0.05U/ μ IHotstart Taq(Takara), 0.125 μ g/ μ IBSA，5ng/ μ I 模板 DNA。
[0047]所述的多重微卫星扩增温度如下:
[0048]体系IPCR扩增温度设置:94度变性4分钟；如下进行35个循环:94度变性30秒，55度退火30秒，68度延伸I分钟；68度延伸10分钟；4度保温。
[0049]体系2的PCR扩增温度设置如下:94度变性4分钟；如下进行35个循环:94度变性30秒，50度退火30秒，68度延伸I分钟；68度延伸10分钟；4度保温。
[0050]最优的引物体系I中10对引物的引物摩尔比例为:
[0051]LvMl: LvM2: LvM3: LvM4: LvM5: LvM6: LvM7: LvM8: LvM9: LvMlO =1:2:1:2:1:4:4:2:1:4;
[0052]最优的体系2中5对引物的引物比例为
[0053]LvMll: LvMl2: LvMl3: LvM14: LvMl5 = 1: 2:1:1: 2。
[0054]多重微卫星鉴定体系的使用方法如下:使用鉴定体系I和2分别对待鉴定的子代和候选亲本进行PCR扩增和微卫星分型，将分型获得的每个个体微卫星的片段长度大小导入Cervus软件进行家系鉴定分析，Cervus判定的父母本结果即为子代对应的父母本。
[0055]本发明所具有的优点:
[0056]1.通过两个多重微卫星扩增体系即可确定亲本和子代、子代与子代的亲缘关系，可以大大节约家系鉴定实验的时间和成本，有利于家系鉴定方法的大规模推广。
[0057]2.同时使用十五个高多态性的微卫星位点进行家系鉴定，可以解决之前使用较少微卫星鉴定准确率低的问题，并且适合亲缘关系较近的家系鉴别。
[0058]3.由于引物带有荧光标记，因此扩增的产物可以通过ABI系列的测序仪进行多重扩增微卫星分型，分型的结果准确可靠，适于批量化操作。
[0059]本发明通过筛选多态性高的15个微卫星位点进行引物设计，根据引物退火温度和扩增产物长度分成两个引物体系，每一组内根据片段大小对引物进行不同的荧光标记，通过体系优化获得最佳扩增体系，进而通过该多重微卫星鉴定体系对候选父母本和子代进行微卫星分型，利用15个位点的分型数据进行家系鉴定，效率快，结果准确可靠，并且对于亲缘关系较近的家系也有很好的鉴定效果。
【专利附图】
【附图说明】
[0060]图1为本发明体系I微卫星扩增后经ABI3130xl测序仪分型结果；
[0061]图2为本发明体系2微卫星扩增后经ABI3130xl测序仪分型结果。
【具体实施方式】
[0062]本发明首先选择多态性高的微卫星位点作为候选的位点，再根据每个微卫星位点的引物退火温度和引物之间的关系设置体系I和体系2两个多重微卫星扩增体系，优化每个体系PCR扩增各个组分含量和PCR扩增程序，使用最佳的多重微卫星扩增体系和程序对凡纳滨对虾个体进行多重微卫星扩增，再使用ABI3130xl测序仪对微卫星位点进行分型，使用Cervus软件进行家系鉴定。
[0063]1.根据文章 ShrimpMap:A low-density, microsatellite-based linkagemap of the pacific whiteleg shrimp， Litopenaeus vannamei !identification ofsex-linked markers in linkage group4 和 A genetic linkage map of Pacific whiteshrimp (Litopenaeus vannamei):sex-1 inked microsatelIite markers and highrecombination rates中公布的微卫形序列结合微卫星位点所属的连锁群,选择在不同连锁群上的具有较高多态性的位点27个。
[0064]2.使用MFEprimer在线软件评价27个位点的引物相互之间是否产生二聚体或者发卡结构，同时考虑引物的最佳退火温度，根据上述两个因素可将15对引物分成体系I和体系2两个引物组合体系，但是引物之间的比例需要进一步摸索。
[0065]3.使用温度梯度PCR摸索两组多重PCR体系的最佳退火温度，获得最佳的退火温度:高温组为55度，低温组为50度。由于在延伸温度为72度下扩增的产物亮度较低，因此尝试降低延伸温度，最终确定最佳的退火温度为68度。
[0066]4.对于每个多重微卫星扩增体系首先使用如下基本扩增组分比例进行预实验:
3.125mMdNTP，3.125 X Hotstart Buffer (Takara)，0.0I μ M 体系内各个引物的正向引物，Ο.ΟΙμΜ 体系内各个引物的反向引物，0.05υ/μ I Hotstart Taq (Takara)，0.125 μ g/μ IBSA，5ng/ μ I 模板 DNA。
[0067]根据扩增产物的亮度调整Buffer含量、dNTP含量，使得多重微卫星扩增体系中各个条带均能扩增。最后调整每个引物对的浓度使各个引物扩增的产物量基本一致。调整的依据是:根据各个引物的产物量调整，如果产物多则提高引物浓度，反之则降低引物浓度。最终获得两个体系的引物浓度比例为:
[0068]引物体系I中10对引物的最佳引物摩尔比例
[0069]LvMl: LvM2: LvM3: LvM4: LvM5: LvM6: LvM7: LvM8: LvM9: LvMlO =1:2:1:2:1:4:4:2:1:4
[0070]引物体系2中5对引物的最佳引物摩尔比例为
[0071]LvMll: LvMl2: LvMl3: LvM14: LvMl5 =1:2:1:1:2[0072]最佳扩增体系如下:
[0073]多重微卫星引物体系I对应的扩增体系包括:3.125mM dNTP,4.375XHotstartBuffer (Takara),0.55 μ M引物体系I按比例混合后的正向引物，0.55 μ M引物体系I按比例混合后的反向引物，0.05υ/μ I Hotstart Taq(Takara), 0.125 μ g/ μ I BSA, 5ng/ μ I 模板 DNA。
[0074]多重微卫星引物体系2对应的扩增体系包括:3.125mM dNTP,4.375XHotstartBuffer (Takara)，0.35 μ M引物体系2按比例混合后的正向引物，0.35 μ M引物体系2按比例混合后的反向引物，0.05υ/μ I Hotstart Taq (Takara), 0.125 μ g/ μ I BSA,5ng/ul 模板 DNA。
[0075]5.使用上述获得的多重微卫星分型体系和程序对候选父母本和子代进行PCR扩增，扩增产物经3130x1测序仪(Applied Biosystems)进行微卫星分型,使用Genmapper软件读取每个位点的分型数据，获得每个微卫星位点的片段，其中父母本的分型的数据结果如表格I显示。
[0076]6.数据转换成Cervus格式，Cervus根据候选父母本的微卫星分型信息和候选子代的分型信息进行家系鉴定分析，根据多个微卫星位点的组合信息按照95%置信区间确定对应的父母本。
[0077]实施例1:
[0078]利用上述快速高效进行凡纳滨对虾家系鉴定的方法对9个不同家系的232个子代和31个候选亲本进行亲权分析，该9个家系来自两个不同的选育群体，包含了亲缘关系较近的半同胞家系和亲缘关系较远的家系，而31个候选的亲本中包括真正亲本的全同胞个体，通过这种实验设置，可以验证该方法对于亲缘关系近的家系及其在存在亲本干扰情况的鉴定准确率。具体步骤如下:
[0079](一 )候选亲本和子代DNA的提取:
[0080]使用天根海洋动物基因组提取试剂盒提取候选亲本和子代的基因组DNA，稀释到50ng/ μ I 备用。
[0081]( 二)多重PCR扩增和基因分型:
[0082]使用多重PCR扩增体系对候选亲本和子代DNA进行PCR扩增。
[0083]多重微卫星引物体系I对应的扩增体系包括:3.125mM dNTP,4.375XHotstartBuffer (Takara),0.55 μ M引物体系I按比例混合后的正向引物，0.55 μ M引物体系I按比例混合后的反向引物，0.05υ/μ I Hotstart Taq (Takara), 0.125 μ g/ μ I BSA,5ng/ul 模板 DNA。
[0084]多重微卫星引物体系2对应的扩增体系包括:3.125mM dNTP,4.375XHotstartBuffer (Takara)，0.35 μ M引物体系2按比例混合后的正向引物，0.35 μ M引物体系2按比例混合后的反向引物，0.05υ/μ I Hotstart Taq (Takara), 0.125 μ g/ μ I BSA,5ng/ul 模板 DNA。
[0085]多重微卫星引物体系I引物组合和荧光标记如下:
[0086]LvMlF:6_FAM(羧基荧光素)_5，-GATGACCTGCCTTTCTCTGC-3，
[0087]LvMlR:5’ -GGGAGAGATGATGGGAAGAAG-3，
[0088]LvM2F:R0X (羧基 X 罗丹明)_5，-ATGGCACAAATAGGATCTTG-3 ’[0089]LvM2R:5’ -GACTGGAAGAGCACTGATTC-3’
[0090]LvM3F:HEX (六氯荧光素)~5，-ATACGAAACACCCCATCCC-3，
[0091 ]LvM3R: 5，-GTGGTCTTACCTCGTGGCTC-3，
[0092]LvM4F:TAMRA (羧基四甲基罗丹明)-5’ -AGCACCTAGCACTTGCTGAAC-3’
[0093]LvM4R:5， -AGAGACTCACATCCTCATCCTC-3，
[0094]LvM5F:6_FAM (羧基荧光素)~5，-CATTGAAAACGGAATCCTCG-3 ’
[0095]LvM5R:5’ -GATATTCCCATCAACACAGCG-3’
[0096]LvM6F:R0X (羧基 X 罗丹明)_5 ’ -CACCAAAACGAACGAAACG-3 ’
[0097]LvM6R:5，-GGATAAAAACGAATTGTATACCG-3，LvM7F:HEX (六氯荧光素)-5，-GAGAGCAAATAAGAAAGGGC-3，
[0098]LvM7R:5’ -AGGATGCAAATGATAACGAG-3’
[0099]LvM8F:TAMRA (羧基四甲基罗丹明)-5’ -GGCACACTGTTTAGTCCTCG-3’
[0100]LvM8R: 5，-CGAACAGAATGGCAGAGGAG-3，
[0101]LvM9F:6-FAM(羧基荧光素)-5，-CCCGACTTGGCTITTAGTTG-3，
[0102]LvM9R: 5，-GAGA TTGCTATCCTCGGCTG-3 ’
[0103]LvMlOF:R0X (羧基 X 罗丹明)-5’ -GATCCTGCGAGTCACTTTATCTC-3 ’
[0104]LvMlOR:5’ -TTTATTGCGTATCCCAGAAGC-3’
[0105]引物体系I中10对引物的引物摩尔比例为:
[0106]LvMl: LvM2: LvM3: LvM4: LvM5: LvM6: LvM7: LvM8: LvM9: LvMlO =1:2:1:2:1:4:4:2:1:4
[0107]多重微卫星引物体系2引物组合和荧光标记如下:
[0108]LvMl IF:6_FAM (羧基荧光素)~5，-CCGCCATCATCATCAACA-3 ’
[0109]LvMllR:5’ -TCATTCGGGTTCGAGACTC-3’
[0110]LvMl2F:R0X (羧基 X 罗丹明)_5’ -GATCATTCGCCCCTCTTTTT-3’
[0111]LvMl2R:5’ -ATCTACGGTTCGAGAGCAGA-3’
[0112]LvMl3F:HEX (六氯荧光素)_5’ -GGACTCACACTTCTGGTTC-3’
[0113]LvM13R:5’ -GGCTGCACCTTGTAAGTC-3’
[0114]LvM14F:TAMRA(羧基四甲基罗丹明)_5’ -TATGCTCGTTCCCTTTGCTT-3’
[0115]LvM14R: 5，-TTGAAGGAAAAGTGTTGGGG-3’
[0116]LvMl5F:6_FAM(羧基荧光素)_5’ -ACTAGTGGATCTGTCTATTCAT-3 ’
[0117]LvM15R:5’ -ATACCCACCCATGCATGTTA-3’
[0118]引物体系2中5对引物的引物摩尔比例为
[0119]LvMll: LvMl2: LvMl3: LvM14: LvMl5 =1:2:1:1:2
[0120]引物体系I采用55度退火进行扩增，引物体系2采用50度退火，两组的延伸温度均采用68度，扩增产物避光保存。
[0121]每个个体的上述扩增产物稀释20倍后与9.25μ I H1-Di甲酰胺(AppliedBiosystems)和 0.25 μ I Liz500Marker (Applied Biosystems)混合，95 度 5 分钟后置于冰上3分钟，之后使用ABI Prism3130xl测序仪对每个个体的两个体系的扩增结果进行分型(参考ABI PriSm3130xl使用手册)。由于每个扩增体系中的不同微卫星位点的片段大小可以通过不同颜色的荧光标记或片段大小区分，分型结果使用Gene Marker (vl.91)软件读取每个微卫星位点的基因型数据，部分结果如表1和表2所示。
[0122](三)亲子鉴定:
[0123]将15个微卫星位点的基因型数据转换成Cervus3.0格式,使用Cervus软件计算等位基因频率，Cervus对候选的父母本的基因型和所有子代个体的基因型进行分析，按照95%的置信区间最终找出亲本和子代的对应关系，从而实现亲子鉴定。Cervus模拟分析结果显示在双亲未知条件下累积排除率为97%，亲子分析表明对于所有子代的亲本鉴定准确率为98%。
[0124]综上所述，本方法建立了两个用于家系鉴定的多重微卫星鉴定体系，具体包括多重微卫星引物体系、PCR扩增体系和PCR扩增程序三个方面。利用这两个多重微卫星体系对9个家系进行亲子鉴定的结果表明9个家系的子代亲子鉴定的准确率为98%，因此本专利提供的用于进行凡纳滨对虾家系鉴定的多重微卫星扩增体系可以实现凡纳滨对虾家系快速高效地鉴定，为家系选育过 程中的系谱跟踪和家系混养奠定了良好的基础。
【权利要求】
1.进行凡纳滨对虾家系鉴定的多重微卫星鉴定体系，包括多重微卫星引物体系， 其特征在于:使用多态性高的LvMl-LvM15共15对微卫星引物构成两个多重微卫星引物体系， 所述的两个多重微卫星引物体系如下: O多重微卫星引物体系I的引物序列和荧光标记组合为: LvMlF:6-FAM (羧基荧光素)_5’ -GATGACCTGCCTTTCTCTGC-3 ’
LvMlR:5， -GGGAGAGATGATGGGAAGAAG-3，
LvM2F: ROX (羧基 X 罗丹明)-5 ’ -ATGGCACAAATAGGATCTTG-3 ’
LvM2R:5， -GACTGGAAGAGCACTGATTC-3， LvM3F:HEX (六氯荧光素)-5’ -ATACGAAACACCCCATCCC-3 ’
LvM3R:5， -GTGGTCTTACCTCGTGGCTC-3， LvM4F: TAMRA (羧基四甲基罗丹明)-5 ’ -AGCACCTAGCACTTGCTGAAC-3 ’
LvM4R:5， -AGAGACTCACATCCTCATCCTC-3， LvM5F:6-FAM (羧基 荧光素)_5’ -CATTGAAAACGGAATCCTCG-3 ’
LvM5R:5， -GATATTCCCATCAACACAGCG-3，
LvM6F: ROX (羧基 X 罗丹明)-5 ’ -CACCAAAACGAACGAAACG-3 ’ LvM6R:5> -GGATAAAAACGAATTGTATACCG-3J LvM7F:HEX( A 氯荧光素)-5，-GAGAGCAAATAAGAAAGGGC-3，
LvM7R: 5，-AGGATGCAAATGATAACGAG-3， LvM8F: TAMRA (羧基四甲基罗丹明)_5 ’ -GGCACACTGTTTAGTCCTCG-3 ’
LvM8R: 5，-CGAACAGAATGGCAGAGGAG-3， LvM9F:6-FAM (羧基荧光素)_5’ -CCCGACTTGGCTITTAGTTG-3 ’
LvM9R:5， -GAGATTGCTATCCTCGGCTG-3， LvMlOF: ROX (羧基 X 罗丹明)_5’ -GATCCTGCGAGTCACTTTATCTC-3’
LvMlOR:5’ -TTTATTGCGTATCCCAGAAGC-3’ 2)多重微卫星引物体系2的引物和荧光标记组合如下: LvMllF:6-FAM (羧基荧光素)_5’ -CCGCCATCATCATCAACA-3 ’
LvMllR:5’ -TCATTCGGGTTCGAGACTC-3’ LvMl2F:ROX (羧基 X 罗丹明)_5’ -GATCATTCGCCCCTCTTTTT-3’
LvMl2R:5 ’ -ATCTACGGTTCGAGAGCAGA-3， LvM13F:HEX (六氯荧光素)-5’ -GGACTCACACTTCTGGTTC-3 ’
LvM13R:5’ -GGCTGCACCTTGTAAGTC-3’ LvM14F:TAMRA(羧基四甲基罗丹明)_5’ -TATGCTCGTTCCCTTTGCTT-3’
LvM14R:5， -TTGAAGGAAAAGTGTTGGGG-3， LvM15F:6-FAM (羧基荧光素)_5’ -ACTAGTGGATCTGTCTATTCAT-3 ’
LvM15R:5’ -ATACCCACCCATGCATGTTA-3’。
2.按照权利要求1所述的多重微卫星鉴定体系，其特征在于: 多重微卫星鉴定体系包括三个部分，包括多重微卫星引物体系之外，还包括多重微卫星扩增体系和多重微卫星扩增温度，其特征在于:使用多态性高的LvMl-LvM15共15对微卫星引物构成两个多重微卫星引物体系，通过体系优化获得最佳的多重微卫星扩增体系和扩增温度，使用两个多重微卫星鉴定体系对凡纳滨对虾进行家系鉴定； 所述的多重微卫星扩增体系如下: 多重微卫星引物体系I对应的扩增体系包括:3.125mM dNTP，4.375 XHotstart Buffer(Takara) , 0.55 μ M引物体系I按比例混合后的正向引物，0.55 μ M引物体系I按比例混合后的反向引物，0.05U/ μ IHotstart Taq (Takara), 0.125 μ g/ μ I BSA, 5ng/ μ I 模板 DNA ；多重微卫星引物体系2对应的扩增体系包括:3.125mM dNTP，4.375 XHotstart Buffer(Takara) , 0.35 μ M引物体系2按比例混合后的正向引物，0.35 μ M引物体系2按比例混合后的反向引物，0.05U/ μ IHotstart Taq (Takara), 0.125 μ g/ μ I BSA, 5ng/ μ I 模板 DNA ；所述的多重微卫星扩增温度如下: 体系I的PCR扩增温度设置:94度变性4分钟；如下进行35个循环:94度变性30秒，55度退火30秒，68度延伸I分钟；68度延伸10分钟；4度保温； 体系2的PCR扩增温度设置如下:94度变性4分钟；如下进行35个循环:94度变性30秒，50度退火30秒，68度延伸I分钟；68度延伸10分钟；4度保温。
3.按照权利要求1或2所述的多重微卫星鉴定体系，其特征在于: 引物体系I中10对引物的引物摩尔比例为:
LvMl:LvM2:LvM3:LvM4:LvM5:LvM6:LvM7:LvM8:LvM9:LvMlO= (0.9-1.1): (1.8-2.2):(0.9-1.1): (1.8-2.2): (0.9-1.1): (3.8-4.2): (3.8-4.2): (1.8-2.2): (0.9-1.1):(3.8-4.2)； 引物体系2中5对引物的引物摩尔比 例为:
LvMll:LvM12:LvM13:LvM14:LvM15= (0.9-1.1): (1.8-2.2): (0.9-1.1): (0.9-1.1):(1.8-2.2)。
4.按照权利要求3所述的多重微卫星鉴定体系，其特征在于: 最优的引物体系I中10对引物的引物摩尔比例为:
LvMl:LvM2:LvM3:LvM4:LvM5:LvM6:LvM7:LvM8:LvM9:LvMlO=1: 2:1:2:1:4:4:2:1:4 ； 最优的体系2中5对引物的引物比例为
LvMll:LvM12:LvMl3:LvM14:LvM15=l: 2:1:1: 2。
5.一种权利要求1-4任一所述的多重微卫星鉴定体系，其特征在于:多重微卫星鉴定体系的使用方法如下:使用鉴定体系I和2分别对待鉴定的子代和候选亲本进行PCR扩增和微卫星分型，将分型获得的每个个体微卫星的片段长度大小导入Cervus软件进行家系鉴定分析，Cervus判定的父母本结果即为子代对应的父母本。
【文档编号】C12Q1/68GK103468796SQ201310340730
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年8月7日 优先权日:2013年8月7日
【发明者】于洋, 李富花, 张晓军, 相建海 申请人:中国科学院海洋研究所